以人乳头瘤病毒HPV病毒样颗粒VLP为基础的预防性疫苗研究

以人乳头瘤病毒HPV病毒样颗粒VLP为基础的预防性疫苗研究 1以人乳头瘤病毒(,,,)病毒样颗粒(,,,)为基础的预防性疫苗的研究博士学位论文,,,,,,,,,,,,,,,,,,,完成日期:指导教师:北京协和医学院基础学院肿瘤病毒疫苗中国医学科学院基础医学研究所业研究方向:病原生物学专谢喜秀许雪梅教授,,;;,,,,,,,,,,,;,,;,,,,,,,,,,;,,,,,,年,月姓所,, :,,,,,,,,,,,院号:名,,,,,,,,学:,,,,,,,,,,,学校代码:,,,,, 2目录第一部分层析法纯化获得的人乳头瘤病毒(,,,),,,,,,,,病毒样颗粒疫苗的实验研究…,,第二部分人乳头瘤病毒(,,,),,嵌合病毒样颗粒疫苗的初步研究………………………。,,学位论文版权使用授权 书…………………………………………………………………………(,,,独创性声 明…………………………………………………………………………………………(,,,个人简 历……………………………………………………………………………………………………………………………,,,参考文 献………………………………………………………………………………………………,,致 谢…………………………………………………………………………………………………………………………………((,,,，,、 结………(……………………………………………………………………………………………………………………………,„，实验结 果……………………………………………………………………………………………“实验方 法……………………………………………………………………………………………,,综述,,,感染机制及预防性疫苗免疫活性的评 价…………………………………………………,,讨 论…………………………………………………………(……………………………………………………………………((,,讨 论…………………………………………………………………………………………………………………………………,,,实验结 果……………………………………………………………………………………………(,,实, 验方 法……………………………………………………………………………………………,,实验材 料……………………………………………………………………………………………(,实验材 料……………………………………………………………………………………………。,,前 言……………………………………………………………………………………………………………………………………(,,摘 要…………………………………………………………………………………………… …………………………………………,缩略词英汉对照 ……………………………………………………………………………………。,北京协和医学院博士研究生学位论文,,,,,,; ,………………………………………………………………………………………………………………………………((, 3缩略词英汉对照表,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,;戊肝病毒,(羟乙基哌嗪乙磺酸辣根过氧化物酶艾滋病毒硫酸肝素多糖人乳头瘤病毒流式细胞分选酶联免疫吸附乙胎牛血清单纯胞疹病毒丙肝病毒乙肝病毒丙烯酰胺氨基酸无定形的羟基磷酸铝硫,,,,,,,酸盐千道尔顿嵌合病毒样颗粒宫颈上皮内增生半数有效剂量,, 二胺四乙酸过硫酸铵,,,,甲叉双丙烯酰胺基底膜牛血清白蛋白,，冲流动态光散射,一(,一,,,,,,,,,,,,)一,一,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,;,,,白喉破伤风百日咳,型单克隆抗体,, 感嗜血杆菌,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,;,,,;,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,;,,,,,,,,,,;,,,;,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,，,,,,,,,,,,,,,,,,,,,，,,,,,,,,,,,，,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,;,,;,,,;,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,;,,,,,,,,,;,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,;,,,,,,,,—,,,,;,,,,,,;,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,;,,,,;,,,,,,;,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,;,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,;,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,;,,,,,;,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,，,,,,,,,,,,,,,(,,,,,,;,,,,,，,,,,,,,,,,,,,,,,,;,,,,,北京协和医学院博士研究生学位论文, 4,,肠,,,,,,光密度透射电镜四甲基乙二胺”，,,,缓冲盐溶液,,,缓冲液十二烷基磺酸钠,,,,样受体聚偏二氟乙烯假病毒苯甲基磺酰氟多分散系数磷酸盐缓冲液聚丙烯酰胺凝胶电泳邻苯二胺三羟甲基氨基甲烷非必须氨基酸单磷酸脂质,,病毒样颗粒,,,,,;,,,,,,,,,,,,,,,(,,,,,,,,,,,,,),,,,,,,,,,,,, 一巯基乙醇,,,,,,,,,,,,,,,，,，,?，,?,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,;,,,;,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,;,,,,,,,,,,,,,,,,,;,,,,,,,,,—,,,,,,,,,;,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,;,,,,,,,,,,,,,,,,,,,;,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,;,,,;,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,?,,,,,,,,,,(,;,,,;,,,,;,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,，,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,北京协和医学院博士研究生学位论文, 5摘要依赖的中和抗体,,,(,,识别的表位，,,,,,,,保留了人群免疫优势的构象,,。,,，,,结果表明,,,中和抗体,,,(,,，,,,,(,识别的表位。以上结果表明在,,,中表达纯化的,,,诱发型别特异性中和抗体，仅可预防两种高危型病毒(,,,,,,,分别保留了构象依赖的,,是世界范围内的优势流行株，,,,白都组装成了与天然病毒类似的均一度很高的,,,,，直径范围分别为,,(,,病毒株。目前上市的以,,,主要蛋白,,为基础的病毒样颗粒(,,,)疫苗，主要,,,,均一度及免疫原性的区别。在此基础上，表达及纯化了以,,,,(层析法纯化获得的人乳头瘤病毒(,,,),,,,,,,,病毒样颗粒疫苗的实验研究变，对其他型别没有交叉保护作用或交叉保护作用弱。目前缺乏,,,保守表位，获得的嵌合病毒样颗粒(;,,,)疫苗可望扩展现有,,,疫苗的保护叮郑蹋校蟮拇慷取?翁 Ъ氨砦惶卣鞯姆治龊涂固寤钚约靶 粒桑ǎ希龋 匙艏恋南喙匮芯浚 ?冉狭顺 敕ㄓ氩阄龇ù炕 龋校郑保叮 保福?腥炯跋喙夭”狙芯吭诟俗床《纠コ嫦赴 斜泶锎炕 耍龋校治А, 送乜硐钟幸呙绲谋;し段В 狙芯康谝徊糠纸 泻 龋校郑蹋钡熬 樱模樱 校粒牵趴悸硭沽晾度旧 ?牛蹋桑樱良埃祝澹螅 治鼋峁 砻鳎 阄龇ɑ竦玫模龋校钟辗?泻涂固寤钚缘囊簦澹颍钏拗鞑辛舻鞍祝? 蛩亟 辛搜芯俊,咛褰峁 缦拢海蹋脖,乇砦坏脑雍系鞍祝 ?杂跋煸雍希蹋弊樽澳芰 捌洌猓欤铮簦ê罅街址椒ǚ治觯樱妫梗郑蹋校螅 愿餍停郑蹋校蟠慷确直鸷希蹋脖砦灰呙绲难芯俊,郑蹋校笪 靥宓那叮郑蹋校蟠慷群芨撸 翁 峁褂胩烊徊《纠嗨疲 欢雀摺,担感偷模龋校治 梗梗 担ィ 梗罚 福ィ 梗福 矗ァ, 干涞缇岛投 馍?浞治觯 龋校郑郑蹋校笥辗?て谥校模孟赴 遥郑蹋斜砻娴谋砦皇歉叨裙媛尚灾馗磁帕械模 虼嗽冢郑蹋斜砻嬲故荆蹋玻郑蹋校罂芍苯踊罨 嬖诒,亟徊嬷泻涂固灞砦唬 涿庖咴 院苋酢,捎冢龋校郑郑蹋校蟮囊呙缥适馈,我 鞍祝蹋灿辗?て谥泻涂固宓谋ǖ溃 疑形醇 龋校郑郑蹋校蠼 辛舜慷取?翁 Ъ懊庖咴 缘难芯浚 乇鹗牵龋校衷靥宓那逗细髦郑龋校郑郑蹋校笪 保叮 保福 担富旌闲停郑蹋幸呙绲难芯浚 诙 糠纸 辛艘裕龋校郑担甘嵌 堑厍 ?忻篮湍厦赖厍 攀屏餍械母腥臼且 ? 卑?闹饕 颉,壳凹 ǖ母呶,停龋校钟校保敌停 渲校龋校质澜绶段 冢 卑?歉九 诙 叻?琢觥,中 愿呶,腿乳头瘤病毒(,,,),,，,,，,,(,,,,，,,,,(,,,,,,,，,,，,,,(,,,,,,,,,,,,,，北京协和医学院博士研究生学位论文, 6,(,层析法与超离法获得,,,,(人乳头瘤病毒(,,,),,嵌合病毒样颗粒疫苗的初步研究可能存在聚集。将超离法和层析法获得的,,,明，层析法获得的,,,,,,,免疫小鼠测定,,,,，结果表明仅需分别免疫,(,,,,,,,,诱发的中和抗体比超离法的高，提示层析法纯以,,,,,基因为模板，利用,,,,,,,,,(,,重组杆状病毒转移载体的构建与表达鉴定,,,扩增获得在,,,,,,,诱发的中和抗体滴度越高。,端(,,(,,,,,,,)插入单表位的,,,(,,(,,,,,,,)或,,在一定范围内，佐剂剂量越高，,,,,,,(,,(,,(,,)，分高。以上结果表明，,，(, ,),佐剂可增强,,,,,中和抗体的滴度随着,，(,,),佐剂剂量的增加增协同免疫小鼠，结果表明,,,,,,,与不同剂量的,，(,,),佐剂(抗原:佐剂为,:,到,:,,,,),,,,的免疫原性。,,,,免疫原性。但是不能显著增强,,,,,,疫苗的诱发中和抗体的水平，明，仅在低剂量组，协同,,(,,),佐剂能显著增强单价和三价疫苗中,,,制单价和三价疫苗，单独或协同,，(,,),佐剂免疫小鼠。血清中和抗体分析结果表,，,)配,,,,，分别采用低剂量(,(,斗,)或高剂量(,取,,,,,,疫苗活性的影响分析,，(,,),佐剂及其剂量对,,,时，低剂量(,(,很强。,,,,免疫原性高滴度(,,,以上)的中和抗体。以上结果表明,,,,,,,在单价组和三价组均诱发了长达,,周的,,,)的,,,,,,,免疫原性及,,,针对组成型别的中和抗体，且单价组与三价组诱发的中和抗体没有统计学差异。同,,,,单独或混合免疫小鼠诱发了较高滴度的的小鼠阳转。将,,,,,,,就能使,,,,,,,在水溶液中为单一的峰，而,,,,超离法获得的,,,,为一个或多个峰。且超离法获得的,,,,,的,,,径比层析法的大，表明层析法获得的,,,,，,的,,,,,,,水力学直,,,,比较均一，超离法获得的,,,,析,,,,诱发长期中和抗体的分经动态光散射分析，层析法获得的,,,,,,,的比较,,,,分别免疫小鼠，结果表,,,,具有很好的免疫原性。化获得的,,,,,,,，,(,,,,,,,,(,,,,,，,,,,,,,,,,,,,,,,，,(,,,,,,,,(,,,，,,，,,,(,,,,,北京协和医学院博士研究生学位论文 7混合体。以本实验室制备的,,,总之，本研究利用杆状病毒昆虫细胞表达系统，层析法纯化获得了纯度高、形,,,,,，,,,,,，,,,,,,，,,,,,,，,,,,,,诱发的骨架型别特异性的,,,关键,酉,,(人乳头瘤病毒;抗体滴度依次为,(,,,,,，,(,×,,,，,(,×,,,，,(,,,,,，,,,,,，,,,。可以看出,,,,,，,,中和抗体滴度比,,,,,,，,,,,,,的高，表明在,,用杆状病毒昆虫细胞表达体系，在,,,细胞中表达,,,态结构与天然病毒类似、免疫原性强的,,,,,特异性中和抗体。本,,,兔多抗为一抗做,,,,,,,,不同表,,的多价,,,疫苗的研发奠定基础。有关,,,,，(,,),研究结果为含,,,,,,,在单价和三价疫苗中均可诱发持久高滴度的,,,,,,,;低剂量,,,面区容纳,,保守中和抗体表位的能力及其诱发中和抗体活性的研究将有利于广谱均比在,,,端插入,,还是,,,，;,,,,的研究。,,,,和病毒样颗粒;,,,,,诱发的,,,预防性疫苗;,,中和更耐受外源表位的插入。,,(,,蛋白协同弗氏佐剂免疫小鼠，检测结果表明，,,,将,,,,,中和抗体的分析,端比,,,,,,,,，,,,,,，,,,,,的纯度达到,,,以上，,,,,,,纯度为,,,(,,,。,,,,，结果提示，,,,,插入相同的位点诱发的中和抗体滴度高。表明,,,端插入,,比插入,,,对骨架的影响小。无论在,,,,,,,，,,,,,,为,,,,和,,聚集物的混合体，,,,,,,为五聚体和,,聚集物的电镜分析结果表明,,,,,组装成了,,,,且形态较。,,,,,,为五聚体，,,一,,杂合蛋白纯品的鉴定层析法进行了纯化。,,(,,杂合蛋白，并用,,(,,杂合蛋白诱发,,,,,一,,杂合基因装载到,,,,,,,;,载体，利位的为,,,,, ,。将测序正确的,,,,,(,,(,,与,,(,,(,,串联双表,,,,插入,,,的为,,,,,,，,,,,,,，在,,,,(,,,,,(,,)别命名为,,,,,，,,,,,，同理在这两个位置插入两个拷贝的,,,,(,,,,,，,,，,,,,,,,,,,,,，,,,,,,(,,,,,北京协和医学院博士研究生学位论文, 8,,,,,,;,,,,,,,,,,,;,,,(;,,,,),,,,,(,,,,,),,,,,,,,,,,,,,,,(,,,),,,,,,,,,,,,,,，(,,),,,,,,,,,,,,,,,,,,,(,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,;,,,(,,,,)(,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,;,,,,,,,;,,,,,;,,,,,,,,,(,,,,,,,,，,,,,,;,;,,,,;,,;,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,;;,,,,(,,,,,,,,,,,(,,(,,,,,,,,,,,,,,,,,,,((,,,,,,,,,;,,,,,,,,,,,,,,,,,,;,,,,,,,;,,,,(,,,,,,,,,,,,,,,,,,,;,,,,,,,,;,,,,,,,,,,,,,,(,,,,,,,,,,(,,,,,,,,，,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,(,,,,,,,,„,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,;,,,,,，,,,,,,,,,,(,,;,,,,—,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,;,,,,,，,,,,,,,,,,,,,,,,，,,,,,,,,,,,,;,,,,,,,,,,,,,,,,,;,,,,,,,,,,,,,,,,,,;,,,,,,;,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,;,,,,,,,,,,,,,,,,，,,,,,,,,,,,,,,;,,,,;,,,,,,,;,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,;,,,,,,,,,,,,,;,,,,,,,,，,,,,,,,,,,,,,,,,，,,,,,,，,,,;;,,,,(,,,,,;,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,;,,,,,,,,，,,,;,,,,(,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,;,,,,,,;,,,,,;,，,,,,,,,,,，,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,;,,;,,,,。,,;,,,，,,,,,,,,,,,,;,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,;,,,,,,,,,;,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,(,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,，,,,,,,,;,,,,。,,,,,,,,,,,,,,,,,,,;;,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,(,,,,,,,,,;,,,,—,,,,,;,,,,,,,,,,,,,,,，,,,,,;,,,,,,,;;,,,,,,,,,,,;,,,,,, ,,,;,,,,(,,,,,,,,;,,;,,,,,,,,,;,,,,,,,,,,,,,,,,,;,,,,,,,,;,,,,,,,;,,,,;,,,,,,,,,,,,,,;,,;,,,,(,,, ,,,,;,,,,,,,,,,,,,,,(,,,,,,,,,,,,,,，; ,,,,，,,,,,,,,;,,,,,,,,,,;,(,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,;,,北京协和医学院博士研究生学位论文,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,(,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,;,,,,,,,,,;,,,,,,,,,,,,,(,,,,,,,,,;,,,,,,,,,,,,;,,;,,(,,,,,;,,,,;,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,(，,,,;,,,,,,,,;,,,,,,,,,,,,,,,;,,;,,,,,, 9,,,,,,,,,,,,,,,,,,;,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,;,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,;;,,,,仔，,,(,,)(,,,,,,,,,,,,,,,,(,)(,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,;,,,;,,,(,,,),,,,,,,,,,,(,,,,,,,,,,,,,,,(,,,,,,,,,(,,,);,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,;,,,,,(,,,),,,,,,，,,,,,,,，;,,,,,,,,,,,,,，,,,,,,,,,;,,,,,,,,,,,,,;,,,,,,,,,,,,,;(,,,,,,,,,,,,;,,,,;,,,,,,,;,,,,,,,,,,;,,,;,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,;,，,,,,,,,—,,,,,;,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,;,,,,;,,;,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,;,,,,,，,,,,,,,;,,,,,,,,;,;,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,;,,,,,,,;;,,,,,,,,,,,,,,,,,,;;,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,，,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,，,,,,,;,,,,,,(,,,,，,,,,(,，,(,,,,(,,(,,，,(,,,,,,,,,,,,,,(,,,,,;,,,,,,,,,,;,,;,,,,,,,,,,,,—,,,,,,,,,,，,,,,,,,,(,,,,,,,,,,,,,,,,,;,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, ,,,，,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,;,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,，;,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,;,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,;,,,,(,,,,,(;,,,,;,,,,,,,(,,,;,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,，,,,,,;,,,,,,(,,,,，,,,,,北京协和医学院博士研究生学位论文,(,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,(,,,，,,,(,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,;,,,;,,,,,,,，,,，,,,,,，，,,,,,;,,,,,,(,,,,,，,,,,,,,,，,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,,,;,,,,,,,,,,,,,,(,,,,,,,,,,,,,,,,,,，,,,,,;,,,,,,,,,,,,,,,,;,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,，,,,,,;,,,,,,,,,,,,,,;,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,，,,，,,;,,,,;,,,,,,,;,,,,,,,,,,,,,,,,,,,，,,,,,,,,,,，,,,,,,,,,,,,,,,,—,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,(,,,，,，,,,,,,，,,,,,,,,,,,,;,,,,,,,,,,,,,, 10,,,,,,;,,,,,,,,,,,,, ,;,,,(,,,,,),,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,(,,,,,,,,,,,,,，(,,),，,,,,,,,,,,,,,,,,,,,(,,,,,,,(,,,,,,,,,,(,,(,,,,,,,)，,,,,,;,,,,,,(,,(,,,,,,,),,,,(,,—,,(,,),,,,,,,,,,,,(,,,,,(,,),,,,;,,,,,,,,,,(,,),,,,,,,,,,,,，(,,),,,,,,,，,，(,,),,,,,,,,,,,,,,,,;,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,;;,,,,,,,,,,,,，,,,,;,,,,,,,,,,,,,;,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,(,,,,,,,,,,,(,,,,, ,,,,,,;,,,,,,,,,,(,,,,,,,;,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,，,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,，,,,,,,,,,,，,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,一,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,(,,,,,,,,(,,,,,,(,,,,,,,;,,,,,,;,,,,,;,,,,,,,,;,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,;;,,,,,,,？,澹睿悖椋睿纾模危粒觯澹颍椋妫椋澹洌鳎瑁椋悖瑁模牛 螅牛 龋矗 螅牛 模牛 洌洌牛 龋矗 洌洌牛 模牛 螅洌牛 颍澹螅穑澹悖簦椋觯澹欤 裕瑁澹螅澹纾澹睿澹螅蹋保 蹋玻簦瑁澹螅澹悖幔欤欤澹洌鳎澹龋矗欤铮铮穑模牛蹋保蹋玻保叮幔幔 保贰 常叮悖铮穑椋澹螅簦鳎铮椋睿螅澹颍簦澹洌校茫遥 鳎澹铮觯澹颍欤幔穑眨螅椋睿纾睿澹酰簦颍幔欤椋 椋睿纾簦颍幔睿螅妫澹颍猓幔悖酰欤铮觯椋颍酰螅椋洌澹睿簦椋妫椋茫幔簦椋铮睿玻 保觯幔悖悖椋睿澹穑幔颍簦椋悖欤澹觯椋颍酰螅 欤椋耄澹悖蹋校螅 簦瑁澹穑幔穑椋欤欤铮恚幔觯椋颍酰螅瑁酰恚幔睿螅簦酰洌 玻 裕瑁澹幔恚铮酰睿簦 椋睿悖颍澹幔螅椋睿纾幔恚铮酰睿簦洌椋妫妫澹颍澹睿簦郑蹋校螅洌铮螅澹 颍澹螅穑铮睿螅澹幔睿簦椋猓铮洌椋澹螅 裕铮幔睿簦椋 龋校郑椋睿悖颍澹幔螅澹洌椋洌睢 簦觯幔悖悖椋睿澹螅 鳎瑁椋欤澹幔睿簦椋猓铮洌椋澹螅椋睿悖颍澹幔螅澹洌螅椋纾睿椋妫椋悖幔睿簦欤 铮睿欤 恚椋悖澹 簦瑁澹鳎椋簦瑁铮酰簦鳎椋簦瑁觯幔悖悖椋睿澹螅担福 簦颍椋觯幔欤澹睿簦鳎澹澹耄螅 裕瑁澹螅澹洌铮螅澹螅欤铮鳎椋恚恚酰睿椋 澹洌簦瑁澹椋睿觯澹螅簦椋纾幔簦澹裕铮保蹋校螅 澹妫妫澹悖簦保 矗颍澹螅穑铮睿螅澹螅 本? 鸵窖г翰?垦芯可 宦畚模澹妫妫澹悖簦椋觯澹澹欤椋悖椋簦瑁椋纾瑁瑁椋纾瑁欤 铮妫悖瑁颍铮恚幔簦铮纾颍幔穑瑁 猓 穑酰颍椋妫椋澹洌郑 幔睿簦椤 龋校郑蹋 恚铮睿铮福 担叮蹋校螅 鳎澹龋校郑簦瑁幔簦椋睿洌椋悖幔簦澹洌颍澹螅酰欤簦螅簦颍椋觯幔欤澹睿簦矗福欤澹幔螅簦椋睿妫澹,,,,(,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,，,,,,,,,,,,,,,,,,,—,,,,,,,,,,,,,, 一,, ,,,;,,,,,,,,,,,,,,, 北京协和医学院博士研究生学位论文, ,,(,,,(,(, ，,,,,,,,,,;,,, ,,,,,,,, ,,,,, ,, ,,,,, ,,,,,,,, ,, ,,,;,,,,,,, ,,,,,,,,, ,,,, ,,, , , , ,一,, ,,,,,,,, ,, ,,, , , , , ,,,,(;,,,,,,, ,,,,,),,,, ,,,,,,?, ,,,,,,,, ,, ,,,,,; ,,;,(,,, ,,,,,,, ,,,,,, ,,, ,, ,,,,,,，,,,,,，,,,,,，,, ,,,,,,,, , , ,,,,，,,,,,,，,,,,,, ,,,,;,, ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, ,, ,(,,,,,，,(,,,,,，,(,×,,,，,(,,,,,，,×,,,，,,, ,,,,,;,,,,,,(,,,,,,,,,;,, ,,, ,,,,,,, ,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,, ,, ,,,,,,,,, ,,, , , ,,,,,,,, ,,,,,,,,, ,,,, ,,,, ;,,, ,,,, ,,,,,,, ,,,, ,,, ,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,, ,,,,;,, ,, ,,, , , , , ,,,,(,,,, ,, ,,,,, ,,, ,, ,,,, ,, ,,,, ,,,,,,,,, ,,, ,,,,,,,,, ,, ,, ,,,, ,,,(，,,,,,,,,,,,,,,,(,, ,, ,,,),, ,, ,,,,, ,,,,;,, ,,,,,, ,,,,,,,,,, ,,,, ,,,,, ,, ,, ,,,,( ,,,,, ,,,,,,,,，,, ,,,,,,,, ,,,,,, ,,,,，,,,,,,, ,,, ,,,,,;,,,,;,,,,,,, ,,, , ,，, ,(,, ,, ,,,, ,,,, ,,, ;,,,,(,,,(,,,,,, ,,,,,,,,,,,, ,,,, ,,, ,, ,, ,,,, ,,,,,,, ;,(,,,,,,,,,,,,, ,,,, ,,, , , ,,, ,,, , , , , ,,,, ,, ,,,,,;,,,, ,, ,,,,;, ,,,,,,,,,, ,, ,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,, ,, ,,;,(,,, ,,,,,,, ,,,,,,, ,,,, ,,, ,,,,,,,,,,,,,,,,; ,,, ,,，, ,，,, ,, ,,,, ,,, ,,,, ;,,,,,,,,, ,,, ,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,;;,,, ,,,,,,, ,,, , ,，, ,，,, ,,,,;,,,,,(,,, ,,,,,,,,,,,,, ,,,,, ,,,,,,,,, ,,,, ,,, ,,,,,,,,,,,, ,,,,,,, ,, ,,, ,,,,,,,, ,, ,,,,,,, ,,,, ,,,,, ,,,,,,, ,,, ,,, ,,,,,,,, ,,,,,,,;,,, ,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,, ,,,, ,,, ,,,,,,,,,, ,,, ,,,,,,, ,,,,,,;, ,, ,,, ;,,,,,,,;, ,,, ,,,,,,, ,,,, ,,,,, ,,,,,;,,,, ,,,, ,,, ,,;,,,,, ,,, ,,, ,,;;,,,,( ,,, ,,,,,:,,,,, ,,,,,,,,,,,,,,;,,,,,,,,,, ,,,,,;,,,;,,,,,,,,;,,; ,,;;,,,;,,,,,,,, ,, 北京协和医学院博士研究生学位论文 前言 世界范围内，宫颈癌是妇女第二高发肿瘤，在,,,,年新发病例约,,(,,万，死亡约,,(,,万〔,〕，其中,,,发生在发展中国家〔,〕;据不完全统计，我国现有宫颈癌病人约,,(,万，在,,,,年新发约,(,万，死亡约,万【,〕。持续性高危型人乳头瘤病毒(,,,)感染是宫颈癌的主要诱因。目前己鉴定,,种高危型,,,，如,,, ,,，,,，,,，,,，,,，,,，,,，,,等。,,, ,,，,,是全球范围优势流行病毒株，在宫颈癌标本的的检出率分别为,,(,,及,,(,,，其次为,,, ,,(,(,,)及,,(,(,,)等，,,, ,,的检出率为,(,,，仅位于第七位〔,】。,,, ,,，,,在中国宫颈癌组织中检出率分别为,,(,,和,,,，位居前两位，其次为,,, ,,，检出率高达,(,,〔,】。,,,,,在亚洲宫颈癌前病变组织中的检出率位居第二〔,】，在中美及南美宫颈宫颈内皮增生,级(,，, ,)标本中的检出率分别高达,,(,,和,(,,，位居第二〔,】，在墨西哥宫颈癌病变标本中的检出率大于或等于,,, ,,〔,〕。因此在中国及其他,,, ,,感染高发区,,, ,,感染相关的疾病的危害严重。研究发现体外表达的,,,主要外壳蛋白,,可组装成病毒样颗粒(,,,,)，,,,,的形态学特征及免疫原性与天然病毒的相似〔,，,〕。因此基于,,, ,, ,,,,的疫苗已经在国外上市，分别是,,,利用杆状病毒表达体系在,,,中生产的,,, ,,,,,两价疫苗,,,,,,及,,,,公司利用酵母表达体系在酿酒酵母中生产的,,, , ,,, ,,,,, ,四价疫苗,,,,,,,,，两种疫苗诱发的保护反应主要是型别特异性的，仅在亲缘关系较近的,,, ,,及,,发现有四年期的部分交叉保护活性〔,,，,,〕。由于上市疫苗仅可预防,,, ,,，,,感染相关的约,,,的宫颈癌，因此接种现有疫苗并不能替代宫颈癌的筛查。国外正在研究包含九种高危型,,, ,, ,,,,的混合型疫苗，由于,,,疫苗生产成本高，继续在现有疫苗中增加感染率较低的型别，将会导致单位预防效率成本的急剧升高，这样在宫颈癌高发的经济落后地区应用就更不现实。因此研制含,,, ,, ,, ,,,,的疫苗及广谱,,,预防性疫苗意义重大。 ,,,是无包膜的双链,、,,,病毒，直径约为,, ,,,。核心为单拷贝的基因组,,,，外壳由,,和次要外壳蛋白(,,)组成，,，,,蛋白分子聚合形成五聚体，又称子粒。病毒外壳共有,,个子粒，以,,,的正二十面体方式排列。结构分析表明，病毒表面为,,蛋白超变区，呈袢状(,,,,)形式存在;内部为,,蛋白的保守区域，呈,折叠卷及,螺旋样(,,,,)【)结构存在。从图,可以看出，,,蛋白共有,个,折叠卷(,、,、,、,和,、，、,、,)，超变区主要位于折叠卷之间，形成各种,,,,，如,，、,,、,,、,,和,, ,,,,等;此外还有,个,;螺旋(,，、,,、,,、,,、,,)及其两侧的袢状区。,,相邻的,端序列也外展到病毒的表面〔,,，,,〕。病毒或,, ,,,,的外展区存在构象依赖的中和抗体表位，可诱发高滴 度的型别特异性的中和抗体，如,,, ,, 北京协和医学院博士研究生学位论文的特异优势中和单抗,,识别的构象表位即位于,,及,， ,,,,,,,,〔,,〕。研究发现,,蛋白在病毒组装及感染时都起着必不可少的作用，,,介导了病毒与基底膜(,,)上硫酸肝素多糖(,,,,,)结合、与细胞表面第二受体的结合及可能与细胞内的迁移有关等〔,,〕。 (捆》图,(,,单体的结构示意图〔,,〕 ,,蛋白是多功能蛋白，能够辅助病毒组装、外壳稳定、基因组,,,的包装，介导病毒核酸在细胞内体中的逃逸〔,,—,,〕。但,,蛋白含量较少，在病毒外壳的拷贝数最多为,,个〔,,,，且呈半隐蔽状态，在天然病毒及,,,,, ,,,,状态中没有免疫活。研究发现,,蛋白免疫产生的中和抗体常具有交叉中和活性及免疫保护作用，为新型,,,预防性疫苗的研究提供了新的方向。,,免疫诱发产生的交叉保护反应虽较,,,,,,的广，但其中和抗体的滴度远,,,, ,,,,的低，交叉中和其他,,,型别的滴度就更不理想〔,,—,,〕。目前对,,,,, ,, ,端的保守中和抗体表位有了明确的定位，如,,(, ,—, ,,、,,(,,—, ,、,,(,,—,,及,,—,,、,,(, , ,(,,—,, ,等〔,,—, , ,，其中诱发抗体交叉中和范围较为广的保守表位为,,(,,(,,及,,(,,(,,。如将改造,,,,配体及,,表位与,,(,,—,,偶联后获得的支状结构的脂肽疫苗，其免疫兔血清可中和多种病毒，中和滴度由高至低针对的病毒依次为,,, ,,，,,，,,,,,,,,, ,，,,，,,,(诱发皮肤疣)及,,〔,,〕，因此,,(,,(,,是目前公认的主要免疫表位。但表位免疫原性很低，因此选择高免疫原性的载体，合理利用不同的,,中和抗体表位，使其在载体表面正确展示表达呈递，进而可望有效的活化,细胞，产生高滴度的广谱中和抗体。 北京协和医学院博士研究生学位论文 以,,,为载体，在其表面嵌合表达中和抗体表位，具有外展性好，表位重复次数高、表位密度大且呈高度组织排列等特点，因此,,,是呈递,,中和抗体表位，使其变为免疫优势表位的理想载体。研究发现将,，, ,的广谱中和抗体,,,识别表位嵌合在,,,及牛乳头瘤病毒,,,的表面区获得的嵌合病毒样颗粒(;,,,,,,; ,,,,,(,,,,,,,,,;,,,，;,,,,)，可诱发产生高滴度的表位结合抗体〔,,(,,】。此外将,,保守表位,,(,,,(,,,、,,(,,(,,、,,(,,(,,分别嵌合在,,, ,, ,, ,,,,表面的获得的;,,,,也均可显著提高,,表位诱导产生交叉中和抗体的滴度〔,,(,,〕。表明外源表位在,,的表面嵌合表达后可被正确呈递。为了更好的保留载体,,,诱发的型别特异性的免疫保护反应，表位插入位置应选择合适的位点，避开载体型别特异性中和抗体依赖的区域，特别是,,优势表位抗体的结合区，减弱插入表位对载体型别特异性中和抗体表位的影响，达到兼顾保留载体,,,的型别特异性中和抗体表位及正确呈递插入表位的能力。研究表明,,, ,, ,,的,,(,,,,,,,(,,袢状区)位点及,,, , ,,的同源位点及插入,,(,,(,,表位后，不影,,,,,蛋白组装成;,,,，也不影响载体型别特异性中和抗体的产生〔,,】。另外在,,, ,, ,, ,,(,,,,,,,(,, ,端袢状区)插入,,, ,, ,, ,,(,,(,,表位形成;,,,,也不影响诱发载体型别特异性中和抗体的产生，同时显著提高插入表位诱导产生的交叉中和抗体滴度〔,,〕。表明,,, ,, ,,存在两个适于,,保 守表位的插入区:,,(, ,,,, ,,及,,(,,,,,,,。 铝盐用做免疫佐剂已经有,,余年的历史，也是世界范围内使用最广泛的人用疫苗佐剂，现在已经应用于很多疫苗中。虽然数以万计的人注射过含有铝盐佐剂的疫苗，但是很少有严重的局部反应，而且铝佐剂生产成本低，容易合成，因此在人用疫苗中比其他的佐剂更有优势〔,,〕。铝盐通常形式为氢氧化铝(,，(,,),)、磷酸铝(,,,,,)、明矾(,,，(,,,),”,,,,,)【,,】。研究发现在某些疫苗中氢氧化铝比磷酸铝佐剂佐剂效果更好〔,,〕。由于铝佐剂诱发的主要是,,,反应〔,,，,,〕，因此适合于由抗体介导的免疫保护反应的疫苗。,,, ,,,疫苗诱发的保护反应主要是由中和抗体介导的。因此本研究选用,，(,,),作为我们的佐剂。铝佐剂在人用疫苗含量通常为,(, ,,,齐,量，在洛沙平的白喉破伤风百日咳,型流感嗜血杆菌联合疫苗(,,,(,,,)中用量最高为,(,, ,,,齐,,量〔,,】。,,,推荐最高不超过,(,, ,,,齐,,量〔,,】，美国食品药品监督管理局推荐的最高剂量是,(,, ,,(,(,, ,,,齐,,量〔,,】。,,,,,,,,和,,,,,,,使用的佐剂分别为无定型的羟基磷酸铝硫酸盐佐剂(,,,,，,,, ,,，一种新型的铝佐剂)和,,,,佐剂(,,, ,,, ,，(,,),和,, ,(, ,,,的复合物)〔,,，,,】。,,,,等研肯允驹诮湍副泶锏模龋校?,,,,,,,,, ,四价疫苗中添加,,,,佐剂可以显著增加恒河猴内疫苗组成型别的 ,,,,结合滴度和中和抗体滴度(;,,,,,,,,,,,,,,,, ,, ,,,, ，,,,,,,,,,,方法检测)〔,,〕。,,,,,,,,等研究表明添加,,,,佐剂比添加,，(,,),更能有效增加昆虫细胞表达的,,, ,,，,,的中和抗体滴度〔,,】。但有关铝 北京协和医学院博士研究生学位论文佐剂剂量与,,, ,, ,,,,诱发中和抗体滴度之间的关系还还不明确。 本研究在杆状病毒昆虫细胞中表达纯化了,,, ,,，,,，,, ,, ,,,,，进行了纯度、形态学及免疫原性的研究，特别是,,, ,, ,, ,,,,诱发长期中和抗体活性及协同,，(,,),佐剂的相关研究，并比较了超离法与层析法纯化,,, ,, ,,,,均一度及免疫原性的区别。在此基础上，表达及纯化了以,,, ,, ,, ,,,,为载体的嵌合,,, ,, ,,保守中和抗体表位,,(,,(,,及,,(,,(,,的融合蛋白疫苗，对嵌合位点及嵌合表位的长度及其诱发中和抗体的能力进行了研究。 第一部分层析法纯化获得的人乳头瘤病毒(,,,),,,,,,,,病毒 样颗粒疫苗的实验研究 北京协和医学院博士研究生学位论文 实验材料,(质粒 ,,, ,,，,,，,, ,,重组,,;,,,:分别含有截短的,,, ,,，,,，,, ,,基因，由本室张婷博士构建〔, ,〕。 ,,,,,,,,:含绿色荧光蛋白(,,,)基因的基因质粒(图,(,)，由本室保存。用于,,,假病毒的制备。 ,, ,,,,,,:由德国癌症研究中一,〕，(,,,,,;,,, ,,,,,,,,,;,,,,,,,,,,,,),,,,,,,,,,,,教授惠赠。内含按照哺乳动物密码子偏性优化的,,, ,, ,,及,,基因，用于,,, ,,假病毒的制备。 ,,,,,,,,、,,,,,,,,:由美国国立卫生研究院肿瘤研究所(,,,,,,,, ,,,;,,，,,,,,,,,),,,, ,(,;,,,,,,教授惠赠。内含按照哺乳动物密码子偏性优化的,,, , ,或,, ,,及,,基 因，用于,,, ,,或,,假病毒的制备。 ,,,,,,,,:由日本国立传染病研究所(,,,,,,,, ，,,,,,,,, ,, ，,,,;,,,,, ,,,,,,,,),,,,,,,, ,,,,,教授惠赠。内含按照哺乳动物密码子偏性优化的,,, ,, ,,及,,基因，用于,,, ,,假病毒的制备。 辩 ,,,, ， ,柏，?, 灌酗, 孑,,,纂,,,淤‰ ?炬,,?, 暴觥，枞,端熬篇:署 ...