不同逆灌液对心肌细胞膜功能及细胞内钙影响的实验研究

不同逆灌液对心肌细胞膜功能及细胞内钙影响的实验研究 不同逆灌液对心肌细胞膜功能及细胞内钙 影响的实验研究 重庆医学2005年11月第34卷第11期 ? 论着? 不同逆灌液对心肌细胞膜功能及细胞内钙影响的实验研究 李福平,肖颖彬 (第三军医大学新桥医院心血管外科,重庆400037) 1655 摘要:目的探讨离体兔心经冠状静脉窦逆灌心脏停跳与不停跳对心肌细胞膜脂流动性及其功能的影响.方法健康成 年家兔24只,体重3.O,3.5kg,随机分为3组:A组(对照组),B组(常温氧合血逆灌心脏不停跳),C组(温血心脏麻痹液持续逆 灌),离体兔心顺灌左心做功20min,持续逆灌60min,左心做功60min.比较逆灌后各组心肌细胞膜丙二醛(MDA)含量,心肌细胞 膜ATP酶活性,心肌细胞膜脂流动性,心肌细胞内钙离子浓度的变化.结果B,C两组心肌细胞膜ATP酶活性和心肌细胞膜脂 流动性均较逆灌前低(P<O.05),心肌细胞膜MDA含量和心肌细胞内钙离子浓度较逆灌前高(P<0.01).逆灌后,B组心肌细胞 膜ATP酶活性和心肌细胞膜脂流动性优于C组(P<O.01),B组心肌细胞膜MDA含量和心肌细胞内钙离子浓度明显较C组高 (P<O.O1).结论常温氧合血逆灌心脏不停跳在减轻心肌细胞膜自由基损伤,维持膜脂流动性和膜ATP酶功能,减轻细胞内 钙超载方面优于温血心脏麻痹液逆灌停搏. 关键词:逆灌;心肌细胞膜;功能;细胞内钙 中国分类号:R365.54文献标识码:A文章编号:1671—8348(2005)11-1655—02 Experimentalstudyonmyocardialcellularmembraneinjuryafterretrogradecoronarysinus perfusion LIFu—ping,XIAOYing—bin (DepartmentofCardiovascularSurgery,XingqiaoHospital,theThirdMilitary MedicalUniversity,Chongqing400037,China) Abstract:objectiveTostudythemechanismofmyocardialcellsmembranedamagefollowingretrogradesinuscoronaryperfu— sion.MethodsTwenty-fourisolatedrabbitswererandomlydividedintothreegroups.GroupAreceivedantegradeperfusion. GroupBweremaitaintedheartbeatingbyretrogradeperfusionwithnormothermicoxygenatedblood.GroupCreceivedretrograde coronarysinusperfusionwithwarmbloodcardioplegia.After60minretrogradeperfusion,theheartswereswitchedonLangendor— ff-Neelyantegradeperfusedworkingheartmodelforanother60min.Intramyocytefreecalcium.myocardialmembraneMDA,AT— Paseandfluidityweremeasured.ResultsAfterretrogradecoronarysinusperfusion,activityofATPaseandfluidityofthemyocar— dialcellsmembraneingroupBwassuperiortothoseofgroupC.ThecontentofmyocardialcellsmembraneMDAandthein— tramyocytecalciumfollowedretrogradeperfusionwasmuchloweringroupBthanthoseofgroupC.ConclusionRetrogradeper— fusedbeatingheartwassuperiortothoseperfusedwithwarmbloodcardioplegiainreducingfreeradicalproduction,ameliatingin— tramyocyteparadoxicalcalciumaccumulation,andmaintainingactivityofATPaseandfluidityofthemyocardialcellsmembrane. Keywords:retrogradeperfusion;myocardialcellularmembrana;function;intramyocytecalcium;beatingbeart;membranedam— age 心肌细胞膜损伤是缺血,缺氧心肌细胞不可逆损伤的早期 特征.目前认为,膜损伤在心肌缺血损伤的发生中占有重 要地位.心脏外科手术后心肌细胞功能受到不同程度损害,膜 结构改变可能是原因之一. 1材料与方法 1.1逆灌模型与实验分组 1.1.1逆灌装置及灌注液参照肖家思教授[】的离体心脏灌 注装置组建左心做功装置及冠状静脉窦逆灌装置.左心做功 灌注液为改良的K—H液(PO267,80kPa,PC024.7,6.0 kPa)(1kPa:7.50mmHg).稀释血灌注液(PO216,26.7 kPa,PCO27,60kPa),配制方法为兔血与KH液按4;1混 合,红细胞压积2O以上,pH7.25,7.45,K4.4mmol/I, Na135mmol/I,Ca"1.32mmol/I.血温调至34?.稀释血 心脏麻痹液(PO216,26.7kPa,Pc027,6.0kPa),配制方法 为兔血与St.Thomas液按4:1混合,红细胞压积2O以上, pH7.3,7.5.K15mmol/L,Na135mmol/I,Ca1.8 mmol/I.血温调至34?. 1.1.2灌注技术兔耳缘静脉麻醉,静脉肝素化,开胸取出心 脏,浸入预冷的K—H液中,轻柔挤压心脏,排出心腔内积血,然 后剪开心包膜,在肺动脉根部剪一小口以利冠脉液流出,修剪 好主动脉断端,以备插管,结扎肺门及前,后腔静脉,剪除多余 组织.将主动脉套入主动脉插管上,固定.先行Langendorff 灌注,灌注液为K—H液,灌注压为60cmH20(5.88kPa).期间 行左房插管和肺动脉插管.心跳平稳后,关闭Langendorff灌 注,开始顺灌左心做功,前负荷为17cmH0(1.67kPa),后负荷 8OcmH20(7.84kPa).左房灌注顺灌左心做功20min后,逆灌 管进入右房继而插入静脉窦,停左室做功开始逆灌,逆灌压 50cmH20(4.9kPa),逆灌流量3ml/min.持续逆灌60min后, 拔除逆灌管,关闭右房切口,恢复顺灌左心做功60rain. 1.13实验分组实验分为3组,每组8枚心脏.对照组(A 组):单纯顺灌左心做功20min.常温氧合血逆灌不停跳组(B 组):顺灌左心做功20min后,用34?的温血稀释液持续逆灌, 使心脏平稳跳动60min,然后恢复顺灌左心做功60min.温血 心脏麻痹液逆灌停搏组(C组):顺灌左心做功20min后,诱导 停搏,用34?的温血心脏麻痹液持续逆灌,60min后复跳左心 做功60min.于逆灌前顺灌和逆灌后第6O分钟进行各指标测 定. 1.2研究内容与方法 1656 1.2.1心肌细胞膜制备心肌细胞膜提取采用改良的差速离 心法,Lowry法心肌细胞膜悬液蛋白定量. 1.2.2心肌细胞膜指标膜Na+_K+_ATP酶,ca一 ATP酶,Mg一ATP酶活性测定:参照南京建成生物研究 所提供的试剂盒说明进行.单位用t~mol?mg?h表 示. BA法进行心肌细胞膜丙二醛(MDA)测定(荧光法),单 T 位用nmol/ml表示. 荧光偏振法0测定心肌细胞膜脂流动性,计算荧光偏振度 (p),微黏度(T}),分子排列有序性系数(u)和膜脂流动性(Flu). 1.2.3分离心肌细胞,钙敏染料负载法测定心肌细胞内钙 离子([Ca]i)浓度,单位nmol/L. 1.3统计学处理实验数据用土S表示,用单因素方差 进行统计学处理,P<O.05为差异显着. 2结果 2.1心肌细胞膜ATP酶活性逆灌后恢复顺灌左心做功第 6O分钟B组Na一K一ATP酶活性较A组低(P%0.01),C组 心肌细胞膜ATP酶活性明显较A组低(P%0.05),B组心肌 细胞膜ATP酶活性明显优于C组(P<O.05),见表1. 表1心肌细胞膜ATP酶活性(t~molPi/mg.pro/h) :与A组相比P<O.05,#:与B组相比P<O.05. 2.2心肌细胞膜丙二醛(MDA)含量B,C两组心肌细胞膜 丙二醛含量明显较A组高(P<o.01),B组心肌细胞膜丙二醛 含量明显低于c组(P%0.01),见表2. 2.3心肌细胞内钙离子浓度[Ca.]iB,C组心肌细胞内钙 离子浓度明显高于A组(P<0.01).B组心肌细胞内钙离子 浓度较c组低(P<O.01),见表2. 表2心肌细胞膜丙二醛含量(nmol/rn1)及细胞 内钙离子浓度(nmol/L) :与A组相比P%0.01,#:与B组相比P%0.01. 2.4心肌细胞膜脂流动性B组心肌细胞膜荧光偏振度(p), 微黏度(T1),分子排列有序性系数(u)和膜脂流动性(Flu)与A 组无明显差异(P>0.05).C组p,u与A组相比明显较高 (P<O.O1),C组Flu与A组相比明显较低(P<0.01).C组 p,T},u与B组相比明显较高(P<0.01),c组Flu与B组相比 明显较低(P<O.01),见表3. 3讨论 膜磷脂双层分子不仅是生物膜的基本结构成分,而且是结 合于膜上的各种酶功能活动的微环境.许多酶促反应需要有 重庆医学2005年l1月第34巷第11期 一 定量特异磷脂才能发生.逆灌后心肌细胞膜脂质过氧化增 强,过氧化产物增多,必然影响膜上离子通道及膜酶功能,对膜 产生损伤.多不饱和脂肪酸的过氧化,导致心肌细胞膜流动性 降低,膜上酶,受体及离子通道的脂质微环境改变,膜通透性增 加,钙离子内流增多,排出障碍.心肌细胞MDA蓄积可抑制 膜酶活力.逆灌心脏不停跳心肌灌注较充分,心肌缺血缺氧程 度轻,减轻了膜脂质过氧化,较好地保护了膜及膜酶功能,有效 地减轻了细胞内钙超载. 表3心肌细胞膜脂流动性 组别P1uFlu A("=8)0.104士0.0130.58士0.090.071士0.01138.74士12.97 t3("=8)0.114士0.0140.68士0.0980.080士0.0083o.11士8.33 C(n=8)n143士0.015#0.90士0.139#0.099士0.011#19.69士5.18# :与A组相比P%O.O1,#:与B组相比P<0.01. fl,肌细胞膜的蛋白与脂质过氧化产物MDA交联,使膜流 动性下降,膜流动性与膜上内源性PIAz呈负相关,即膜的硬 化可激活内源性PIA:.改变脂质体的脂成分即改变了膜的 流动性.因此,逆灌后心肌细胞膜氧自由基引发的膜脂质过氧 化反应的加强,胞内钙超载所导致的膜PIAz活化以及心肌细 胞膜磷脂降解引起的游离脂肪酸聚积和溶血磷脂的去垢样作 用是引起膜酶活力降低,膜流动性降低的根本原因_5].这一系 列变化导致了心肌细胞膜的结构和功能的损害. 在本研究中,离体兔心逆灌后停跳组和不停跳组心肌细胞 膜脂质过氧化都显着加强,心肌细胞膜MDA含量增加.同时 心肌细胞膜荧光偏振度升高,膜流动性降低,微黏度升高,脂双 层分子排列有序性增加,分子运动减少.心肌细胞膜酶活力下 降,与心肌细胞内钙离子浓度增高呈同步变化趋势.不停跳组 逆灌后心肌细胞膜脂质过氧化产物MDA含量明显低于停跳 组,膜酶活性,膜脂流动性高于停跳组,心肌细胞内钙离子浓度 低于停跳组.说明离体兔心温血逆灌心脏不停跳对心肌细胞 膜的保护优于温血停跳. 参考文献: [1]李靖,肖家思.小哺乳动物fl,脏顺行性离体灌流技术 I-j].第三军医大学,1990,12(5):424 [2]HallNC,CarneyJM,ChenMS,eta1.Ischemia/reperfu— sion—inducedchangesinmembraneproteinsandlipidsof gerbilcorticalsynaptosomesI-j].Neuroscience,1995,64: 81 [33迟路湘,杨宗城,黎鳌.大鼠严重烧伤后心肌细胞膜损伤 的实验研究I-j].中国创伤杂志,1999,15(2):121 E4]迟路湘,杨宗城,王旭,等.细胞内钙稳态失控在缺氧及 烧伤血清损伤心肌细胞中的意义EJ].解放军医学杂志, 1998,23(2):95 [5]杨天德,陶军,吴悦维,等.GIK溶液对瓣膜置换术病人红 细胞膜流动性和脂质过氧化物的影响[J].重庆医学, 2003,32(8):987