转化生长因子β1对巨噬细胞纤溶酶原激活物抑制因子-1表达的影响

转化生长因子β1对巨噬细胞纤溶酶原激活物抑制因子-1表达的影响 转化生长因子β1对巨噬细胞纤溶酶原激活 物抑制因子-1表达的影响 华北煤炭医学院2006年5月第8卷第3期 JNoahChinaCoalMedicalCollege2006May,8(3)?283 [7] [8] bonemalTOWstmmalcellsdifferentiateintoneurons[J].JNeurosci Res,2000,61(2):364 Sanchez—RampsJ,SongS,Cardozo,PelaezF,eta1.Adultbone marrowstromalcellsintoneuralcellsinvitro[J].ExpNeural, 2000,164(2):247 DengWeiwen,ObrockaM,FischerI.Invitrodifferentiationofhu— manmarrowstromalcellsintoearlyprogenitorsofneuralcellsby conditionsthatincreaseintraeellularcyclicAMP[J].Biochemical andBiophyscialResearchCommunications,2001,282(1):148 [9]MezeyE,KeyS,WogelsangG,eta1.Transplantedbonem~rrow generatesnewneuronsinhumanbrains[J].ProcNailAcadSci USA,2003,100(5):1364 [1O]李贵荣.枸杞多糖的提取及其对活性氧白由基的清除作用 [J].【}】国现代应用药学杂志,2002,19(2):94 (2005一l2—20收稿)(周济桂编辑) 转化生长因子I3.对巨噬细胞 纤溶酶原激活物抑制因子一1表达的影响 欧阳小明宋旭东?胡大林?黄世章 (广州医学院第二附属医院广东广州510260;?华北煤炭医学院基础部;?中山大学公共卫生学院) [摘要]?目的研究转化生长因子B1(TGF一131)对RAW264.7细胞纤溶酶原激活物抑制因子一1(PAl一1)表达的影响.?方法 以TGF—BI(5ng/m1)刺激RAW264.7细胞,分别在作用0,12,24,48小时后,采用免疫细胞化学sp法,Western印迹以厦酶联免疫吸 附实验(ELISA)观察细胞PAI一1表达的变化.?结果TGF—B】刺激RAW264.7细胞,0小时组,12小时组,24小时组,48小 时组的PAl一1免疫染色强度积分分别为36.23.4-7.35,62.23.4-11.18,98.58.4-4.98,130.42.4-8+56,PAl一1蛋白相对友度值分别为 085.4-0.05,1.21.4-0.06,1.56.4-0.08,2.43?0.02,细胞上清液中PAl一1含量(rig/mL)分别为15.23?1.98,26.35?2,93,40.21? 1.54,69.32?3.21.?结论TGF—B1能够诱导RAW264.7细胞PAl一1的表达,并存在明显的时效关系. [关键词】转化生长因子131RAW264.7细胞纤溶酶激活物抑制因子一1 [中图分类号]R363.1[文献标识码]A[文章编 号]1008—6633(2006)03—0283—03 Influenceoftransforminggrowthfactor—lonplasminogenactivatorinhibitor一1expressioninRAW264.7cells OUYANGXiaomin,SONGXudong,HUDin,etal(TheSecondAffiliatedHospitalofGuangzhouMedicalCollege,Guangzhon 510260,China) [ABSTRACT]ObjectiveTostudytheinfluenceoftransforminggrowthfactor一131(TGF—B1)onplasminogenactivatorin— hibitor一1(PAI一 1)expressioninRAW264+7cells.MethodsRAW264.7cellswereincubatedwith5rIg/mlTGF—B1for 0h,12h,24h.48h+ThePAI一 1expressionwasinvestigatedbySPimmunocytochemistry,WesternblotandELISA.Results IntheprocessofstimulationbyTGF,Bl,thePAI一 1stainingcountsof0h,12h,24hand48hgroupwere36.23?7.35,62+ 23?11.18,98.58士4+98,130.42?8.56respectivley;andthePAI一 1proteinlevelwe/’e0+854-0.05,1.21?0+06,1.56 ?0.08,2.43?0.02respectively;andthePAI一 1contents(ng/m1)incellsuperantswere15.23?1.98,26.35?2+93, 40.21?1.54,69.32?3.21.ConclusionsTGF—B1couldinducePAI一 1expressioninRA64.7cellsinatime—de. pendentmanner. [KEYWORDS]Transforminggrowthfactor—B1.RAW264.7cells.Plasmi nogenactivatorinhibitor一1 转化生长因子B,(TGF—B,)是参与肺炎症/纤维化最重 要的细胞因子之一….在纤维化的动物模型以及特发性肺 纤维化的肺组织中的TGF—B.水平均升高J.在肺纤维化 患者的支气管肺泡灌洗液中,人们发现纤溶酶原的活性受到 损害,而这种纤溶酶原活性的异常是由于纤溶酶原激活物抑 制因子一1(PAI一1)表达的增加所致3].本实验通过研究 TGF—Bl对RAW264.7巨噬细胞PAI一1表达的调控机制,探 讨二者在肺纤维化中的作用. 1材料与方法 1+1细胞培养RAW264.7巨噬细胞购自上海细胞所,用含 10%小牛血清的RMPI一1640培养基(GIBICO公司),37?, 【作者简介】欧阳小明(1969一),舅,硕十,主治医师.主要研究方向 肝脏病理学. 5%CO2培养至80%融合,血清饥饿24小时后,加入5ng/mL 的人源重组TGF—B,(PEPROTECH公司)分别刺激0,12,24, 48小时. 1.2免疫细胞化学sP法接种细胞爬片PBS漂洗;4%多聚 甲醛4?固定20分钟;0.1%Triton—X100破膜20分钟;3% HO阻断5分钟;血清封闭15分钟;一抗(1:50)孵育4?冰 箱过夜;生物素化二抗,辣根过氧化物酶标记的三抗,37?孵 育30分钟;DAB显色,苏木素复染观察结果.以胞浆出现棕 黄色颗粒为阳性信号,经HPIAS1000高清晰病理图像分析系 统进行定量分析,以灰度值大小代表信号强弱,测定平均染色 强度积分. 1.3Western印迹裂解细胞提取细胞总蛋白,BCA试剂盒 (Promega产品)定量.10%聚丙烯酰胺凝胶电泳,经15V恒 压电转移至硝酸纤维素膜,5%脱脂牛奶封闭1小时,抗人兔 284?华北煤炭医学院2006年5月第8卷第3期JNoahChinaCoalMedicalCollege2006May,8(3) 多克隆PAl一1抗体(1:200,SantCruz公司)37?孵育2小时, HRP标记的二抗37oC反应0.5小时,DAB显色.以B—actin 作为内对照,应用Photoshop7.0软件对目的条带,以及B—ac- tin条带进行灰度扫描,计算二者的相对值,表示PAl一1的相 对水平. 1.4酶联免疫吸附实验(E1ISA)用小鼠PAl—lELISA试 剂盒(晶美公司)检测TGF—B刺激的RAW264.7细胞(不 同时间点)上清液中PAI一1的含量.实验严格按照试剂盒 说明书操作.每组实验均重复3次.采用SPSS11.0软件对 数据进行方差分析,以P<0.05为显着性水平. 2结果 2.1免疫细胞化学检测TGF—Bl刺激的RAW264.7细胞 PAl—l表达免疫阳性颗粒定位于胞浆,呈弥漫性分布. TGF,B刺激0,12,24,48小时PAl—l平均染色强度积分分 另4为36.23?7.35,62.23?l1.18,98.58?4.98,130.42? 8.56,4组问差异显着(P<0.05;见图l,表1). 表1TGF—B,对RAW264.7细胞PAI—l表达的影响(x?s) 注:各组间比较差异有统计学意义,P均<0.05 刺激的RAW2647细胞PAl一1表 达(sP法x200).免疫组化结果显示阳性信号定位于胞浆.呈棕黄色 颗粒;ABCD分别示刺激O,l2,24,48小时. Oh12h --一-. 24}48h llE.丞渗0渗j誊黪|l诎 图2Western印迹检测TGF—Bl刺激的RAW264.7细胞PAl一1表 达 2.2Western印迹检测TGF一13l刺激的RAW264.7细胞PAl 一 1表达无TGF一13,刺激,RAW264.7细胞有弱的PAl一1 表达,随着TGF一13.作用时间的延长,PAI一1的表达水平逐 渐调,48小时组高于24小时组,24小时组又高于12小时 组,呈现明显的时间依赖关系(P<0.05,见图2,表1). 2.3ELISA检测TGF—B刺激的RAW264.7细胞上清液中 PAl一1的含量TGF—B刺激的RAW264.7细胞上清液中 PAl一1的含量变化趋势与上述结果相似,48小时组PAl一1 含量最高(69.32?3.21ng/mL),次之是24小时组(40.21? 1.54ng/mL),24小时组叉高于l2小时组(26.35?2.93ng/ mL),0小时组最低(P<005,表1). 3讨论 肺泡巨噬细胞是肺纤维化发生中重要的效应细胞,肺泡 巨噬细胞分泌大量的炎性和致纤维化因子,如活性氧族,脂类 介质,细胞因子,化学趋化因子等,一方面直接刺激肺组织造 成损伤,在肺纤维化病变的开始及演进过程中起重要作用. 由于分离肺泡巨噬细胞数量有限,步骤繁琐,且易污染,目前 一 般用其它巨噬细胞代替肺泡巨噬细胞进行研究. RAW264.7细胞为小鼠腹腔巨噬细胞系,在培养时具有非常 强的活力及生长特性,适合用于体外实验.更重要的是 该细胞与肺泡巨噬细胞具有很多的相似性,因此,我们在本实 验中选用该细胞系代替AM作为实验对象. PAI一1是丝氨酸蛋白酶抑制剂家族成员之一,纤溶系统 的主要抑制物,可迅速,有效的抑制纤溶酶原激活物(PA)的 活性.近年来发现PAl—l在肺纤维化疾病中具有重要的意 义’:PAI一1缺陷的小鼠气管内灌注博莱霉素,它们对于 胶原沉积有抵抗作用,肺纤维化的程度减低;PAI—l过度表 达的小鼠的肺纤维化明显;而且肺纤维化患者其PAI一1高表 达.但PAI一1在肺纤维中高表达的机制仍不十分清楚.肺 纤维化是多种细胞因子综合作用的结果,但在这些细胞因子 中TGF—B.尤为重要.TGF—B.这种与肺纤维化密切相关的 细胞因子,具有调控细胞增生,分化,凋亡,黏附和运动以及细 胞外基质(ECM)产生等多种功能.在体内,肺组织发生纤维 化时,TGF—B,及其mRNA增加最显着.TGF—B.主要作用 于胶原的转录和翻译过程.能诱导前胶原mRNA的产生,从 而促进胶原蛋白形成和沉积j.Perdue等”用rat石棉肺模 型进行肺纤维化研究,他们发现在最先发生纤维化区域内,肺 泡巨噬细胞聚积并强烈地表达TGF—B.本实验结果显示, 外源性的TGF一13.作用于RAW264.7细胞,随着作用时间的 延长,胞内胞外PAl一1蛋白水平逐渐上调,呈现明显的时间 依赖关系,TGF—B.是巨噬细胞产生PAl一1的重要的诱导因 子.已知肺纤维化局部高水平的TGF—B.主要是肺巨噬细 胞所产生的,因此,可能存在这一正反馈过程:活化巨噬细胞 :分泌高水平的TGF—B.,TGF—B.又作用于巨噬细胞本身,使 PAI一1表达上调.’ 肺纤维化过程中,高水平的TGF一13…方面促进肺成纤 维细胞合成和分泌细胞外基质;另一方面刺激肺泡巨噬细胞 PAl一1的表达,抑制纤溶活性,抑制基质的降解,二者都导致 基质合成和降解的失衡,从而促进肺纤维化的进展.因此, TGF一13,PAl一1是肺纤维化治疗的重要靶分子. 参考文献 [1]Coke~IlK,[~urentGJ.PuhnonaryfjlJlosis:cytokinesinthehal— alice[J].EurRespirJ,1998.11(6):1218 [2]PhanSH.Themyofibroblas/inpulmonary乩losis[J].Chest, 华北煤炭医学院2006年5月第8卷第3期 JNoahChinaCoalMedicalCoilge2006May,8(3).285 2002,122(6Supp1):286S [3]GuntherA,MosaviP,HeinemannS,eta1.Alveola~fibrinforma. tioncausedbyenhancedprocogulantanddepressedfibrinolyticca- pacifiesinseverepneunonia[J].AMJRespirCritCmeMed, 2000,161:454 [4]RojanasakulY,YeJ,Chenr,eta1.DependenceofNF—kappaB activationandncradicalgenerationonsilica—induced.rNF—a1. phap~Muefioninmacrophages[J].MolCellBiochem,1999.200 (1—2):119 [5]RaschkeWC,BairdS,RalphP,etal,Function’,dmacrophagecell linestransformedbyAbelsonleukemiavirus[J].Cell,1978,15 (1):261 [6]HattoriN,DegenJL,SissonTH,eta1.Bleomycin—inducedpul— monaryfibrosisinfibrinogen—nullmice[J].JClinInvest.2000, 1o6(6):1341 [7]ChoSH,RyuCH,OhCK,PlasminogenactivatorinMbitor一1in thepathogenesisofasthma[J].ExpBiolMed(Maywood),2004, 229(2):138 [8]HattoliN,MizunoS,YoshidaY,eta1.Theplasminogenactivati0n systemreducesfibrosisinthelungbyabepatocytegrowthfactor— dependentmechanism[J].AmJPathol,2004,164(3):1091 【9]BienkowskiRS,GotkinMG.Controlofcollagendepositioninman. malianlung[J].ProcSocExpBMMed,1995,209(2):1l8 [10]PerduerD,Br~lyAR.Distributionoftransforminggrowthfactor — beta1.fibroneetin,andsmoothmuscleactlninasbestos—in. ducedpuhnonaryfibrosisinrats[J].JHistoehemCytochem, 1994,42(8):1061 (2006—02—22收稿)(雨静玲编辑) d,JL肾病综合征并发脑栓塞1例 沈涛 (江苏省苏北人民医院扬州225001) [关键词]小儿肾病综合征脑栓塞 [中图分类号]R726.9[文献标识码]B [文章编号]1008—6633(2oo6)03—0285一Ol 1病历报告 患儿,女,3岁,患儿因面部浮肿4天入院.住院后查体: 血压100/60mmHg,颜面,双下肢凹陷性水肿,咽稍充血,心肺 (一),肝肋下2cm,脾未触及,无皮疹.住院后实验室检查,血 总胆固醇10.49mmol/L,低密度脂蛋白7.99mmol/L,总蛋白 33.4g/L,白蛋白13.6g/L,A/G比值0.7,24小时尿蛋白定量 58mg/(kg?d),尿素氮3.16mmol/L,肌酐40.6~mol/L,ESR 73mm/h,补体C31.50mg/mL,乙肝6项(一),ASO(一),腹腔 部B超未见腹水,免疫球蛋白IgA15g/L,IgA1.9g/L,IgM 1.3g/L(正常值:1.1,1.8).尿常规:蛋白定性(卅),无血 尿.血常规:Hb146?L,WBC6.4×10/L,N0.224,L0.725. BPC323×10.入院诊断:肾病综合征(单纯型).于入院后 第4天开始用强的松2mg/(kg?d),口服治疗.于入院第12 天患儿并发上呼吸道感染,并因腹痛B超检查提示腹腔有少 量积液,胰腺外形略饱满,考虑为原发性腹膜炎,给予利君曲 星,诺塞林抗感染治疗后症状缓解,但尿蛋白仍然是(卅). 于入院第24天患儿突然出现剧烈的头痛,不发热,恶心,进食 则吐.多次测血压均在100,110/60—70mmHg范围之内,无 口角歪斜,肢体功能障碍,但发现双眼球结膜水肿明显,眼底 检查未见异常.复查血肌酐27~mol/L,尿素氮2.7mmol/L, 二氧化碳结合力24.7mmol/L,血钙1.9mmol/L,血钾4.66 mmol/L,血钠136.7mmol/L,血氯98.1mmol/L,均在正常范 围内.凝血酶原时间町114秒,活化部分凝血时间AVIT 447秒,凝血酶时间Tr16.30秒,纤维蛋白原浓度FIB 8.37吕/L.脑电图检查双侧对称可见弥漫性8波出现,各导 联散在较多的0波.脑脊液压力不高,无色透明,常规检查正 常.脑cT检查示:右侧横窦密度增高,考虑静脉窦m栓.给 予输白蛋白,低分子右旋糖酐提高胶体渗透压,20%甘露醇脱 水,肝素1Ing,/(kg?d)静滴后头痛症状改善,球结膜水肿好 转,后家属要求转上级医院治疗.经电话随访在上级医院 MRI检查进一步确定为颅内静脉窦血栓,继续原治疗后症状 消失. 2讨论 肾病综合征所致的病理生理改变常可发生一些并发症, 其中因其高凝状态常易并发血栓形成,尤以肾静脉血栓最为 临床重视,还可见到下肢静脉血栓及肺血栓的报道,但引起脑 栓塞的报道较为少见.肾病状态时此类并发症原因是由于: ?肝脏合成有关凝血的物质增加如纤维蛋白原第V,?因子 的增加.?抗凝血酶I11自尿中丢失.?血浆纤溶酶原活性下 降?高脂血症时血黏滞度增加,血小板聚集加强.?感染 或血管壁损伤可激活内源性凝血系统.?皮质激素的应用促 进高凝.?利尿剂的应用,血液浓缩等….肾病综合征中如 有显着白蛋白低下(<20g/L),高脂血症,应用皮质激素治疗 尿蛋白持续不降者,应警惕此类并发症,且凝血因子的明显升 高与血白蛋白的下降呈密切负相关.可测血小板计数,纤维 蛋白原,血和尿中D一二聚体以进行初筛,再视条件进行其他 相关检查.对已经发生血栓者首选尿激酶,应用肝素及双香 豆素等治疗,还可于局部灌注链激酶或尿激酶.对血浆纤溶 酶下降者可输冻干血浆,AT?下降者给予浓缩抗凝血酶? ] .肾病综合征并发脑栓塞极为少见,故在临床诊治过程中 如出现神经系统症状时需提高警惕. 参考文献 [1]杨霁云.白克敏,小儿肾脏病基础与临床[M].北京:人民卫生 出版社,2000.161 [2]郭激霞,术尚明,一I三围蓉,等.肾病综合征并发脑梗死22例临床 分析[J].【f1f州综合临床,1999,12(6):520 (2005—12—24收稿)(静玲编辑)