泮库溴铵对肾上腺嗜铬细胞乙酰胆碱受体的作用
泮库溴铵对肾上腺嗜铬细胞乙酰胆碱受体
的作用
坚华酩学杂壹2005年1月第25卷第1期ChinJAnesthesiol,January2005,vd25,No.143
实验研究?
泮库溴铵对肾上腺嗜铬细胞乙酰胆碱受体的作用
赵雪莲庄心良杨保仲李世通徐国辉
【摘要】目的研究泮库溴铵对肾上腺嗜铬细胞(PC12细胞)烟碱型乙酰胆碱受体(nAChR)的
作
用,探讨其是否与该药的不良反应有关.
以DMEM培养液培养PC12细胞.采用全细胞电
压钳
技术,记录以不同浓度乙酰胆碱(Ach)(10,30,100,300,1000tanol/L)所诱发PC12细胞nAChR
的内向电
流和不同浓度泮库溴铵(0.01,0.1,1,10,100,1000肿ol儿)对PC12细胞nAChR的内向电流的
抑制率.
结果PC12细胞可为不同浓度Ach激动,其电流大小呈浓度依赖性,93.7%的nAChR可被
1inrflol,L
Ach激活.泮库溴铵可逆性抑制1mmol/LAch所诱发的电流,并呈浓度依赖性.1mmol/L泮库
溴铵能
完全抑制1mmol/LAch对PC12细胞nAChR的激动作用.结论泮库溴铵能竞争性抑制PC12
的
nAChR,阻断儿茶酚胺的分泌.
【关键词】泮库溴铵;PC12细胞;受体,胆碱能
EffectsofpancuroniumonnicotinicacetyicholinereceptorsinpheochromocytomacellsZHAOXue-lion,
ZHUANGXin-liang,YANGBao-zhong,eta1.DepartmentofAnesthesm,ShanghaiFirstppsHospital,
Shanghai200080,China
【Abstract】ObjectiveToinvestigatetheeffectsofpancuroniumonnicotinicacetylcholinereceptors
(nAChRs)inpheochromocytomacells(PC12cells)andtodetermineifpancuroniumhasdirecteffectsonPC
cells.MethodsPC12cells(purchasedfromInstituteofCytology,ChineseAcademyofScience)wereculturedin
DMEMcontainingpenicillinandglutamlne.nAChRinPC12cellswerestimulatedwithdifferentconcentrationsof
Ach(10,30,100,300,1000ttmolL).Ach-mediatedinwardcurrentswererecordedusingwhole.cellpatch
clamptechniquewithholdingpotentialsetat一
80mV.ToinvestigatetheeffectsofpancuroniumonnAChRinPC
cells,thePC12cellswereperfusedwithdifferentconcentrationsofpancuronium(0.O1,0.1,1,10,100,10
00
vmol’L)beforeAch1ttmol’L,Wasadded.ResultsInwardcurrentswereelicitedbystimulationofnAChR
withAchinaconcentration-dependentmanner.93.7%ofnAChRscouldbeactivatedby1tanol’L,Ach.
Pancuroniumreversiblysuppressedthecurrentsinaconcentration?dependentmannercomparedtothec
ontrol
currentselicitedby1?m0l’L,Ach.1Stool’L一.pancuroniumcouldalmostcompletelysuppressedthecurrents
elicitedby1rand?L,Ach.ConclusionPancuromamcouldinhibitnAChRinPC12cellsandreduce
catecholaminerelease.
【Keywords】Pancuronium;PC12cells;Receptors,cholinergic
泮库溴铵是1964年合成的甾类,中时效非去极
化肌松药,它可与心脏毒蕈碱型乙酰胆碱受体结合,
使血浆中儿茶酚胺浓度增高,因此可产生心率增快,
血压和心排血量增加等不良反应….泮库溴铵是否
对肾上腺嗜铬细胞(PC12细胞)和交感神经节有直
接作用尚无定论.本研究拟研究泮库溴铵对PC12
细胞烟碱型乙酰胆碱受体(nAChR)的作用.
作者单位:200085上海交通大学附属第一人民医院麻醉科
材料与方法
细胞培养PCI2细胞(中国科学院细胞所提
供)以DMEM培养液(含10%胎牛血清,5%马血清,
100u/ml青霉素和100mg/L及2mmol/L谷氨酰胺)
培养于37?5%CO:的培养箱.用0.25%胰蛋白酶
消化传代于35ram培养皿中培养24h备用.
电生理记录以细胞外液(NaC1140mmol/L,
KC15.4mmol/L,CaC121.8mmol/L,MgCl:1.0mmol/L,
HEPES10mmol/L,葡萄糖11.1mmol/L,阿托品1
中华麻醉学杂志2005年1月第25卷第1期ChinJAnesthesiol,January2005,Vol堑,.
ttmol/L,pH=7.4)替换PC12细胞的培养液.用PC.
10微电极拉制仪(Narishige公司,日本)分两步将玻
璃微电极毛胚(华西医科大学产)拉制成微电极,并
用MF.830微电极抛光仪(Narishige公司,日本)抛
光.以电极内液(CsC1150inmol/L,HEPES10
inmol/L,EGTA5inmol/L,Mg-ATP2inmol/L,pH=
7.3)充灌微电极.电极阻抗为3,5MQ.应用全细
胞电压一膜片钳记录电流.电刺激脉冲的给出及电
信号的采入均通过计算机程序pClamp7.0及
digidatall+200B转换器接VI来完成.采样频率500
Hz,低通Bessel滤波0.5kHz.电极阻抗3,5MQ,封
接阻抗大于1?时,吸破细胞膜成全细胞状态.细
胞持续以细胞外液灌注(1,2ml/min).
给药模式1.以1inmol/L乙酰胆碱(Ach)(批
号12k2628,Sigma公司)做PC12细胞的电压激活曲
线(膜钳制电压一100mV,20mV).2.以不同浓度
Ach(10,30,100,300,1000tLmol/L)刺激PC12细胞的
nAChR.持续给药4,5s,两次给Ach间隔2,3
min,以细胞外液持续冲洗,减少细胞脱敏感.3.预
先用不同浓度(0.01,0.1,1,10,100,1000ttmol/L)泮
库溴铵(批号7902802,Organo公司)平衡PC12细胞
30s,再给予1inmol/LAch(持续给药4,5s)激动受
体,给药前后做单用1mmol/LAch的对照.取两次
应用Ach所得电流平均值作为对照值.两次给Ach
间隔2,3min,以细胞外液持续冲洗,减少细胞脱敏
感.
统计学分析图形数据采用Clampex和Clamfit
软件处理,计量资料以均数?
差(?s)
示,
抑制率由加泮库溴铵最大电流值与前后A.ch对照电
流平均值的比值表示.按标准Hill公式计算激动剂
的浓度.效应曲线.用改良Hilt公式计算拮抗剂的
浓度.效应曲线.非线性曲线拟合采用Origin软件
完成.组间比较采用单因素方差分析,组内比较采
用配对t检验,P<0.05为差异有统计学意义.
结果
Ach可刺激PC12细胞的nAChR得到内向电流,
并呈浓度依赖性.1inmol/LAch可激动约93.7%的
受体.由浓度.效应曲线得EC50值(94士18)ttmol/L,
Hill系数(nH)为1.34?0.4.见图1.泮库溴铵能可
逆性抑制Ach对PC12细胞nAChR的激动作用,并
呈浓度依赖性.泮库溴铵抑制PC12的nAGhRICS0
值为(19.730?0.010)tLmol/L,nH为0.87?4.4x
10一.见图2.
loo
8o
煨
脚60
詹
耋柏
U
20
O
lOloolooo
Anh浓度(tunol/L)
圈1不同浓度Ach诱发PCI2细胞nAChR内向电流的变化
l00
80
60
静
要柏
2O
O
0.Ol0.1110100l000
滓库澳铵浓度(l,L)
圈2不同浓度泮库溴铵对1mol/LAch激发PCI2细胞
nAChR的内向电流的抑制率
讨论
从PC12细胞的电压激活曲线结果发现,激发电
流大小与膜钳制电压无关,故本研究膜钳制电压均
设为一80mV.由Ach的浓度.效应曲线得出
1mmol/LAch接近饱和浓度,所以在观察不同浓度
泮库溴铵对PC12细胞nAChR作用时,均用此浓度
来激发电流.
泮库溴铵含两个季铵集团,D环上的季铵基团
与泮库溴铵对神经肌肉接头处nAChR作用有关,而
A环上的季铵基团与神经肌肉接头外的nAChR结
合从而产生不良反应.如将A环上季铵基团由叔
铵基取代即为维库溴铵,则药物理化性质发生变化
不良反应明显减少.泮库溴铵在临床剂量范围
内既有阻滞心脏毒蕈碱乙酰胆碱受体作用,也能提
高血浆中儿茶酚胺浓度,从而使交感神经张力提
高.
PC12细胞来自鼠嗜铬细胞瘤细胞克隆细胞株,
表达神经节型nAChR(以a3或a3a5亚型为主),
是神经内分泌细胞,可作为交感神经节前突触后模
中华醛堂鍪志20—05~—g1月第堑鲞第1期—inJAnesthesiol,January2005,Vol25,No.1
型J.本研究结果显示,在细胞外液含19mol/LAeh
时,PC12细胞的nAChR可为不同浓度Ach激活,表
明PC12细胞确有nAChR表达.以泮库溴铵预孵育
细胞,可拮抗Ach的受体激动作用,表明泮库溴铵能
抑制交感神经节前的nAChR,使神经传导受阻,故它
能抑制节后去甲肾上腺素的分泌.有研究表明应用
泮库溴铵后血浆中儿茶酚胺浓度增加可能是交感神
经分泌儿茶酚胺增加,或是从血浆中儿茶酚胺再摄
取减少及被酶分解减少所引起.本研究结果显示,
泮库溴铵对PC12细胞nAChR有可逆性抑制作用,
因此不支持血浆中儿茶酚胺增加是由交感神经节细
胞分泌所致.
在本研究中,以泮库溴铵预孵育受体30S,此时
泮库溴铵与静息态或脱敏感态受体结合J.这种模
式也更符合麻醉时的生理情况J.实验结果显示
IC50为(19.73?0.O1)t~mol/L,nH为0.87?4.4×
10一,表明泮库溴铵与受体的一个结合位点结合而
发挥抑制作用,随着泮库溴铵浓度递增可完全抑制
1mmol/LAch激发的电流,表明泮库溴铵可竞争性
抑制nAChR.在较高浓度泮库溴铵时,即使再高浓
度Ach也不可能逆转泮库溴铵对受体的阻滞作用,
Dowenick等研究结果与本研究的结果相一致,他
们发现泮库溴铵能竞争性抑制神经肌肉接头处的肌
肉型nAChR,从另一侧面可解释临床应用新斯的明
拮抗肌松药,其效果与当时肌松程度有关.当局部
泮库溴铵浓度很高致肌松程度很深时,此时应用新
斯的明即使加大用量,仍难逆转泮库溴铵的肌松作
45
用.
泮库溴铵能竞争性抑制交感神经节nAChR受
体,其临床发现血浆中儿茶酚胺浓度增加可能非分
泌增加所致.
参考文献
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(收稿日期:2004.01.20)
(本文编辑:刘玉华)
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1.薛杜普等…指出棉酚从体内排泄缓慢.
2.麦胶敏感性肠病的发病有三种机制参与
3.间质细胞cAMP含量测定方法见文献[7]
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