蛋清破花粉壁的研究

蛋清破花粉壁的研究 3 蛋清破花粉壁的研究 罗曼蒋立科 () 安徽农业大学生物系 合肥 230036 摘 要 花粉含有人类所需的各种营养成分, 具有较高的营养和保健价值。因为花粉外 壁含有由胡萝卜素和类胡萝卜素酯组成的对物理、化学及酶稳定的花粉素, 故影响对花 () 粉的深加工。本文报道经长期研究的蛋清破花粉壁的方法, 以微球菌 . M ly sod e ik t icu s 为对照, 发现花粉外壁含有肽聚糖, 不但为研究花粉破壁方法提供了依据, 而且能用于 多种花粉产品的生产。 关键词 花粉, 花粉素, 蛋清, 破壁, 肽聚糖 () 花粉 是植物雄性配子体, 植物高度浓缩的“微型营养库”。尽管内壁由果胶和纤维 Po llen 素组成, 类似于叶菜类植物细胞初生壁, 但外壁则是胡萝卜素和类胡萝卜素氧化聚合物组成的 1 花粉素所构成, 对物理、化学及酶的降解都较稳定, 直接用于加工饮料或其他各类食品时, 商 品外观、口感、粗糙度等使消费者无法接受。 于是在饮料、化妆品和速效保健药等产品的应用 中, 人们研究出机械破壁、温差破壁、发酵法破壁、蜂粮酶解及化学溶剂法破壁等方法破坏花粉 壁, 然后提取营养素。鉴于花粉内营养素极性差异很大, 即在溶剂中溶解度有限, 很难用一种或 两种溶剂或加入大量有机溶剂将大部份营养素提取出来, 存在工艺流程长、溶剂使用种类多, 特别是有机溶剂法回收溶剂和提高产品浓度时能量消耗大、使用设备多、生产成本高、营养提 取率低和损失大等弊病, 导致花粉食品的加工神秘化, 有效成分含量低, 食用后无效果, 致使市 场花粉产品出现忽冷忽热现象。 经多年研究, 现报道采用蛋清提取物将花粉壁破碎, 并根据营 养成分提取需要, 控制花粉壁破坏程度。 该方法不仅破壁后能保持花粉营养素的有效性, 并发 现花粉外壁含肽聚糖及破壁机制。对提高营养素的提取具流程短、可操作性强、耗能少、成本低 及对人畜及环境无污染等优点, 有较大推广意义。 1 材料与方法 111 材料 ()( )( 蛋清 市场供应的鲜蛋、花粉 来自养蜂场、微球菌 M . ly sod e ik t icu s 634, 含肽聚糖 40% )) (, 90% 中国科学院微生物研究所提供。 收稿日期: 1998212203 3 安徽省轻工重点攻关研究项目3 , T h e Key P ro jec t o f L igh t Indu st ry o f A nh u i P ro v inceC h ina ) ( 10% 上海化学试剂公司提供, 0. 1 ƒƒƒ, 0. 1 , 0. 05 HA c m o lL N aC lm o lL HA cm o lL pH6. 8 磷酸盐缓冲液, 活性染料: 艳红 22, 012% 乳化剂: 称 012 聚氧二酰脂肪醇醚, 加 5 K B P g m l 蒸馏水微热溶解, 冷却后, 用 016 m o lL H C l 定容至 100 m l 备用。ƒ 112 方法 11211 蛋清提取物的处理 从鲜蛋无气室端取蛋清, 立即加入 5 倍体积的 011 ƒ,m o lL N aC l 混匀后即用 10% 调 至 516, 于 80?水浴, 保温至略呈白色, 于冷室或流水下骤冷,HA c pH 4 000 rpm 离心 10 m in , 取清液放冰箱保存待用。 ( 11212 微球菌的培养与收集 取微球菌接种于肉汤培养基 牛肉膏 0105% , 蛋白胨 1% , ) 0. 5% , 琼脂 215% , 715, 150 无菌 15 , 于 37?培养 56 后, 收集菌体并用蒸 N aC l pH P a m in h 馏水和丙酮反复洗涤, 最后用乙醚处理, 获干燥菌体。 11213 方法 标记花粉和微球菌 取经灭菌处理过的干花粉和干燥菌体各 5 , 分别加入 g1125 再加 215 活性染料艳红 22搅拌均匀, 于 25?水浴放置 24 染 5 , ƒm o lL N aO H m lg K B P h 色后, 以 3000 离心 10 , 收集玫瑰色花粉和玫瑰色菌体。 染色花粉和菌体反复用蒸馏 rpm m in 水洗涤并离心, 以尽量除去未参加反应的染料。 净化后的染色花粉和菌体直接悬浮于 0105 6. 5 磷酸缓冲液内, 制成相当于 011% 的花粉和菌体液。 m o l pH 11214 蛋清提取物对上述花粉和微球菌的处理 取出蛋清提取物清液 2 份, 均为 1 , 分别 m l加入经上述 1、2、3 处理的花粉液和微球菌液, 37?保温 15 , 加乳化剂 1 终止反应。反应 m in m l 液以 3 000 离心 10 于 540 处比色, 空白管以缓冲液加蛋清提取液再加乳化剂代rpm m in nm 替。 11215 蛋清提取液对花粉破壁后效果的检测 取 2 份各 1 花粉, 分别加入 0. 05 ƒg m o lL pH 8. 5 磷酸缓冲液 115 温孵后, 其中 1 份加提取液 1 , 另一份用 1 0105 ƒ15 6m l m lm l m o lL pH 磷酸缓冲液代替, 于 37?反应 15 , 加入乳化剂终止反应, 经 3 000 离心 10 , 取清 m in rpm m in 液测定核酸和蛋白质对 239 及 280 紫外光吸收值。nm nm 11216 显微观察 用接种针取 11215 沉淀物少许于载玻片上, 加少量蒸馏水将经蛋清提取物处理过的花粉分散, 放上盖玻片于 40×10 放大倍数的镜头下观察 5, 6 视野, 统计未破壁与总 花粉粒数之比, 计算破壁率。 2 结 果 ()211 染色花粉和菌体水解后 吸收值 列于表 1。 OD 540 染色花粉和菌体溶壁后 表 1OD 540 21 T ab le OD 540 o f co lo u red po llen and bac te r ium bo dy af te r b ro k en w a ll () 破壁液吸收值 未破壁液吸收值 波长 nm ƒ破OD 未破 OD 稀释倍数 W ave leng th A b so rp t io n va lue o f A b so rp t io n va lue o f ƒOD bzo ken2w a ll D ilu t io n m u lt ip le ()nm 22b ro k en w a ll so lu t io n unb ro k enw a ll so lu t io n OD unbzoken2w a ll 239 230 0. 25?0. 020. 121?0. 000 25?2 280 230 0. 186?0. 0340. 07?0. 034?2 从吸收值变化, 表明花粉壁含有溶菌酶作用底物即肽聚糖。 通过显微镜检测, 溶壁 OD 540 呈现于破壁处。提示肽聚糖类物质在花粉壁上分布不均衡, 主要分布在花粉管和花粉沟处。若 用来自市场的纯溶菌酶, 则无此破壁效果, 表明蛋清中尚有其他活性物质, 仍需进一步研究。 212 破壁效果 花粉破壁前后OD 239、OD 280 吸收值列于表 2。 表 2 花粉破壁前后紫外光吸收值的变化 22 T ab le U lt ro v io le t ab so rp t io n va lue ch ange s befo re o r af te r po llenw a ll is b ro k en () ()() ()总体积 取样品液 加水 加提取液 乳化剂 m lm l m lm l 样品名称 A dd ing ex t ract ive T o ta l o f A dd ing w T ak ing sam p le () m lOD 540 Sam p le nam e so lu t io n vo lum e so lu t io n a te r Em u lsio n 染色花粉 3 0. 5 0. 5 1 2 0. 220 Co lo u red po llen 染色花粉 3 0. 5 1 0. 5 2 0. 007 Co lo u red po llen 染色菌体 3 0. 5 0. 5 1 2 0. 275 Co lo u red bac te r ium bo dy 染色菌体 3 0. 5 1 0. 5 2 0. 003 Co lo u red bac te r ium bo dy 从、吸收值变化, 说明花粉壁破裂, 花粉由于内外渗透压悬殊, 其核酸和蛋白质 OD 239OD 280 已通过破裂处由内向外释放, 破壁花粉紫外吸收值均为未破壁者 2 倍以上。 213 破壁效果及破壁程度 由显微镜于 10×60 放大倍率观察到, 几乎无完整花粉, 破壁率为 100% 。 由于花粉来源、品种不同, 各种花粉壁含肽聚糖分布位置及量多少不同, 破壁孔数多少及孔径大小亦不同, 破 裂程度呈现l|I 、 、, 级。 ? 3 讨 论 311 肽聚糖为溶菌酶作用专一底物, 而微球菌为含肽聚糖的对照物。该研究在同等条件下, 通 过含溶菌酶的蛋清处理物与花粉作用, 以微球菌作对照, 表明蛋清能分解花粉壁主要物质为溶 ()菌酶, 同时证明花粉壁上具有微球菌胞壁相类似成分 即肽聚糖。 ()312 花粉破壁程度与营养成分提取率有关, 根据花粉形态破壁程度可分为三级 见图 1。 l|I 级 , 内容物自萌发孔处溢出。花粉壁自萌发孔处裂开 级 花粉壁除萌发孔处, 其它部份也有破裂, 内容物自萌发孔和其它破裂处大部分溢 ? 出。 , 级 花粉壁完全分解为数块残片, 内容物全部溢出。 本方法对花粉破壁程度的三个级别兼而有之。 花粉破壁程度直接影响营养成分提取。 该2+ 方法的破壁程度, 除受花粉品种影响外, 还受 和 浓度调节。pH C a 313 本方法破花粉壁速度与温度相关, 尽管该法的反应温度范围较宽, 但在 30?, 37?之间, 在搅拌下, 10 以内即可破壁, 高于或低于该范围, 破壁效果均受影响。 m in 314 该方法处理花粉是一个生物化学方法, 能在常温、常压下进行, 其效率只与生产规模和产 () 品额定量有关, 不受机械设备规格大小、性能约束。与气流破壁法比较 表 3, 每生产 100 破 k g 壁花粉, 可节约工时 228 个, 每生产 100 破壁花粉提取液, 可节约工时 36 个。k g 315 该法采用蛋清处理液作为花粉破壁和提取的关键, 原材料来源广泛, 操作程序简短, 各级 残留物如蛋壳、蛋黄及蛋清经处理后的沉淀物可加工成其他添加剂或食品, 因而对环境无污 染, 节省能耗。 图 1 花粉破壁程度的分级图示 . 1 F igC la ssif ing by th e ex ten t io n o f b reak ing po llen w a ll 1 2为l|I 级破壁程度的花粉 2 2l|I 2、4、5 为; 2 ; 3is unb ro k enw a ll po llenis g radeb ro k en w a ll po llen 1 为未破壁花粉 级破壁程度的花粉 3、4、5 2 2为, 级破壁程度的花粉 6 2, ? ?; 6 a re a ll g radeb ro k en w a ll po llenis g rade 2.b ro k en w a ll po llen ( () 说明: 1、2、3、4、5 均为电子显微镜 6 000扫描图片, 6 为显微镜40×10图片。 : 1、2、3、4、5 X E xp lana t io nin f igu re ( )6 000. . 6 40×10.a re a ll scann ing e lec t ro n p ho to g rap h s XN ois m ic ro g rap h 表 3 节约能耗和工时 23 T ab le Sav ing ene rgy co n sum p t io n and m an ho u r 产物破花粉壁 破壁花粉提取液 P ro duc t B reak ing po llen w a ll 2 E x t ract ive so lu t io n o f b ro ken w a ll po llen ()破壁率 % 耗能、工时 R a te o f b reak 耗能100 2 ƒ工时数ƒ100 耗能ƒ100 k g k g 技术 k g E ne rgy 类工时数100 ƒk g ()% co n sum p t io ning w a ll 别 N um be r o f m an E ne rgy co n sum 2 E ne rgy co n sum p t io nƒ N um be r o f m an T ech n ica l 2 m an ho u r100 ƒp t io n 100 k g 100 k g ƒho u rk g 100 ƒho u rk g c la ss 耗电 257 耗电 975 W W 气流粉碎 Pow e r co n sum 2 Pow e r co n sum p t io n 300 84 68 A irf low sm a sh ing 975 p t io n W 257 W 耗 电 7 或 耗 煤W 蛋清破壁 耗煤 015 t 01075 t Co a l co n sum p 2 E gg w h ite b read ing 72 48 100 Pow e r co n sum p t io n 7 t io n 015 t w a ll W o r Co a l co n sum p 2 1075 0t io n t 3 本表来自南京同仁堂制药厂为转让该技术提供的。 3 .T h is tab le is p ro v ided w ith N an jin T o ng R en T ang p h a rm aceu t ica l fac to ry to t ran sfe r th e po sse sio n o f th is tech n ique 参考文献 1 . 22. . . 1975,JH e slop H a r r iso n Incom p a t ib ility and th e Po llen S t igm a in te rac t io nA nnR evP lan t P h y sio lo gy 26: 403, 25 2 Ka rge r, Ge rh a rd. V e rfah ren zum A uf sch lie ssen vo n B lu tenpo llen, E u rop a isch e s P a ten tam t, A 61K , 80103025. 5, 30. 05. 80 -THE STUDY O F POLL EN W ALL BRO KEN BY EGG W H ITE L uo M an , J ian g L ik e )(230036 , , T h e D ep a r tm en t of biolog ica l en g in ee r in g A n h u i a rg u icu l tu re u n iv e rs ity H efe i A bstra c t Po llen co n ta in s m an y k in d s o f n u t r ien t com po n en t s n eeded b y th e h um an race an d . h a s h igh e r n u t r it io n a l an d n ea lth y va lu ab le sB ecau se th e re is po llen in th a t is com po sed o f 、, ca ro ten e an d ca ro teno r de sto an d is stab le to p h y sic sch em ist ry an d en zym ein th e o u t side r o f , . po llen th e fu r th e r p ro ce ssin g o f po llen is affec tedT h is a r t ic le dea ls w ith th e m e tho d o f 2. . po llen w a ll b ro k en b y egg w h iteT h is m e tho d w a s co n c lu ded f rom lo n g t im e stu d ie sIn 634, 2co n t ra st w ith M ic rococcu s ly sod e ik t icu s w e d isco ved th e p ep t ideg lycan in po llem o u te r . 2, w a llT h is no t o n ly p ro v ided th e b a se s fo r stu dy in g o n th e m e tho d o f po llen b ro k en b u t a lso .w a s ab le to u se in th e p ro du c t io n o f m an y po llen p ro du c t s , , , 2, Key word s Po llen Po llen in E gg w h iteB reak in gw a llP ep t ido g lycan