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【doc】两例Y染色体嵌合核型患者AZF区域基因微缺失研究

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【doc】两例Y染色体嵌合核型患者AZF区域基因微缺失研究【doc】两例Y染色体嵌合核型患者AZF区域基因微缺失研究 两例Y染色体嵌合核型患者AZF区域基因 微缺失研究 中华匿堂遗传学杂志2Q呸年1o月第24卷第5期ChinJNedGenet,Oetober2OO7,Vo1.24,N0.5 两例Y染色体嵌合核型患者AZF区域基因微缺失研究 吴意尹利华陆学东周晓梅姚丽萍黄维加肖桂初朱国都 【摘要】目的研究精索静脉曲张并发无精症患者Y染色体AZF区域的细胞分子遗传学机制以及 AZF区域基因微缺失与性激素水平的相关性.方法采用多重聚合酶链反应技术对2例外周血染色体常 规筛查核型...
【doc】两例Y染色体嵌合核型患者AZF区域基因微缺失研究
【doc】两例Y染色体嵌合核型患者AZF区域基因微缺失研究 两例Y染色体嵌合核型患者AZF区域基因 微缺失研究 中华匿堂遗传学杂志2Q呸年1o月第24卷第5期ChinJNedGenet,Oetober2OO7,Vo1.24,N0.5 两例Y染色体嵌合核型患者AZF区域基因微缺失研究 吴意尹利华陆学东周晓梅姚丽萍黄维加肖桂初朱国都 【摘要】目的研究精索静脉曲张并发无精症患者Y染色体AZF区域的细胞分子遗传学机制以及 AZF区域基因微缺失与性激素水平的相关性.方法采用多重聚合酶链反应技术对2例外周血染色体常 规筛查核型异常,精索静脉曲张并发无精症患者外周血有核细胞和睾丸活检精原细胞同时进行分子遗传 学检测,PCR产物经DNA测序检测证实,并测定血清中性激素六项.结果核型为45,X/46,XY,del(Y) (ql1.21);45,X/46,XY,del(Y)(ql1.23),二位患者外周血有核细胞和睾丸活检精原细胞AZF区域15个标签 位点分别只扩增出sY84和SY86;sY86,其它区域位点均未检测到.血清性激素六项中睾酮,人促卵泡激素 和人促黄体生成激素明显低于正常人水平.结论精索静脉曲张并发无精症患者Y染色体AZF区域的单 细胞水平缺失与外周血基因组缺失保持一致,AZF区域基因微缺失对性激素水平可能有一定的影响. 【关键词】精索静脉曲张;无精症;基因微缺失;性激素 在不育症男性中,除了已知睾丸前性(内分泌异常,神经因 素等),睾丸性(先天性遗传疾病,炎症感染等)和睾丸后性(输 精管因素等)病因外,约60%属原因不明者,在这些患者中,相 当部分表现为无精症,少弱精症.从生精上皮的干细胞发育到 成熟精子是一个独特而复杂的持续过程,其中任何一个环节异 常均可导致男性不育.近年来,随着细胞遗传学和分子生物学 的进展,人类对Y染色体的认识有了更深入的了解.目前已公 认:在人类精子发生的影响因素中,遗传缺陷占30%.早在 1976年Tiepoli和Zuffardi在研究无精症患者中,发现Y染色体 长臂远端的荧光区和与之相连的非荧光区存在缺失,因此推测 Yql1存在着Y染色体精子生成基因或基因家族(AZF),称为 "无精子因子".实验研究证明:Y染色体基因微缺失是引起男 性不育的主要原因之一_1].为了研究精索静脉曲张并发无精 症患者Y染色体AZF区域基因微缺失发生机制以及寻找其患 者血清激素水平特异性指标,我们做了相关项目检测. 1对象与方法 1.1对象选择2例深圳地区大型综合医院和生殖助孕专科 医院染色体常规筛查均为嵌合体核型,并按照世界卫生组织 (WHO)标准严格确诊为无精症和精索静脉曲张的不育患者. 1.2方法 1.2.1确定Y染色体AZF区域15个序列标签位点(sequence taggedsites,SrS)分别是:A2Fa区的sY82(264bp),sY84(326bp), sY86(32obp);AZFb区的s'~124(109bp),SY127(270bp),SY128 (228bp),SY133(177bp),SY134(301bp),SY143(310bp);AZFc 区的sY239(2oobp),SY242(230bp),SY254(380bp),SY255(126 bp);AZFd区的SY145(140bp),SY152(125bp).15个标签位点 引物序列由亚能生物技术(深圳)有限公司所提供. 1.2.2设立内控引物片段SR'~(470bp),同时设正常男性的阳 性对照及空白对照. 1.2.3PCR检测常规提取外周血有核细胞基因组DNA和睾 作者单位:518033广东医学院附属深圳市第四(福田)人民医院检 ,周晓梅,黄维加,肖桂初,朱国都);湖南省怀化 验医学部(吴意,陆学东 医学高等专科学校检验系(尹利华,姚丽萍) 通信作者:尹利华,Email:ylhl121@.163.tom ? 607? ? 研究? 丸活检精原细胞DNA;PCR反应总体系为25,包括去离子 水,缓冲液,dNTP,DNA聚合酶及模板;扩增条件为:50?10 min,95?15min;94?30s,58~C60s,72?60s共34个循环;最 后72?10min. 1.2.4电泳检测PCR产物用2%琼脂糖电泳,先用电压 8V/era电泳约3min使DNA迁移出上样孑L,降低电压至4V/era 使溴酚蓝迁移出2,3em,经凝胶成像系统进行DNA电泳条带 分析. 1.2.5DNA测序PCR产物经凝胶电泳吸附纯化后用3100型 DNA全自动测序仪证实了检测结果的真阳性. 1.2.6性激素检测采用贝克曼ACCESS全自动免疫化学发 光仪测定患者血清中人促卵泡激素,人促黄体生成激素,催乳 素,孕酮,睾酮,雌二醇. 2结果 2.1多重PCR检测均扩增出正常男性对照组15个SIS及 内控片段,空白对照无任何DNA产物出现,见图1. 2.2病例1的核型其为45,X/46,XY,del(Y)(ql1.21),外周 血有核细胞和睾丸活检精原细胞AZF区域15个标签位点均 bp 2000 1000 750 500 250 100 图1多重PCR电泳结果M:DNA分子量标准;2,6,10,14:分别为空白 对照;1,5,9,13:为正常男性15个STS及内控片段sRY;1:电泳条带从上 至下分别为SRY,SY254,SY143,SY242,SY255;5:电泳条带从上至下分别 为SRY,sY84,SY239,SY152~9:电泳条带从上至下分别为SRY,SY86, SY127,SY145,SY124;13:电泳条带从上至下分别为SRY,SY134,S~82, SY128,SY133:8:病例1的sY84阳性;11:病例2的SY86阳性;12:病例1 的SY86阳性 ? 608?匿堂望堡堂苤查l0箜24卷第5期ChinJMedGenet,October2007,Vo1.24,No.5 只扩增出sY84和SY86,其它SIS均未检测到. 2.3病例2的核型其为45,X/46,XY,del(Y)(ql1.23),外周 血有核细胞和睾丸活检精原细胞AZF区域15个标签位点仅扩 增出SY86,其它SIS均未检测到. 2.4实验检测2份血清标本的睾酮,促卵泡激素,促黄体生 成激素均明显低于正常人激素水平,孕酮,雌二醇,催乳素3项 结果均正常. 3讨论 目前研究所知,Y染色体基因微缺失除少数为遗传所致 外,大部分为再发现象,Y染色体基因微缺失的种类与途径目 前仍在研究中,但AZF缺失的总体机制已公认为是AZF区域内 大量的发生在同源序列间的非同源性重组所造成的.其严格 的基因型与表型的关系尚不清楚:6区域缺失者_2J,精子发 生阻滞在青春期前阶段,缺失者75%表现为仅有Sertoli细胞和 小睾丸,25%精子生成受抑制而表现为严重少精子,当AZFa区 多个大片段缺失时,呈现出同样严重的表型,病理表现为Sertoli 细胞综合征(SCOS)I型,无精原细胞出现.AZFb区域缺失者, 精子发生阻滞在青春期减数分裂前或减数分裂期间,与无精子 或严重少弱精症相关,通常病理表现为精子成熟障碍,生成受 阻在精母细胞阶段,睾丸内只有精原细胞和初级精母细胞,精 液中无成熟精子.AZFc区域缺失者.其表现为多样化,精子计 数多数为少弱精且伴有精子形态异常,少数精液常规正常且生 育正常.病理表现为与sc0S?型相关,睾丸支持细胞,精原细 胞,初级精母细胞,精细胞,成熟精子均有出现. 本实验结果显示患者AZFa区域虽有多个大片段缺失,但 患者睾丸活检组织中仍有精原细胞的出现,说明细胞分化受阻 于精母细胞阶段.Sun等_3J报道AZFa区缺失可能与某些病毒 感染引起的基因重组有关.至于缺失发生的时间,有人推测可 能起源于精子发生的减数分裂期或早期胚胎细胞分裂异常_4J. 减数分裂期,减数分裂后期细胞以及睾丸内成熟精子都对致突 变物敏感,易于引起遗传学的改变.如果带有Y染色体基因微 缺失的精子受精,便可发育成精子发生障碍的男性个体;另外, 这种缺失也可能是由于胚胎早期发育时DNA在复制过程中形 成了嵌合体个体,而睾丸又由带Y染色体基因微缺失的细胞发 育而来,其嵌合体核型中无正常男性核型出现,所以患者外周 血有核细胞和睾丸精原细胞的AZF微缺失保持一致.但如果 外周血检测没有AZF缺失,其睾丸细胞有AZF缺失,这就说明 外周血有核细胞中部分带有正常染色体核型;外周血检测有 AZF缺失,其睾丸细胞没有AZF缺失,上述病例核型及结果就 无法由生殖细胞系嵌合来解释_5J.因此,要保持Y染色体AZF 区域的单细胞水平缺失与外周血基因组缺失一致,必须是外周 血有核细胞中染色体男性基因组出现异常.Siffroi等_6J证明Y 染色体长臂大的微缺失与Y染色体的不稳定性有关.精索静 脉曲张是精索蔓状静脉丛的病理性扩张,可导致男性生精障 碍.Moro等[]报道了精索静脉曲张与Y染色体基因微缺失共 存,在40例精索静脉曲张伴严重少精子症中发现7例Y染色 体基因微缺失(17.5%);Martinez等_4J研究认为AZF缺失可以 引起双侧睾丸严重损伤.而精索静脉曲张可能加重了精子生成 障碍或者其只是微缺失的一个表现型,而在国内少见此类病例 报道. 文献资料表明[83,睾酮是睾丸间质Leydig细胞所产生的, 除具有维持男性第二性征和性功能作用外,睾酮分泌减少将导 致精子发生减缓.促卵泡激素主要促进精子生成和成熟,在青 春期促卵泡激素可促进睾丸重量增加和曲细精管直径增大. 促黄体生成激素可刺激Leydig细胞合成和分泌睾酮,并将睾酮 直接通过间质细胞作用于生精上皮细胞.实验发现无精症并 发精索静脉曲张患者睾酮,促卵泡激素和促黄体生成激素水平 都明显低于正常人.患者均为嵌合体个体,都带有45,XO核 型,虽有部分异常Y染色体,但仍然出现小睾丸,这可能与Y染 色体上生精相关基因家族(AZF)受损或睾丸决定因子(TDF)表 达异常所致.由于小睾丸大多数都功能不全,因此分泌T的水 平下降;而促卵泡激素的不足又导致睾丸的发育不良,促黄体 生成激素水平又进一步影响了睾酮的分泌.目前国内外还未 找到AZF基因微缺失相关的特异性血清学指标,由于本次实验 所选病例的特殊性及标本数目的局限性,因此实验结果还需进 一 步研究证实. 目前国内外Y染色体基因微缺失检测广泛应用于指导Ic— sI辅助生育治疗,精子库的入库精子质量筛查,不孕不育患者 的遗传学病因检查,男性泌尿生殖系统功能障碍等.近几年来 国内研究发现,AZF缺失患者通过ICSI辅助生育治疗可将缺失 基因遗传给下一代.影响下一代的生育能力,所以在选择胚胎 时,应通过植入前遗传学诊断切断遗传途径,选取女性胚胎移 植;对于生殖细胞嵌合体的男性也可选择正常男性胚胎.虽然 父代可将Y染色体基因微缺失遗传给子代,但子代的遗传表型 可能与父代有所不同,还不能完全预测其不育程度.当精子生 成障碍,男性泌尿生殖系统功能障碍的真正原因为AZF缺失 时,应避免一些不必要的手术或药物治疗. 参考文献 lNingYL,"LS,RenHJ.Etiologicalgeneticanalysisofprimaryazoespar? miapatients.Ch/nJBirthHealthHered,2OO2,10:58-59.[宁郁玲,李莉 莎,任洪进.原发性无精子症患者遗传学病因分析.中国优生与遗 传杂志,2002,10:58.59.] 2Kent—FirstM,MuallemA,ShuhzJ,eto1.DefiningregionsoftheY-chro— m0sresponsibleformaleinfertilityandidentificationofafourthre— gion(AZFd)byY.chromosome,microdeletiondetection.MolReprodDev, l999.53:27-41. 3SunC,SkaletskyH,RozenS,et01.Deletionofazoospermiafactora(AZ— Va)regionofhumanYchromosomeCallS~byrecombinationbetween HERV15provimse~.HumMolGenet.200o.9:229l一2296. 4MartinezMC,BemabeMJ,GomezE,et01.ScreeningforAZFdeletionina largeseriesofseverelyimp~reaspermatogenesispatients.JAndrd,2O0O, 21:651-655. 5Kent—FirstMG,KolS.MuallemA,et01.Theincidenceandpossiblerele. vanceofY-linkedmicroddetionsinbabiesbemafterintracytoplasmicsperm iniectionandtheirinfertilefathers.MolHumReprod.1996.2:943—950. 6Si_miJP.LeBourhisC,KranszC,et01.Sexchromosomemosaicismin malescarryingYchromosomelongal'mdeletions.HumReprod,2O0O,15: 2559—2562. 7MoroE.MarinP.RossiA.et01.Ychromosomemicrodeletionsininfertile menwithvaricocele.MolZEndocrino1.200o.161:67—71. 8HuangYF.Xu砌.AndrologyDiagnosis.Shanghai:SecondMilitaryMedi— calUniversityPress,1999.388.[黄宇烽,许瑞吉.男科诊断学.上海: 第二军医大学出版社,1999.388.] (收稿日期:2O06.130) (本文编辑张丽玲)
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