芍药Actin基因原核表达载体的构建

芍药Actin基因原核表达载体的构建 河南科技大学本科生毕业论文 芍药Actin基因原核表达载体的构建 摘 要 肌动蛋白是细胞骨架的重要成分，在细胞中的表达量大且恒定。大肠杆菌培养操作简单、生长繁殖快、价格低廉，大肠杆菌表达外源基因是最常用的一种异源表达系统。本研究应用限制性内切酶BamH I和Hind III对pMD18-T-Actin重组质粒和空载体pET-32a进行双酶切，琼脂糖凝胶电泳后用凝胶回收试剂盒纯化目的基因Actin和空载体pET-32a，然后将二者用连接试剂盒连接并转化感受态大肠杆菌DH5α，涂布在含有Amp的LB平板上进行过夜培养。挑取生长良好的单菌落，接种于含有Amp的LB培养基中用于菌落PCR鉴定。经菌落PCR初步检测后，挑取阳性单菌落过夜培养后提取质粒，质粒PCR进一步检测后，最后再进一步用BamH I和Hind III酶切重组质粒，结果表明酶切产生的两条DNA条带与载体条带和目的条带的大小一致，进一步说明原核表达载体构建成功。由此表明我们成功构建了芍药Actin基因的原核表达载体，为下一步应用大肠杆菌原核表达系统诱导表达芍药肌动蛋白奠定了基础。 关键词:芍药，Actin，原核表达载体 I 芍药基因原核表达载体的构建 Actin Construction of Prokaryotic Expression Vector of Peony Actin Gene ABSTRACT Actin is an important component of cytoskeleton, expressed largely and constantly in the cell. The cultivation of E. coli is simple, the growth and reproduction is fast, and cost is low, exogenous genes expressed in E.coli is the most commonly used one of heterologous expression systems. For the material of pMD18-T-Actin recombinant plasmid and empty carrier pET-32a, firstly, using BamH I and Hind III to have a double enzyme digestion, secondly after agarose gel electrophoresis using gel recycling kit to purificate actin gene and empty carrier pET-32a, connecting and transforming competent E. coli DH5 alpha, besmearing on LB tablet containing Amp, and conducting the overnight culture.Picking single colony which is growing well, vaccinating in LB culture medium containing Amp for colony PCR. After preliminary inspection by colony PCR, extracting plasmid from positive single colony after the overnight train, and conducting PCR detection of plasmid. Eventually use BamH I and Hind III enzyme to construct recombinant plasmid. According to the experimental results, two DNA bands which is produced by enzyme digestion and the carrier belt and purpose belts is of the same size, further clarificating that the construction of Prokaryotic expression vector is successful. Thus indicated that we successfully build the prokaryotic expression vector of herbaceous peony Actin gene, laid the foundation for further application of E. coli prokaryotic expression system inducing expression of paeonia lactiflora Actin. KEY WORDS:Peony, Actin, prokaryotic expression vector II 河南科技大学本科生毕业论文 目 录 摘 要 ......................................................................................................................................... I ABSTRACT ...............................................................................................................................II 目 录 ...................................................................................................................................... III 符号说明 ................................................................................................................................... V 第一章 文献综述 .................................................................................................................... 1 1.1 芍药概述 ............................................................................................................. 1 1.2 肌动蛋白的研究 ................................................................................................. 1 1.3 原核表达载体 ..................................................................................................... 3 1.4 大肠杆菌原核表达系统 ..................................................................................... 4 1.5 本项研究的目的和意义 ..................................................................................... 5 第二章 实验部分 .................................................................................................................... 6 2.1 实验材料、仪器与试剂 ..................................................................................... 6 2.1.1 菌株材料 .................................................................................................. 6 2.1.2 主要药品与试剂 ...................................................................................... 6 2.1.3 主要仪器 .................................................................................................. 6 2.1.4 主要溶液及配制 ...................................................................................... 6 2.2 实验 ............................................................................................................. 7 2.2.1 对重组质粒和表达载体的双酶切 .......................................................... 7 2.2.2 回收重组质粒和表达载体的酶切产物 .................................................. 7 2.2.3 目的片段的连接 ...................................................................................... 7 2.2.4 大肠杆菌感受态细胞的制备 .................................................................. 7 2.2.5 热激法转化大肠杆菌 .............................................................................. 8 2.2.6 菌落PCR检测 ........................................................................................ 8 2.2.7 质粒DNA的提取 ................................................................................... 9 2.2.8 质粒PCR检测 ........................................................................................ 9 2.2.9 酶切鉴定 ................................................................................................ 10 2.3 结果与分析 ........................................................................................................11 2.3.1对重组质粒和表达载体的双酶切 ..........................................................11 2.3.2 Actin基因和表达载体的回收纯化 ....................................................... 12 2.3.3 阳性克隆鉴定 ........................................................................................ 12 2.3.4 Actin基因的酶切验证 ........................................................................... 13 2.4 讨论 ................................................................................................................... 14 2.5 结论 ................................................................................................................... 14 III 芍药基因原核表达载体的构建 Actin 参考文献 .................................................................................................................................. 15 致 谢 ...................................................................................................................................... 18 附 录 ...................................................................................................................................... 19 英文 .................................................................................................................................. 20 IV 河南科技大学本科生毕业论文 符号说明 缩略词 中 文 EDTA 乙二胺四乙酸 Amp 氨苄青霉素 LB Luria-Bertani培养基 PCR 聚合酶链式反应 Tris 三羟甲基氨基甲烷 V 河南科技大学本科生毕业论文 第一章 文献综述 1.1 芍药概述 芍药(Paeonia lactiflora Pall.)为芍药科(Paeoniaceae)芍药属(Paeonia L.)芍药组(Sect. Paeonia)的多年生宿根草本植物，是原产我国的传统名贵花卉，也是世界著名花卉，享有“天下第一娇”的美称，是重要的观赏性植物和资源植物。另外还是常用的中草药。我国是世界上芍药属植物的自然分布中心和多样性中心，资源极其丰富。芍 [1-2]药在我国有3000多年的栽培历史。中国曾以芍药为荣而被世界誉为“芍药之母”。 芍药是典型的温带植物，但其生态适应幅度大，因此分布广，枝叶苍翠欲滴，花朵娇艳美丽，在园林中被广泛应用，耐寒怕热亦耐热，冬季可耐-46(5?的低温。芍药喜光，光照充足，才能生长繁茂，花色艳丽，但也能耐一定的树荫，在花期遮荫能避免阳关灼晒，延长花期。芍药是长日照植物，秋冬短日照季节分化花芽，春天长日照下开花，花蕾发育和开花，均需在长日照下进行，若日照时间过短(8~9 h)，会导致花蕾发育迟缓，叶片生长加快，开花不良，甚至不能开花。耐干旱不需多灌溉，但若缺水财花朵瘦小，花色不艳。深根系植物，要求土壤深厚，适宜疏松且排水良好的砂质壤土，以中性或微酸性土壤为宜，土壤含氮量不宜过高以防枝叶徒长，生长期可适当增加磷、钾肥以 [3]促使枝叶茁壮生长、开花美丽。 因为其花朵硕大，花色艳丽，花形美观，花香馥郁，所以芍药深受我国百姓喜爱，常被喻为人民富贵吉祥、国家繁荣昌盛的象征;不仅如此，芍药在引种到国外后，同样符合西方的审美观念，象征着正义和仁慈，代表着幸福与甜美，目前已在美国、法国、 [4]荷兰等50多个国家广为种植，成为世界性的名花。 1.2 肌动蛋白的研究 [5-10]肌动蛋白是细胞中一种重要的蛋白质，是细胞骨架的成分。肌动蛋白最初是1941年在脊椎动物骨骼细胞中发现并命名的。在肌肉细胞中，肌动蛋白聚合成丝状，组成肌肉的细丝，与由肌球蛋白形成的粗丝相互滑动，产生宏观的肌肉收缩现象。1952年，Loewy从粘菌中提取到肌动球蛋白。这是从非肌细胞中分离到的第一种球蛋白。1963年，我国阎隆飞等人首次报道了高等植物中存在肌动蛋白，并对肌动蛋白的研究工作做出了重要的贡献。 生物体中包含7个肌动蛋白基因，编码不同的肌动蛋白同工蛋白质。等电聚焦电泳分析表明存在着A-、B-和C-肌动蛋白。它们含有较多的酸性氨基酸，其等电点约为5.5，A-肌动蛋白的等电点最低(pI=5.4)。等电点的不同是由于其氨基端的残基的变化所引 [11-13]起的。肌动蛋白(Actin)由多个基因组成的家族所编由375~377个氨基酸残基组成， 1 芍药基因原核表达载体的构建 Actin [14-18]分子量42 KD左右的球形蛋白质，并且是由一个大的、高度保守的基因编码。氨基酸序列分析资料表明，肌动蛋白异型包含两大类主要肌动蛋白:细胞质来源的和肌肉来源的肌动蛋白。除了线虫类精子细胞，在所有的真核细胞当中均发现有该蛋白质。肌动蛋白是真核细胞中最丰富的蛋白质。所有的器官组织均有细胞质来源肌动蛋白，通常是用于构成细胞微丝。在肌细胞中，肌动蛋白占总蛋白的10%，即使在非肌细胞中，肌动蛋白也占细胞总蛋白的1%~5%。在肌原纤维中肌球蛋白居第一位，而肌动蛋白约占总蛋白的1/4(20%-25%)，居第二位。肌动蛋白肌纤维组成直径约36-37 nm的双螺旋。肌肉中的肌动蛋白形式主要是纤维形式即F-肌动蛋白，这是G-肌动蛋白的多聚形式。肌动蛋白上有三个结合位点，一个是ATP结合位点，另两个都是与肌动蛋白结合的结合 [19-20]蛋白结合位点。 肌动蛋白，是微丝的结构蛋白，以两种形式存在，即单体和多聚体。单体的肌动蛋白是由一条多肽链构成的球形分子，又称G-肌动蛋白(globular actin，G-actin)，外形类似花生果。肌动蛋白一般以其多聚化的形式发挥功能。在多聚化过程中，结合的ATP [21-23]分子水解为ADP。 肌动蛋白至少表达成6种异构形式，分为α、β、γ三种类型根据等电点的不同可将高等动物细胞内的肌动蛋白分为3类，α分布于各种肌肉细胞中，β和γ分布于肌细胞和非肌细胞中。有三种α肌动蛋白(骨骼肌、心肌和平滑肌)、一种β肌动蛋白和两种γ肌动蛋白(γ平滑肌和γ非平滑肌)。肌动蛋白在镁、钾离子和ATP作用下，可以形成具有极性的双螺旋丝状聚合体，肌动蛋白以聚合状形式完成生理功能。在生物分子演化当中，肌动蛋白是被高度保留下来的蛋白质分子之一，从藻类细胞到人体细胞肌动蛋白只有不到20%的变化。肌动蛋白是一种高度保守的蛋白质，是生物体中微丝的一个单节结构，而微丝则是细胞骨架三大组成结构之一，肌动蛋白还构成了肌细胞中具有收缩 [24-26]功能的组织。简单的真核生物，如酵母或粘菌，通常含单个肌动蛋白基因，仅合成一种肌动蛋白，大多数真核生物细胞含有多个肌动蛋白基因，其表达产物组成肌动蛋白异构体。肌动蛋白主要存在于细胞质中，是细胞骨架微丝的主要成分，对于多种细胞功能都是必需的， 在细胞中肌动蛋白结合蛋白调控下，肌动蛋白微丝的长度、极性、稳定性和三维结构处于动态变化之中，并将肌动蛋白纤维与细胞浆和细胞膜的其它成分相连接，从而调节肌动蛋白的理化状态，藉以完成多种细胞功能，参与细胞分裂、细胞运 [27-30]动、细胞迁移、细胞形态维持、细胞生长、内吞和外排作用以及其他重要生理事件。 高等植物肌动蛋白与动物及真菌肌动蛋白基因一样，属于多基因家族基因，由多基 [31]因编码。不同生物肌动蛋白具有高度保守性，这些基因高度相似，通过多轮复制由一 [32]个基因祖先进化而来。细胞质来源肌动蛋白，构成细胞微丝，肌肉中的肌动蛋白主要是纤维形式即F,肌动蛋白。肌动蛋白基因编码序列是高度保守的，而非编码序列有较大的差异，反映其进化上的时间进程。高等植物肌动蛋白在进化过程中保持高度的保守性和同源性，且具有组织和器官特异性的表达。人们已经克隆出花粉发育后期表达基因且在转基因植物中得到表达。将营养细胞特异的番茄花药发育后期表达基因lat52导入 2 河南科技大学本科生毕业论文 烟草，可与报告基因融合，获得转基因烟草。Mascarenhas(1989)使用Northern杂交技术研究玉米和紫鸭跖草花粉肌动蛋白基因的表达，发现肌动蛋白基因的表达受发育的控制。在四分体和小孢子时期，肌动蛋白基因不转录，直到花粉形成的早期才开始表达，并且mRNA不断地积累，当花粉形成时，肌动蛋白的表达最旺盛。拟南芥(Arabidopsis thaliana)的肌动蛋白基因分两类——营养体基因和生殖细胞基因，在发育后期由营养体基因的表达转为花粉特异肌动蛋白基因的表达，从而满足受精的需要。以肌动蛋白基因为目标的雄性不育基因已构建并且在转基因小麦和番茄上得到正确表达，这不仅为雄性不育基因工程开辟了一条新途径，而且为这两种重要经济作物的杂种优势打开了方便之门，还为包括单子叶作物和双子叶作物在内的所有自花授粉作物的杂种优势利用提供了理论和实践的重要参考。随着越来越多的肌动蛋白基因的克隆和序列测定，对基因本身结构、功能和表达的分析越来越精确，从而促进了肌动蛋白基因在作物改良上的应用研究。 动物的β肌动蛋白基因一般位于染色体2q。应用原位DNA/染色体杂交技术定位了鸡的β一肌动蛋白和GH基因。大量的基因序列资料表明，肌动蛋白有一些引人注目的特征，其编码序列是高度保守的，而非编码序列有较大的差异，反映其进化上的时间进程。对30多种不同异型肌动蛋白的原始氨基酸序列(最长的375个氨基酸)分析表明，最多只有32个残基可以被取代。不同动物的肌肉特异性和非肌肉特异性的异型肌动蛋白编码基因之间具有保守程度的不同;虽然有6个或更多个基因编码肌动蛋白，但该蛋白质具有高度保守的氨基酸序列。 拟南芥中共有10个肌动蛋白基因家族，产生肌动蛋白基因家族的原因还不十分清楚，或许是小基因片段的复制，或许是基因组的大量重排，它们分散于4条染色体上(1，2，3，5)。通过对肌动蛋白基因家族的系统分析，将其分为营养型肌动蛋白(vegetative actin)和生殖型肌动蛋白(reproductive actin)，其表达具有组织特异性，并且在大多数 [33]组织和器官中往往有2种以上的肌动蛋白异型体同时大量表达。 细胞骨架参与植物体内许多动态的生理过程，由肌球蛋白(myosin)以及动蛋白(kinesin)基因家族所构成的分子马达在将化学能转变为机械能的过程中发挥着重要作[34]用。细胞对信号刺激产生反应的过程，直接与微丝骨架密切相关，很多重要的生理过程依赖于单体肌动蛋白的聚合、聚合微丝网络的形成与定位、微丝的解聚以及单体肌动 [35]蛋白库的维持。 1.3 原核表达载体 使已经被克隆的外源基因在细胞中实现表达无论对理论研究还是实践应用都具有 [36]十分重要的意义。克隆的目的基因只有通过表达才能探索和研究基因的功能以及基因表达调控的机理，克隆目的基因表达出的编码蛋白可供结构与功能研究之用。有些具有特定生物活性的蛋白质在医学上和在工业上都是很有应用价值的，可以克隆其基因使之在宿主细胞中大量表达而获得。要使克隆基因在宿主细胞中表达，就要将它放入带有基 3 芍药基因原核表达载体的构建 Actin 因表达所需要的各种调控元件的载体中，这种载体就称为表达载体。 表达载体的结构比克隆载体复杂，除了必须具备与克隆载体相同的复制原点、多克隆位点和筛选标记基因以外，还必须具备控制目的基因表达的调控序列，包括启动子、转录终止子等。此外，克隆到表达载体上的目的基因也必须具有完整的起始密码子、终止密码子和核糖体结合位点，才能产生完整的目的蛋白。表达载体分为四部分:目的基因、启动子、终止子、标记基因。常用细菌质粒进行构建，构建过程中运用限制性核酸内切酶切割出与目的基因相合的末端(多为黏性末端，也有平末端)，采用DNA连接酶连接，导入生物体实现表达。标记基因可帮助识别质粒并检测是否成功整合到染色体 [37-39]DNA中。构建有效的表达载体将是表达目的基因之前提条件，同时也是影响表达水平及蛋白活性重要因素。 本实验选用的表达载体是pET-32a空载体。pET系列载体是带有T噬菌体启动子7的载体，包括如pET5、pET15、pET16、pET28、pET30、pET32、pET42等，每套均由a、b、c 3个载体组成，以方便目的基因以与His6序列同框的方式插入。pET系列载体的优点是:一是大肠杆菌通常在进行原核表达实验时，选择使用PET系列载体居多。PET系列载体不带有GFP基因，其上的His Tag标签是专门用于分离纯化的。二是PET系列的表达水平高，因为PET是使用T启动子，是目前原核启动子中表达水平最高的7 启动子。三是PET系统成功的主要原因是目标基因被克隆到不为大肠杆菌RNA聚合酶识别的T启动子之下，因此在加入T RNA聚合酶之前几乎没有表达发生。克隆到PET77 载体上的基因实际上是关闭的，不会由于产生的蛋白对细胞有毒性而引起质粒不稳定。重组质粒转移到染色体上含有一拷贝由Lac UV5控制的TRNA聚合酶的表达宿主中，7 并加入IPTG诱导表达。T噬菌体启动子，具有高度的特异性，只有TRNA聚合酶才77能使其启动，故可以使克隆在载体上的基因独立于宿主细菌基因组之外得到表达。TRNA聚合酶的效率比大肠杆菌RNA聚合酶高5倍左右，它能使质粒沿模板连续转录7 几周，许多外源终止子都不能有效地终止它的序列，因此它可转录某些不能被大肠杆菌RNA聚合酶有效转录的序列。T噬菌体RNA聚合酶对抑制大肠杆菌RNA聚合酶的抗7 生素有抗性。使用大肠杆菌启动子系统(如tac，lac，trc，pL)有困难的许多基因已经在PET系统中稳定克隆和表达。TRNA聚合酶的选择性和活性使得几乎所有的细胞资7 源都为目标基因表达。诱导后及小时目标产物就可超过细胞总蛋白的50%。 1.4 大肠杆菌原核表达系统 外源基因表达的宿主细胞可用大肠杆菌、枯草杆菌、酵母、昆虫细胞、培养的哺乳类动物细胞、以至整体动物。经过长期的研究，人们对大肠杆菌的特性和遗传背景了解得最清楚。大肠杆菌培养操作简单、生长繁殖快、价格低廉，人们用大肠杆菌作为外源基因的表达工具已有二十多年的经验积累，大肠杆菌表达外源基因产物的水平远高于其他基因表达系统，表达的目的蛋白量甚至能超过细菌总蛋白量的80%。因此大肠杆菌是目前应用最广泛的蛋白质原核表达系统。大肠杆菌作为外源基因表达系统的优点是:遗 4 河南科技大学本科生毕业论文 传背景清晰，相关的基因克隆操作比较成熟;所需营养简单、操作方便、遗传稳定、生长速度较快，外源蛋白的表达丰度较高(可达蛋白总量的30%)，可在短期内获得大量的目的蛋白;可将目标蛋白与标签序列融合表达以增强目标蛋白的可溶性并能简化后续的纯化过程;全基因组测序完成，共有4405个开放型阅读框架;被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物。但是由于中缺少真核生物的翻译后修饰系统，所得蛋白产物往往以无活性包涵体的形式表达。由无活性的包涵体恢复生物活性要经过复杂的变性和复性处理。另外，细菌表达系统与目标基因的所使用的密码子的偏爱性往往存在差异，为使目标蛋白得到有效的表达，常需对外源基因的原始遗传序列进行修饰。 外源基因表达的产物可能会对大肠杆菌有毒害作用，会影响细菌的生存繁殖，所以大多数表达载体都带有诱导性表达所需要的元件，即有操纵子序列以及与之配套的调控基因等。外源基因还应当插入到适合于表达的位置，所以表达载体中要设有适合的多克隆位点。此外还应具备基因克隆筛选的条件，包括在细胞中复制必需的复制起始序列、 [36]筛选标志如抗药性基因等。 1.5 本项研究的目的和意义 肌动蛋白(Actin)是真核生物细胞中普遍存在的一种重要的蛋白质，构成细胞骨架中的微丝(microfilament)系统，参与参与细胞分裂、细胞运动、细胞迁移、细胞形态维持、细胞生长、内吞和外排作用以及其他重要生理事件。 [40]Higheower等研究表明，植物和动物肌动蛋白之间存在11%~15%的差异， 水稻与玉米肌动蛋白之间的氨基酸存在8%~10%的氨基酸取代，大豆异形体之间仅存在6%~9%的氨基酸取代，由此可见，肌动蛋白基因是相当保守的。内参基因是在研究其他基因表达模式的时候作为参照的一个基因，在植物中常用16S RNA、组蛋白H3、GAPDH基因以及肌动蛋白基因等。在动物中，肌动蛋白基因主要由细胞质来源与肌肉来源两大 [41]类组成。高等植物的Actin基因是一种高度保守的看家基因，克隆Actin基因可以做为内参研究芍药代谢相关其他基因。 本研究构建Actin原核表达载体，为金属亲和纯化Actin重组蛋白，制备多克隆抗体，建立芍药Western杂交体系奠定基础。 5 芍药基因原核表达载体的构建 Actin 第二章 实验部分 2.1 实验材料、仪器与试剂 2.1.1 菌株材料 大肠杆菌 (Escherichia coli, E.coli) DH5α，pET-32a空载体，pMD18-T-Actin重组质粒。 2.1.2 主要药品与试剂 限制性内切酶Hind III和BamH I(宝生物工程(大连)有限公司); DL 2000 DNA Marker(宝生物工程(大连)有限公司); 质粒提取试剂盒(宝生物工程(大连)有限公司); DNA凝胶回收试剂盒(宝生物工程(大连)有限公司); Taq DNA聚合酶(宝生物工程(大连)有限公司); 引物:Actin-F:5'- ATGGCCGATGCTGAGGAT-3' Actin-R:5'- TTAAAAGCACTTCCTGTG-3' 其他试剂均为国产分析纯。 2.1.3 主要仪器 高速冷冻离心机，台式离心机，超低温冰箱，低温冰箱，恒温水浴锅，气浴恒温振荡器，烘箱，涡旋振荡器，微量移液器， PCR仪，电泳仪，电泳槽，紫外分析仪，紫外分光光度计，超净工作台，灭菌锅，液氮罐，凝胶成像分析系统。 2.1.4 主要溶液及配制 1、LB液体培养基:称取蛋白胨 (Tryptone) 10g，酵母提取物 (Yeast extract) 5 g，NaCl 10 g，加水至总体积1 L，高压下蒸气灭菌15 min。 2、LB固体培养基:液体培养基中每升加12 g琼脂粉，高压灭菌 3)感受态细胞制备所需试剂: 高压灭菌的0.1 mol/L CaCl:先配制1 mol/L的母液，即147 g CaCl?2HO，加水到2221 L，使用时稀释;高压灭菌过的30,甘油。 4)质粒DNA抽提所需试剂: 溶液I (pH8.0):50 mmol/L葡萄糖;25 mmol/L Tris-HCl;10 mmol/L EDTA; 溶液II:0.2 mol/L NaOH和1%SDS (现用现配); 溶液III (pH4.8):5 mol/L乙酸钾60 mL，冰乙酸11.5 mL，水28.5 mL，混匀。 5)氨苄青霉素 (Ampicillin, Amp):无菌水配置成100 mg/mL溶液，用滤膜抽滤，-20?保存。 6)琼脂糖凝胶电泳所需试剂: 5×TBE缓冲液:54g Tris，27.5g硼酸，20mL 0.5mol/L EDTA，ddHO补充至1L。 2 6 河南科技大学本科生毕业论文 7)SDS-PAGE电泳所需试剂: (1) 分离胶缓冲液:1.5 mol/L Tris-HCl (pH8.9); (2) 浓缩胶缓冲液:0.5 mol/L Tris-HCl (pH6.8); (3) 10% (W/V) 过硫酸铵; (4) 1×TE:10 mmol/L Tris-HCI (pH8.0)，1 mmol/L EDTA (pH8.0)，灭菌。 (5) 10% SDS 溶液:10g SDS，定容至100 mL，室温保存。 (6) 染色液:0.2g考马斯亮蓝R-250+42 mL乙醇+10 mL冰乙酸，定容至100 mL。 (7) 脱色液:5 mL冰乙酸+45 mL乙醇+50 mL水。 (8) 30%胶贮液:每100 mL中含有丙烯酰胺29.2 g，亚甲基双丙烯酰胺0.8 g，过滤备用。 (9) 200 mg/mL IPTG:取2 g IPTG溶于8 mL的无菌水中，再加水补至10 mL，用0.22μm滤膜过滤除菌，每份1 mL，-20?贮存。 (10) 2×上样缓冲液:0.5 g SDS，1mL 2-β-巯基乙醇，4 mg溴酚蓝，1 mol/L Tris-HCl (pH6.8) 2 mL，用蒸馏水溶解并定容至10 mL。 (11) 10×SDS电泳缓冲液:3 g Tris，14.4 g Gly，0.5 g SDS，加水定容至500 mL，调pH至8.3。 8、引物设计 应用Primer Premier 5.0软件设计引物如下，引物序列由华大基因公司合成。 Actin-F:5'- ATGGCCGATGCTGAGGAT-3' Actin-R:5'- TTAAAAGCACTTCCTGTG-3' 2.2 实验方法 2.2.1 对重组质粒和表达载体的双酶切 pET-32a空载体及pMD18-T-Actin的BamH I和Hind III双酶切体系为60 µL，其中10×Buffer 6 µL ，BamH I 9 µL，Hind III 9 µL ，质粒36 µL。于37?培养箱内酶切8 h。 2.2.2 回收重组质粒和表达载体的酶切产物 用1%琼脂糖凝胶对酶切产物进行电泳，用Takara MiniBEST Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.3.0.纯化空载体及目标片段 2.2.3 目的片段的连接 空载体与Actin基因的连接体系为15 µL，其中包括空载体1.5 µL，目的基因6 µL，Solution I 7.5 µL，在16?恒温水浴中连接1 h。 2.2.4 大肠杆菌感受态细胞的制备 A(用接种环直接取-80?超低温冰柜冻存的大肠杆菌DH5а细胞，在LB培养基(含Amp)表面划线，于37?培养16 h; B(挑取一个单菌落，转到3~5 mLLB液体培养基里，于37?培养过夜; C(将该菌种悬液以1:100的比例接种培养100 mL(含Amp)培养基里， 37?振 7 芍药基因原核表达载体的构建 Actin 荡培养2,3 h，直到A = 0.3~0.4。 600 D(将培养大肠杆菌的三角瓶置于冰浴中，预冷10 min; E(在超净工作台里，将大肠杆菌菌液转入10ML离心管中，在冰上放置10 min; F. 4?，4000 r/min 条件下，离心10 min，轻轻倒掉上清液，回收细胞，放在冰上拿回超净工作台; G(然后用4 ml 预冷的0.1 M CaCl2悬浮沉淀，冰上预冷30 min; H. 4?，4000 r/min离心10 min，弃上清液; I( 在超净工作台中，在离心管中加入0.8ml预冷的0.1 M CaCl2，悬浮沉淀加入0.2 mL75%的甘油(甘油终浓度为15%)，混匀，每管分装0.2 mL，于-80?保存。 2.2.5 热激法转化大肠杆菌 1)固体LB培养基的制备:提前制备好含100 μg/mL Amp的LB固体培养基。 2)将10 µL连接液加入100 µL解冻后的感受态细胞中。 3)轻轻混匀，冰浴30 min，42?水浴中热激90 s，然后迅速冰上放置3~4 min。 4)立即向上述管中加入0.8 mL LB液体培养基，混匀后于37?振荡培养1.5-2 h， r使含有重组子的大肠杆菌产生氨苄抗性 (Amp)。 5、将上述菌液转至1.5 mL干净的离心管中，4000 rpm离心5min，先吸取600 µL上清，再将细胞吹散成细胞悬液。 6)在超净工作台中将上述悬液直接涂布在含有氨苄的LB固体培养基上，做好相应标记，如基因名称和日期等。 7)待培养基表面菌液完全被培养基吸收后，将培养皿倒置于37?培养箱中过夜培养。 8)观察单菌落的生长情况，待菌落生长至适当大小时挑取单菌落进行阳性克隆的检测。 2.2.6 菌落PCR检测 8 河南科技大学本科生毕业论文 表2-1 菌落PCR扩增体系 组分 处理/µL 10×Buffer 2.0 dNTP 2.5 mmol/L 1.6 Mg2+ 25 mmol/L 1.6 Taq 酶 0.4 引物-F 10 pmol/µL 0.6 引物-R 10 pmol/µL 0.6 菌落(水代替) 1 ddH2O 12.2 总体积 20 PCR扩增程序为95?预变性5 min，然后95?变性45 s，52?退火45 s，72?延伸 1 min 10 s，共35个循环，然后72?延伸7 min，最后10?冷却59 min。用1%琼脂糖 凝胶对PCR产物进行电泳检测。 2.2.7 质粒DNA的提取 挑取菌落PCR结果为阳性的单菌落于37?摇床过夜摇菌，用Takara公司的质粒提 取试剂盒提取质粒。具体方法如下: (1)从平板上挑取菌落，接种到1~4 ml的含Amp的LB培养基中，37?过夜培养。 (2)取2 ml过夜培养菌液，12000 rmp 2 min. (3)重复上述步骤 (4)加入250微升的Sollution l，震荡器振荡使菌体充分悬浮。 (5)250微升的Sollution ll,上下翻转，使菌体充分裂解。 (6)350微升的Sollution lll，室温静置2 min (7)12000 rmp 10 min，取上清。 (8)500微升的Buffer BL 于Spin Column 中，12000 rpm 1 min，弃上清。 ，弃上清。 (9)将步骤7中的上清转到Spin Column 中，12000 rpm 1 min(10)500微升Buffer WA于Spin Column 中，12000 rpm 1 min，弃上清。 (11)700微升Buffer WB于Spin Column 中，12000 rpm 1 min，弃上清。 (12)重复步骤11。 (13)空离一次 (14)加入30微升灭菌蒸馏水，静置1 min (15)12000 rpm 1 min，洗脱DNA。 2.2.8 质粒PCR检测 9 芍药基因原核表达载体的构建 Actin 表2-2 质粒PCR扩增体系 组分 处理/µL 10×Buffer 2.0 dNTP 2.5 mmol/L 1.6 Mg2+ 25 mmol/L 1.6 Taq 酶 0.4 引物-F 10 pmol/µL 0.6 引物-R 10 pmol/µL 0.6 质粒DNA(水代替) 1 ddH2O 12.2 总体积 20 PCR扩增程序为95?预变性5 min，然后95?变性45 s，52?退火45 s，72?延伸1 min 10 s，共35个循环，然后72?延伸7 min，最后10?冷却59 min。用1%琼脂糖凝胶对PCR产物进行电泳检测。 2.2.9 酶切鉴定 T-32a载体在插入位点两侧分别有1个BamH I和Hind 所使用的pEIII的酶切位点，目的片段经PCR后在其两端引入这两个酶切位点，即双酶切后两者具有相同的黏性末端，可进行重组，重组的质粒经BamH I和Hind III双酶切后经琼脂糖凝胶电泳后会出现两条带，即载体和目的片段条带。 1)如下表所示配好酶切体系 (20μL); 2)混匀后，37?恒温反应3 h; 3)加入1.5μL 6×loading buffer混匀，以0.8,的琼脂糖凝胶电泳检测结果。 表2-3 酶切体系 组分 体积 (μL) 10×Buffer 2 重组质粒 2 BamH I 1 Hind III 1 ddHO 14 2 10 河南科技大学本科生毕业论文 2.3 结果与分析 2.3.1对重组质粒和表达载体的双酶切 pMD18-T-Actin重组质粒的酶切产物电泳结果如图2-1，从图中可以看出，重组质粒 被切成两个片段，一个是目的基因Actin，一个是比目的基因大一些的质粒。 M 1 5000bp 3000bp 2000bp 1500bp 1000bp 750bp 500bp 图2-1 重组质粒酶切产物电泳图 空载体pET-32a的酶切产物电泳图如2-2 M 1 5000bp 3000bp 2000bp 1500bp 1000bp 750bp 500bp 图2-2 pET-32a空载体酶切电泳图 11 芍药基因原核表达载体的构建 Actin 2.3.2 Actin基因和表达载体的回收纯化 图2-3为纯化后的Actin基因琼脂糖凝胶电泳图，从图中可以看到，条带清晰，说 明Actin基因纯度较高。 M 1 2000bp 1000bp 750bp 500bp 250bp 100bp 图2-3 Actin基因的纯化电泳图 图2-4为pET-32a载体酶切纯化后的琼脂糖凝胶电泳图，从图中可以看到，条带清 晰，纯度较高。 M 1 5000bp 3000bp 2000bp 1500bp 1000bp 750bp 500bp 250bp 100bp 图2-4 pET-32a纯化电泳图 2.3.3 阳性克隆鉴定 图2-5为芍药Actin基因的菌落PCR扩增。从图中看出，大部分都是阳性菌，可以 提取质粒进行进一步的阳性鉴定。 12 河南科技大学本科生毕业论文 M 1 6 11 16 21 26 30 2000bp 1000bp 750bp 500bp 250bp 100bp 图2-5 芍药Actin基因菌落PCR的琼脂糖凝胶电泳图 质粒PCR的琼脂糖凝胶电泳结果如图2-6，条带清晰明亮，说明所选的19、20号 菌的质粒都是阳性的，可以进行下一步的双酶切鉴定。 M 1 2 2000bp 1000bp 750bp 500bp 250bp 100bp 图2-6 芍药Actin基因的质粒PCR的琼脂糖凝胶电泳图 2.3.4 Actin基因的酶切验证 重组的质粒经BamH I和Hind III双酶切后经琼脂糖凝胶电泳后出现两条带，即载体和目的片段条带，进一步说明原核表达载体构建成功。 13 芍药基因原核表达载体的构建 Actin M 1 2 5000bp 3000bp 2000bp 1500bp 1000bp 750bp 500bp 250bp 100bp 图2-7 芍药Actin基因的质粒的双酶切的琼脂糖凝胶电泳图 2.4 讨论 本实验在进行的过程中，经历了多次的失败与尝试，主要出现的问题有以下几方面: (1) 配制试剂的过程中，刚开始进行实验的时候，由于不完备，造成实验药品配制过量，造成了药品的浪费，尤其是那些不宜放置的溶液或试剂，如感受态制备过程中所需要的CaCl溶液。因为感受态细胞的制备对CaCl的要求很高，所以尽可能做2 2 到CaCl溶液是无菌预冷的新溶液。 2 (2) 感受态细胞的质量是做转化实验的关键。在本实验中制作感受态细胞和转化尝试了好多次，浪费了大量时间，在尝试了多次之后总结出做感受态细胞时要保证菌种充分活化，严格控制其OD值，使细胞处于对数生长期，因为制作感受态细胞的时候600 外界温度较高，因此要尽可能使称放菌体的离心管处于低温状态下。 2.5 结论 本试验是基于已经构建好的芍药Actin基因的重组质粒pMD18-T-Actin，经过重组质粒及空载体pET-32a的双酶切，采用凝胶回收试剂盒回收纯化Actin基因及空载体，然后连接并转化感受态大肠杆菌DH5α，涂在含有Amp的LB平板上。挑取生长良好的单菌落，接种于含有Amp的LB培养基中，经过菌落PCR初步检测，再提取质粒，质粒PCR检测，最后再进一步用BamH I和Hind III酶切验证鉴定阳性克隆。根据实验结果显示，我们成功构建了芍药Actin基因的原核表达载体。 14 河南科技大学本科生毕业论文 参考文献 1. 蓝保卿, 李嘉珏, 段全绪. 中国牡丹全书[M]. 北京: 中国科学技术出版社, 2002. 2. 李嘉珏, 秦魁杰. 芍药[M]. 上海: 上海科学技术出版社, 2000. 3. 韦金笙. 芍药[M]. 北京: 中国林业出版社, 1983. 4. 于晓南, 赵蓉, 姚苗迫, 等. 国外观赏芍药的育种与应用研究[J]. 中国科技论文在线, 2006(10): l-1l. 5. 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Ann Rev Biochem, 1986, 55: 987–1035. 17 芍药基因原核表达载体的构建 Actin 致 谢 本试验是在导师范丙友副教授的悉心指导下完成的，导师渊博的知识，敏锐的思维，严谨的治学态度，勇于创新的精神时刻教育和鞭策着我，借此机会，向范老师表示衷心的感谢和崇高的敬意。范老师从论文的选题、设计，到具体实验操作步骤，都给与了我极大的帮助，再次感谢范老师在学习上对我的指导和支持。 同时，我还要感谢研究生李芳、张文婷给予的帮助和指导及同组成员的帮助，感谢班级成员和舍友的关心与体贴，在此，谨向他(她)们表达我诚挚的谢意～ 藉此论文完成之际，再次向所有关心我、帮助我的良师、益友致以诚挚的谢意和深深的祝福。 18 河南科技大学本科生毕业论文 附 录 pET-32a物理图谱 19 芍药基因原核表达载体的构建 Actin 英文翻译 鹰嘴豆肌动蛋白基因CarACT1的分子分析 Mol Biol Rep (2010) 37:1081–1088 摘要:肌动蛋白在细胞中普遍存在，是高度保守的蛋白质，在细胞形成和细胞活动中扮演重要角色。在这项研究中，肌动蛋白基因第一次从鹰嘴豆中分离，称为CarACT1(Cicer arietinum l .肌动蛋白基因1; Genbank基因库收录no.EU529707)。它编码一个推测的含377个氨基酸的蛋白质与和包含5个外显子和4个内含子的基因组DNA序列。CarACT1是被定位于细胞质中的，在不同物种中表现出同其他众所周知的肌动蛋白高度的相似性。反转录聚合酶连锁反应(rt - pcr)测定结果证明，CarACT1合成是普遍地累积在所有主要器官，如幼苗根、茎、叶、花、种子，幼小的豆荚，以及在不同发育阶段，如叶衰老，种子发育和种子萌发。我们的结果表明，CarACT1是一个具有生理功能的肌动蛋白基因，可以作为对鹰嘴豆中感兴趣基因转录水平的一个潜在的对照基因。 关键词:肌动蛋白;鹰嘴豆;发展过程;基因表达模式 缩略语: DAF 开花后天数 EST 表达序列标签 ORF 开放阅读框 RACE 末端快速扩增的方法 RT-PCR 逆转录—聚合酶链式反应 UTR 非翻译区 1(前言 作为细胞微丝的重要组成部分， 肌动蛋白是普遍存在，高度保守的蛋白质，在有机体一些基本功能中扮演重要角色，如细胞骨架形态、细胞分裂、细胞运动、细胞信号转导、细胞相互作用和细胞器的运动，以及运动、吞噬作用、内吞作用、胞外分泌。此外，肌动蛋白基因序列也被当做工具用于科学研究，例如，对于系统发育分析。由于一些肌动蛋白基因基本和稳定的表达，它们作为经典内标基因用于印迹分析和半定量rt – pcr的表达水平。肌动蛋白基因的结构和表达在某些模式植物中具有很明显的特点，如拟南芥、水稻和烟草。然而， 还需要从其他植物肌动蛋白基因做进一步的分离和鉴定。 就种植面积而言，鹰嘴豆(Cicer arietinum l .)是第三重要的豆科作物 (FAOSTAT 20 河南科技大学本科生毕业论文 数据库，2006年，)。鹰嘴豆是一种一年自花传粉一次，3至4个月的短生命周期的二倍体(2 n = 2 x = 16)植物。它有一个大小为740 M bp的小基因组，仅比M。truncatula大1.5倍(17、18)。 鹰嘴豆主要生长在世界的干旱和半干旱地区(FAOSTAT数据库，2006年，)。 对恶劣的条件长期的进化和适应使鹰嘴豆富含对一系列生物和非生物胁迫如害虫和真菌的攻击，干旱、寒冷、高盐度的忍耐基因。鉴于所有这些属性，鹰嘴豆被提议作为研究植物生长和对压力应答的生理机制的另一种模式植物。正如我们所知，到目前为止，没有肌动蛋白基因从鹰嘴豆分离出来并表达。 我们预先使用鹰嘴豆幼苗的叶子的全部脱氧核糖核酸构建了一个互补核糖核酸文库。 一个EST被发现与已知的肌动蛋白基因显示的高度相似性。在这项研究中，一个名叫CarACT1肌动蛋白基因，鹰嘴豆(Cicer arietinum l .肌动蛋白基因1;基因库中没有。EU529707)，是使用之前的序列由cDNA快速扩增的方法克隆得到。它编码一种由377个氨基酸组成的保守的肌动蛋白的蛋白质并且在鹰嘴豆植物的所有主要器官和发育阶段结构性表达。我们的研究结果表明，CarACT1是一个具有生理功能的肌动蛋白基因，并且可能作为一个潜在的对鹰嘴豆有益基因具有转录水平的参考基因。 2. 材料和方法 2.1 植物生长和压力治疗 我们的实验使用的鹰嘴豆(简历。xj - 209)是从它的自然栖息地中国新疆乌鲁木齐收集的。用于组织表达分析的鹰嘴豆在自然条件下在南京农业大学盆栽。幼叶、茎和根从两周大的幼苗采集，而盛开的花朵、发育的种子，豆荚，和不同程度衰老的叶子从开花植物和成熟植物采集。就发芽试验而言，用1%次氯酸溶液对成熟种子表面消毒10分钟，然后用无菌水冲洗。将种子放置在湿滤纸上和在黑暗中在28 摄氏度孵化后，分别在2、6、12、24、36、48 h后获得胚胎。所有压力疗法用于两周大的幼苗，幼苗生长在一个维持在25摄氏度，相对湿度60%和12 h / 12 h(光/暗周期与白光照明(110 lmol光子m - s - 1)的房间。植物放置在空气干燥滤纸引起脱水。采用200毫米氯化钠溶液淹没植物的根部进行盐度处理，用水作为对照。在0、1、3、5、12、24 h分别采集叶子进行处理。所有收获的器官都被立即用液氮冻结并储存在-80 c直到使用。 2.2 分离CarACT1 从鹰嘴豆的幼叶构建的cDNA文库中的鹰嘴豆0290表达序列标签(基因库编号.FE671069)被发现具有一个假定的肌动蛋白基因完整开放阅读框3'端，并且作为通过5’端快速扩增技术扩增CarACT1 的模板。CarACT1的5’端 cDNA用智能TM种族cDNA放大工具包(Clontech，美国)克隆。这个基因特定的引物5’ gsp(5’-GTGGTCTCGTGAATGCCTGCTGCTT-3’)用于第一轮聚合酶链反应，而另一个引 21 芍药基因原核表达载体的构建 Actin 物5’-NGSP(5’-GTGAATGCCTGCTGCTTCCATTCCTA-3’)是用于嵌套PCR。 PCR产品被克隆到pMD19-T载体(豆类、日本)和测序(表达载体，美国)。根据5’-RACE结果，引物对、 A1-1(5’-CTCTCTCTCTTCCTCTCACCTTG-3’，正向)和A1-2(5’CAACTCCTCGCCTTCAGC-3’，反向)，分别使用鹰嘴豆的总cDNA和基因组DNA被用来获得全长cDNA和基因组DNA序列。 2.3 多重序列比对和系统发育分析 利用NCBI()的默认参数使用blastn进行同源性搜索。 使用ClustalW()和BOXSHADE()对肌动蛋白的蛋白质进行多重序列比对。 用于构建系统发育树的36个肌动蛋白蛋白质序列从基因库数据库获得并用ClustalX程序(版本1.83)描绘，使用以下参数设置:缺口开罚= 10，缺口扩展点球= 0.2。在邻居加入(NJ)基础上使用兆(版本4.1) 1000引导程序复制和替代模型的泊松校正进行系统发育分析。序列的名称和36个的肌动蛋白蛋白基因库编号储存在表1。 2.4 CarACT1三维结构测定 CarACT188.7%的氨基酸序列与果蝇点突变A204E / P243 K(美联社肌动蛋白)5 c细胞质肌动蛋白的氨基酸序列相同。 坐标和结构数据已经存入蛋白质数据库(PDB)与加入的(共晶结构代码3的美联社肌动蛋白+CD)。3EKS被选为模板和使用了瑞士模式服务器构建了CarACT1三维结构模型。使用Swiss-PdbViewer使最初的分子模型能量最小化，使用均方根偏差(RMSD)评估获得分子模型几何质量。CarACT1的最优分子模型是叠加在AP-肌动蛋白的晶体结构上。使用组合扩展方法()对它们的三维结构进行比较。由此产生的PDB文件使用RASMOL可视化分子可视化软件。 2.5 CarACT1表达分析 使用植物总RNA隔离工具包(试剂盒，德国)从不同的器官进行总RNA提取。在50微升反应体积中使用上标二世逆转录酶(表达载体，美国)从2 微克的RNA中合成互补脱氧核糖核酸，1微升的反应混合物随后被用于在50微升反应体积进行PCR。对于rt - pcr(反转录聚合酶连锁反应)，分别使用引物对，CAP2-1(5’-GGAACCAAACAGAGGGAG- 3’，正向)和CAP2-2(5’-GACACATATCCAGCTTGCA-3’，反向)，A1-3(5’-CACCTTCCAGCAGATGTGGA-3’，正向)和A1-4(5’-CAACTCCTCGCCTTCAGC -3’，反向)，用于CAP2(Cicer arietinum l . APETALA2)和CarACT1。 下面的热循环条件下为:95? 为4分钟，然后是95? 为40秒，55?30秒和40秒72?为循环28次。在每个样本的CAP2相对表达水平化为表达CarACT1水平。所有的rt - pcr逆转录—聚合酶链式反应检测一式三份和展示最佳照片。 3.结果 3.1 分子克隆CarACT1 22 河南科技大学本科生毕业论文 以前我们使用鹰嘴豆幼苗的叶子构建了总RNA的的 cDNA 文库。有保利尾巴和577个碱基对的鹰嘴豆0290表达序列标签被发现与已知的肌动蛋白基因显示的高度相似性。因此，这个表达序列标签被用作设计NGSP和 GSP的模板。使用5’RACE技术获得大小950个碱基对的片段。链接序列包含一个开放阅读框(ORF)，编码一个疑似肌动蛋白的蛋白质。为了确认相应的基因的存在，引物对、 A1-1和A1-2，分别使用鹰嘴豆的总cDNA和基因组DNA扩增全长cDNA和基因组DNA序列。分别获得1418个碱基对的cDNA片段和一个3563个碱基对的DNA片段(无花果。1 b)。最后，一个全长cDNA序列被发现含有一个肌动蛋白基因开放阅读框的1131个碱基对，一个大小为178个碱基对的5’未翻译区(UTR)，和一个大小为239个碱基对的3’未翻译区。这是指定的CarACT1(Cicer arietinum l .肌动蛋白基因1;基因库编码EU529707)。 通过对比cDNA和DNA序列，CarACT1被发现含有5外显子和4个内含子的基因组DNA序列(Fig. 1c)。第一个基因的内含子位于5’未翻译区，而其他三个内含子位于编码区(Fig. 1c)。像植物中大多数具有特点的肌动蛋白基因，CarACT1被保守区的四个内含子中断(Fig. 1c)。 3.2 CarACT1的结构特征 CarACT1假定有377个氨基酸与预测分子质量为41.96 kD和等电点为5.16。基于Softberry程序(ProtComp v8.0;)的分析，CarACT1被定位到细胞质。 此外，它有两个核出口信号(NES)，这是核和细胞质之间穿梭(29)所必需的亮氨酸丰富域。这些发现表明，CarACT1是胞质蛋白，支持，它的功能是一种微丝组件。鹰嘴豆肌动蛋白序列与其他高等植物比较在氨基酸水平有有69.9 - -96.8%氨基酸(AA)一致，表明该序列的肌动蛋白家族成员是高度保守的。以此推理为基础，我们假设可能在所有肌动蛋白的蛋白质中三级结构保守。因此，分子模拟被用来获得假定的CarACT1结构。作为CarACT1的氨基酸序列与蛋白质数据库的果蝇AP-肌动蛋白具有高度一致性(88.7%)，AP-肌动蛋白的共晶结构加上CD(PDB加入代码3EKS)被选为模型模板。 3EKS在1.8?分辨率可以解决。比较模型的大多数特性比较正确地预测模型在一根平均偏差(RMSD)0.1?。三级结构的肌动蛋白显然包含四子域。没有明显的结构性差异在CarACT1骨干叠加模型和AP-肌动蛋白结构之间发现，表明肌动蛋白是高度保守的结构域。 3.3 肌动蛋白的蛋白质系统发育分析 为了调查来自其他生物体包括植物和非植物的 CarACT1和肌动蛋白和之间的演变关系，利用邻接(NJ)方法使用来自各种生物的36种肌动蛋白的全部氨基酸序列构建系统发生树。结果表明，相比其他肌动蛋白CarACT1和PsACT2，GmACT1，StACT3，AtACT11actins更密切相关。此外，非植物的所有的肌动蛋白簇拥在一起，而所有的植物肌动蛋白的蛋白质簇拥在一起，除了AtACT5和AtACT9组装到一个进化枝。由于高序列差异和缺乏AtACT9 AtACT5的检测表达，麦克道尔等提出了这两个基因是没有功能的假基因。当他们不再对齐，植物肌动蛋白的蛋白质序列的系统发育树被发现是单源，就 23 芍药基因原核表达载体的构建 Actin 非植物肌动蛋白而言(数据未显示)。植物肌动蛋白基因被分离成两个分支。大的含有来自单子叶和双子叶植物的序列。此外，它也有一个由遥远的近缘种组成的亚分支，这表明这些肌动蛋白基因在这些物种分化分裂之前源于同一世系。 3.4 CarACT1的表达模式 为了确定CarACT1的时间和组织表达谱，使用来自鹰嘴豆不同器官和生长阶段的进行反向聚合酶链式反应mRNAs。考虑到来自某个植物物种在代码区域的肌动蛋白同源基因的高相似性，用于反转录聚合酶链式反应的反向引物(A1-4) 设计根据CarACT13’-未翻译区。只有一个特定的绑定(约270 bp)从聚合酶链式反应获得。后续的测序结果证实，这是使用CarACT1 cDNA扩增得到。CarACT1被广泛发现在鹰嘴豆的许多器官，包括幼苗根、茎、叶、花、在花后15天幼嫩的豆荚(数据采集设备)，和用我们的15种数据采集设备获得的幼嫩的种子，在实验条件下。此外，CarACT1转录不断积累在开始衰老的叶子和萌发的种子，以及双生种子的胚胎中。结果表明，CarACT1是无所不在地在鹰嘴豆植物转录。 为了进一步确定CarACT1是否适用于作为参考基因，CAP2(Cicer arietinum APETALA2)被用来评估CarACT1的表达稳定性。 CAP2，一个来自鹰嘴豆APETALA2(AP2)/乙烯响应因子，已经被发现可以由脱水、盐，和ABA处理在整个幼苗中诱发和它的表达可以在转基因烟草中增强生长和耐脱水和盐胁迫。当每个样本的CAP2相对表达水平规范化为CarACT1的表达水平，鹰嘴豆树叶的脱水和盐可以引起CAP2的表达显著上调，，这表明至少在营养组织中CarACT1的转录物适用于基因表达数据的内部标准参考。 4. 讨论 到目前为止，大量的NAC基因已经从不同的植物物种中分离出来。在本研究中，我们首次从鹰嘴豆分离一个肌动蛋白基因。CarACT1被预言位于细胞质并和其他知名肌动蛋白如AtACT11，OsACT1和StACT3显示高度相似性。此外，CarACT1的转录物被无所不在地累积在鹰嘴豆植物的所有主要器官和生长阶段。这些发现表明CarACT1是一个在鹰嘴豆中具有生理功能的肌动蛋白基因。 对于肌动蛋白基因的系谱分析，我们从代表性植物，动物和真菌的不同有机体选用了36个肌动蛋白蛋白质序列。CarACT1显示在氨基酸水平和其他肌动蛋白有82.8 -96.8%相同，除了两个假基因AtACT5和AtACT9。事实上，来自动物和真菌肌动蛋白的AtACT7和AtACT3通常有12 - 17%在更换核苷酸替代分化(RNS)，与其他植物肌动蛋白多达10%发生分歧。这些数据表明，这些肌动蛋白的序列在所有生物中高度保守，这表明，可能是因为肌动蛋白功能的基础性和保守性，肌动蛋白序列在物种演化中受到强大的约束。 系统发育分析显示，在氨基酸水平上，相比其他9 个肌动蛋白，CarACT1和AtACT11更密切相关。ACT11在正形成的花、花粉和发育的胚珠组织中强烈表达，但不在根、叶和长角果组织中表达，表明它编码一个生殖肌动蛋白。然而，CarACT1的转录物无所不 24 河南科技大学本科生毕业论文 在地累积在营养和生殖器官包括幼苗根、茎、叶、花、豆荚和种子。两种同源基因的差异表达调节可能发生在独立进化的两个物种，即拟南芥和鹰嘴豆。为了了解这种差异的基础，有必要研究CarACT1表达调控机理如启动子的结构和内含子构造。 虽然AtACT2和AtACT8在拟南芥中不是CarACT1最紧密的直系同源物，但表达模式是类似的。AtACT2和AtACT8也显著表达并以特定的形式分布在大多数植物器官包括根、茎、叶、花、花粉、长角果。因为AtACT2和AtACT8已在拟南芥中被广泛用作参考基因(35、36)，CarACT1可能在鹰嘴豆中利用 Northern杂交分析和半定量逆向聚合酶链式反应中作为表达水平的潜在的参考基因。为了评估CarACT1正常化使用的可用性，研究CAP2基因的表达模式使用CarACT1 作为在干旱和盐胁迫下的一个假定参考基因。由于我们的数据和先前的调查结果之间的一致性，我们推测CarACT1可以在营养组织中作为基因表达正常化的一个内部参考基因。然而，准确地确定CarACT1表达稳定性，有必要进一步研究在生长和在一系列的环境条件下CarACT1确切的表达模式。Northern杂交分析是分析基因表达谱的典型方法。然而，由于在编码区肌动蛋白基因家族成员之间高度相似，直到所有肌动蛋白基因相继被鹰嘴豆分离才能获得每个基因的具体调查。此外，该启动子报导基因系统对于找出肌动蛋白基因的表达模式是有用的。因此，我们是分离并识别鹰嘴豆其他潜在的肌动蛋白基因以及他们的启动子。 5. 致谢 我们感谢中国教育部111项目，中国科学技术部 (2007BAC15B06， 30860152、30960206)，2006BAD09A04， 2006BAD09A08)，中国国家自然科学基金( 中国的新疆科技部门(200991254)对于这个研究的资金支持。 25