孔石莼抗病毒蛋白多糖的提取分离及抗柯萨奇病毒b3活性

孔石莼抗病毒蛋白多糖的提取分离及抗柯萨奇病毒b3活性 孔石莼抗病毒蛋白多糖的提取分离及抗柯萨奇病毒B3活性 作者:罗振宇～陈薪研～王小燕～瞿畅～张美英～安卫征～熊盛 【摘要】 目的从绿藻孔石莼中分离具有抗病毒活性蛋白多糖提取物。 新鲜孔石莼经pH 7.0的磷酸盐缓冲液提取和硫酸铵沉淀得到粗提取物～大孔树脂层析分离得到蛋白多糖。经紫外扫描、高温高压处理,121?～15min,和糖苷酶水解测定提取物的性质。MTT法检测蛋白多糖对Hela细胞的毒性～细胞病变法,CPE,检测蛋白对柯萨奇病毒B3,CVB3,引起的细胞病变抑制作用。通过样品对细胞的保护作用、对CVB3增殖的影响、对CVB3感染细胞的综合作用～初步研究了样品抗病毒作用的机理。结果从孔石莼中提取了蛋白多糖～得率为0.5%。毒性试验结果表明～孔石莼蛋白多糖对HeLa细胞的半数中毒浓度TC50大于8mg〃ml-1。孔石莼蛋白多糖具有显著的抗CVB3活性～通过试验测得孔石莼蛋白多糖对CVB3主要是预防作用和直接杀灭作用～其IC50为3.7μg〃ml-1。结论从孔石莼中分离到具有抗病毒活性的蛋白多糖～具有很好的抗CVB3活性。 【关键词】 孔石莼, 提取, 纯化, 孔石莼蛋白多糖, 抗病毒活性, CVB3 Abstract:ObjectiveTo isolate antivirus proteoglycan from the green algae, Ulva pertusa. MethodsFresh Ulva pertusa was extracted by phosphate buffer, and the total protein was precipitated with ammonium sulfate and then purified by macroporous resin. The toxicity and antiviral bioactivity were evaluated by cytopathic effect (CPE) and MTT colorimetric assay. ResultsThe TC50 (50% toxicity concentration) of proteoglycan purified from Ulva lactuca L. is more than 8000μg 〃ml –1 and the IC50 ((50% inhibitory concentration) inhibitory concentration) was 3.7μg 〃ml –1 ～TI,therapeutic index, was 2 162.2.ConclusionIsolated antiviral proteins from the Ulva lactuca L. exhibits potent anti-CVB3 activity in vitro. Key words:Ulva lactuca L., Extract; Purify; Antiviral effect; Proteoglycan from Ulva lactuca L; Coxsackievirus B3 (CVB3) 柯萨奇病毒B(coxsackievirus B～CVB)属小核糖核酸科肠道 病毒属～是引起病毒性心肌炎最主要的病原体～其中以CVB3对心肌 的亲和力最强～可导致心律失常～急、慢性心功能不全～扩张性心肌 病甚至猝死～严重威胁人类健康,1,。柯萨奇B3病毒是典型的溶细 胞病毒～目前尚无理想有效的药物。临床常用病毒唑作为治疗药物～ 但存在毒性较大～常出现白细胞减少、头痛、不可逆贫血、血清胆红素升高、致畸等副作用。因此筛选、研制新的抗CVB3药物就显得尤为重要。 近年来～病毒感染性疾病呈现快速上升的趋势～而且新病毒种类不断出现～但长期以来抗病毒的药物发展缓慢。陆地生物药源越来越少～海洋生物为抗病毒新药的发现提供了广阔资源。第一个抗病毒海洋药物为阿糖胞苷(Ara-C～Cytara -bine)～在1955年被美国FDA批准用于治疗人眼单纯疱疹病毒,2,。海洋药物学的迅速发展～为药学研究开辟了广阔的前景～目前了解到红藻和褐藻具有很多抗病毒、抗菌、增强抵抗力和提高免疫力等的生物活性作用,3,～但绿藻研究方面比较少,孔石莼是海藻中蛋白质含量最高的一种藻体～本文初步研究了从孔石莼中提取蛋白多糖的方法～并研究了孔石莼蛋白多糖抗病毒活性及其初步作用机制。目前海藻多糖抗病毒报道较多～但少见关于海藻糖蛋白或者蛋白多糖抗病毒的报道～本文从含蛋白质丰富的绿藻孔石莼中提取到具有抗病毒活性的蛋白多糖。 1 材料与仪器 1.1 材料新鲜孔石莼,Ulva Lactuca L.,:广东湛江南海海域～-70?保存。自来水反复冲洗～以除去泥沙和盐分等杂质～蒸馏水洗3 次～阴干表面的水分。 1.2 试剂与仪器浓硫酸～浓盐酸～氯化钡～硫酸铵～氯化钠～氯化钾～磷酸二氢钾～磷酸氢二钠～硫酸钾等～以上试剂均为广州化学试剂厂分析纯。DMEM培养基(Hyclone公司), CO2培养箱(日本Sanyo公司),超净工作台(苏州净化设备公司),相差显微镜(德国Laica公司),酶标仪(美国BIO-RAD公司),MTT,四甲基偶氮唑蓝,Sigma公司产品。 1.3 细胞株和病毒Hela细胞株引自美国ATCC公司～由本室保存。细胞生长液为含10%新生小牛血清的DMEM～细胞维持液为含2%新生小牛血清的DMEM～常规加入青霉素100 U〃ml-1、链霉素100 U〃ml-1。柯萨奇B3病毒(CVB3)武汉大学医学院病毒研究所引进。 2 方法 2.1 孔石莼蛋白的提取与纯化取新鲜海藻孔石莼100 g剪碎～用预冷磷酸盐缓冲液,pH=7.0,匀浆～超声破碎,4,。4?提取过夜。高速冷冻离心,10 000r〃min-1,30min,,取上清。用DEAE-Sepharose填料装柱～去离子水洗至柱子流出液无乙醇,用0.01 mol/L pH7.0 PBS 平衡层析柱～流速1 ml/min, 打开紫外检测仪和仪～至基线平直、稳定～上样。用0.01 mol/L pH 7.0 PBS缓冲液洗回至基线。按顺序用以0.01mol/L pH 7.0 PBS为母液配制成的0.05～0.1～0.15～ 0.2～0.3～0.5～1 mol/L氯化钠溶液洗脱～收集各峰～SDS-PAGE电泳分析结果～冻干样品测活性。 取新鲜海藻孔石莼100 g剪碎～用预冷的磷酸盐缓冲液,pH=7.0,匀浆～超声破碎 ,4,。4?提取过夜。高速冷冻离心,10 000 r〃min-1,30min,,取上清～加硫酸铵盐至溶液浓度60%～4?沉淀过夜～高速冷冻离心,12 000 r〃min-1,30min,, 沉淀溶于0.01mol〃L-1的磷酸盐缓冲液中。在上清中加硫酸铵盐至溶液浓度为80%～4?沉淀过夜～高速冷冻离心,15 000 r〃min-1,30min,,离心沉淀溶于0.01mol〃L-1的磷酸盐缓冲液中。两次离心的沉淀用0.01mol〃L-1的磷酸盐缓冲液透析～至溶液中无硫酸根离子存在。 取大孔树脂101充分溶胀好～装柱～去离子水洗至柱子流出液无乙醇～上样～同时连接蛋白检测仪和记录仪～分别用体积分数为20%～40%～60%的甲醇洗脱3个柱体积～再用95%乙醇洗脱3个柱体积～收集各个蛋白峰～冻干～测活。收集活性峰。 2.2 孔石莼蛋白的稳定性研究 孔石莼蛋白多糖常温下放臵24h～进行冻干～测定样品抗病毒活性。 孔石莼蛋白多糖121?高压高温灭菌15min～进行抗病毒活性测定。 孔石莼蛋白多糖用特异性N-糖苷酶酶解～超滤除去酶解缓冲液～进行活性测定。 孔石莼蛋白多糖与体积分数为95%乙醇室温下共作用24h透析除去乙醇～测抗病毒活性。 2.3 样品的毒性和抗病毒活性测定 2.3.1 细胞毒性测定,5～6,Hela细胞经消化后～加入96孔培养板中～每孔100 μl～细胞密度达到2×105个〃ml-1。待细胞长满单层后～分别加入60%硫酸铵沉淀的样品、80%硫酸铵沉淀的样品、经过大孔树脂纯化后的两个样品(上样峰和2号洗脱峰)～检测其细胞毒性。参考Mosmann,9,建立的MTT法～样品采用维持液培养基,含1%小牛血清,稀释～加入样品48 h后每孔加入5 mg〃ml-1 MTT 10 μl～继续培养4，6 h,黄色的MTT 被活细胞的线粒体脱氢酶还原成蓝色的甲簪结晶。小心吸出MTT ,每孔加入DMSO(二甲基亚砜) 100μl , 振荡混匀,15 min 后甲簪结晶被溶解,在波长570 nm 下测定吸光度OD值。计算细胞存活率、药物对细胞的半数毒性浓度(50% cytotoxic concentration,TC50,。细胞存活率,%,=实验组A570/ 对照组A570×100,。 2.3.2 样品抗病毒活性测定Hela细胞经消化后～加入96孔培养板中～每孔100 μl～细胞密度达到2×105个〃ml-1。待其生长为单层细胞～弃去培养液～将不同稀释度的药物和100 TCID50病毒各50 μl 混合后直接加到单层Hela细胞上,每个浓度设4个复孔,继续培养24，36 h～待病毒对照组细胞病变达到75%以上时,每孔加入5 mg〃ml -1的MTT 10 μl ,继续培养4，6 h,黄色的MTT 被活细胞的线粒体脱氢酶还原成蓝色的甲簪结晶。小心吸出MTT ,每孔加入DMSO(二甲基亚砜) 100μl , 振荡混匀,15 min 后甲簪结晶被溶解,在波长570 nm 下测定吸光度OD值。OD值与活细胞的数量呈正相关。 2.4 孔石莼蛋白多糖抗病毒机理的初步研究,7～8, 长成单层的Hela细胞～用100TCID50100 μl的CVB3感染～在感染前后不同时间加入经过大孔树脂纯化得到的孔石莼蛋白多糖。 2.4.1 孔石莼蛋白多糖对CVB3病毒的直接杀灭作用将100TCID5050 μl的CVB3与不同浓度的药品等量混合～药物的终浓度分别为24～12～6～3～1.5μg〃ml-1～37?培养2 h后将各浓度药物与病毒的混合液加入到单层Hela 细胞中～同时设病毒对照组和 正常细胞对照组。逐日观察细胞病变情况～待病毒对照组病变达到75%以上时～记录CPE。MTT法测吸光值。 2.4.2 孔石莼蛋白多糖对CVB3病毒引起细胞凋亡的阻止作用将100TCID50 100μl的CVB3病毒加入到长成单层的Hela细胞中～2 h以后～弃其上清～再加入样品至其终浓度。逐日观察CPE～待病毒对照组病变达到75%以上时～记录各组CPE～并用MTT法测其吸光值。 2.4.3 孔石莼蛋白多糖对CVB3病毒引起细胞凋亡的保护作用Hela细胞经胰酶(V+E)消化后～加入96孔培养板中～每孔100 μl～细胞密度达到2×105个 〃ml-1。待细胞长满单层后～先加入孔石莼蛋白多糖至终浓度于37?的细胞培养箱中孵育2 h后～弃上清～再加入将100TCID50/100μl的CVB3病毒～逐日观察CPE～待病毒对照组病变达到75%以上时～记录各组CPE～并用MTT法测其吸光值。 3 结果 3.1 孔石莼蛋白的分离提取通过前期预试验～我们发现孔石莼中蛋白类物质兼具蛋白质和多糖特性～通过对孔石莼C?N比分析所得产物是蛋白多糖～因此我们采用了两种技术路线～一是粗提物直接上样阴离子交换树脂DEAE-Sepharose～进行分离纯化,二是粗提物先进行硫酸胺分级分离～然后用大孔树脂对活性组份进一步纯化。以 活性为导向～评价纯化方法的可行性。由图1和表1可以看出DEAE-Sepharose 无法将粗提物很好的分离～抗病毒活性主要集中在上样峰和1.0mol/L NaCl溶液洗脱峰中～其IC50相对较高～而60%，80%硫酸铵沉淀的样品活性比60%硫酸铵沉淀的样品要好30倍～所以进一步纯化60%，80%硫酸铵沉淀的蛋白。把硫酸铵质量浓度60%，80%沉淀的孔石莼蛋白粗提物经大孔树脂101层析～用体积分数20%、40%、60%的甲醇和95%的乙醇洗脱～出现如图2所示的2号峰。 SDS-PAGE电泳分析DEAE-Sepharose各峰的结果如下。表1 盐沉淀样品的抗病毒活性比较,略, 取100ml蛋白质浓度为80 μg/ml 的60%，80%硫酸铵沉淀组份～进行蛋白质纯化后得到各组分的干重和活性～见表2。表2 大孔树脂纯化前后各样品物质得率和抗病毒活性,略, 3.2 孔石莼蛋白提取物的稳定性研究蛋白质因受物理因素或化学因素的影响～改变了分子内部的特有结构～导致理化性质改变～生理活性丧失～如果是蛋白多糖或者糖蛋白～因为糖基的保护作用而使得蛋白质的性质更加稳定。蛋白多糖的生物活性多数会因为糖苷键的水解而失活～因此本实验采用不同条件处理孔石莼蛋白提取物～发现孔石莼蛋白提取物在常温下放臵24h～其抗病毒活性不改变。孔石莼蛋白提取物经过高压高温处理后～抗病毒活性的有效浓度将由原来 的ng数量级上升到mg数量级～抗病毒活性损失严重。 60%，80%硫酸铵沉淀样品和95%乙醇共作用24h～抗病毒活性基本没有影响～故用大孔树脂纯化蛋白时95%乙醇的洗脱峰没有活性～并非说明是因95%乙醇作用使样品抗病毒活性～而说明样品中抗病毒活性的成分保留在上样峰中。 孔石莼蛋白经过特异性的N-糖苷酶酶解后～抗病毒活性消失～说明孔石莼蛋白中具有抗病毒活性的物质不是单纯的多糖或者蛋白质～有可能是蛋白多糖或者糖蛋白。表3 样品稳定性研究 处理方式处理前IC50/μg〃ml-1处理后,略, 3.3 各提取物的细胞毒性及抗病毒活性结果孔石莼分离提取过程中的各样品的Hela细胞毒性和抗病毒活性结果见表4.结果表明～孔石莼几种提取成分都有一定的抗病毒活性～尤其是粗提物经过大孔树脂分离纯化后～所得上样峰中孔石莼蛋白多糖抗病毒活性得到显著提高,IC50=3.7μg/ml,～同时其治疗指数,TI=TC50/IC50,也得到了提高。该样品抗病毒活性的具体结果见表4。表4 不同样品的TC50、IC50和治疗指数(略) 3.4 孔石莼蛋白提取物抗病毒机理研究的结果孔石莼蛋白多糖(大孔树脂分离所得的上样峰样品)的抗病毒活性机理初步研究发 现～样品的预防效果比较明显～其IC50=400ng/ml ,同时样品也具有直接灭活病毒的作用～其IC50=19μg/ml～其CPE观察结果见图3。 4 讨论 大孔吸附树脂是以苯乙烯和丙酸酯为单体,加入乙烯苯为交联剂,甲苯、二甲苯为致孔剂,它们相互交联聚合形成了多孔骨架结构。树脂是一类含离子交换集团的交联聚合物,它的理化性质稳定,不溶于酸、碱及有机溶剂,不受无机盐类及强离子低分子化合物的影响。树脂吸附作用是依靠它和被吸附的分子(吸附质) 之间的范德华引力,通过它巨大的比表面进行物理吸附而工作,使有机化合物根据有吸附力及其分子量大小可以经一定溶剂洗脱分开而达到分离、纯化、除杂、浓缩等不同目的。本试验采用大孔树脂进行生物大分子活性物质的分离纯化少有报道～试验过程中曾尝试用离子交换的方法分离抗病毒活性成份但未成功失败～用凝胶柱的方法也未能较好分离活性物质成分～因此～采用大孔树脂进行分离～虽然大孔树脂分离粗提物也没有得到单一的物质～但可得到活性更强的较纯提取物～为下一步的研究工作提供了方便。 本试验以抗病毒活性为导向～应用盐析沉淀、大孔树脂层析、离子交换层析等多种方法～从孔石莼中分离到了具有明显抗病毒活性的蛋白多糖。目前抗病毒药物中大多是小分子化合物或者是中药复方 制剂～糖蛋白或者蛋白多糖具有抗病毒活性的报道并不多～生物大分子抗病毒活性在将来的药物研发中应该更具有专一性。因为生物大分子对人体的副作用小～所以开发具有抗病毒药物的生物活性大分子将是以后药物发展的重要方向。因此本试验所研究的生物活性大分子对新药研究将提供一定的帮助。 近年来多糖、糖蛋白或者蛋白多糖抗病毒活性的研究开始增多～其主要原因可能有多种。海藻多糖是重要的抗病毒活性物质。也因为目前没有很好的方法来分离蛋白质和多糖或者糖蛋白和蛋白多糖～所以很多研究是停留在多糖或者蛋白抗病毒活性研究的层面上。Adhikari U ,9, ～Mandal P,10, 等研究了从褐藻中提取的多糖抗疱疹病毒～且这些多糖对细胞没有毒性。Filho,11, 等人在从高粱属植物中分离纯化得到一种抗病毒的多肽。也有人从多叶奇果菌子实体中分离得到一种分子量大约为29.5KD的新型抗病毒蛋白。体外抗病毒活性的IC50为4.1μg/ml,3, 。这些多糖和蛋白或者是糖蛋白大多都是抗疱疹病毒的～抗CVB3的糖蛋白或者蛋白多糖不多见～通过本实验室的前期工作发现～从孔石莼中分离得到的这一抗CVB3活性的蛋白多糖～目前本实验室正在进行进一步的分离纯化与鉴定～并将继续研究这物质抗病毒活性的机理。 【参考文献】 ,1,幸建华,杨占秋.柯萨奇病毒与病毒性心肌炎,J,.数理 医药学杂志,2004,17(3):260. ,2,倪学文. 海洋抗病毒活性物质的研究进展,J,.中国热 带医学, 2003,6(5):871. ,3,罗先群,王新广,杨东升. 海藻多糖的结构、提取和生物 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