茶氨酸神经保护作用的体外和体内实验研究

茶氨酸神经保护作用的体外和体内实验研究 中国疾病预防控制中心 硕士学位论文 茶氨酸神经保护作用的体外和体内实验研究 姓名:刘婉如 申请学位级别:硕士 专业:卫生毒理学 指导教师:徐海滨 20070701中国疾病预防控制中心硕士学位论文 中英文缩略词对照表 英文缩写 英文全称 中文词义缺血性脑血管病谷氨酸 从 兴奋性氨基酸 一甲基一一天冬氨 ? 酸 一氨基一一羟基一异恶唑一丙酸 .% 半数致死量 二甲基亚砜 胎牛血清乳酸脱氢酶 一氧化氮 一氧化氮合成酶 天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶 . 光密度 大脑中动脉阻塞 小牛血清白蛋白 谷胱甘肚过氧化物酶 丙二醛 ? 三磷酸腺苷酶 / 未观察到有害作用剂 ... 量学位论文原创性、真实性声明 本人郑重声明:《茶氨酸神经保护作用的体外和体内实验研 究》是本人在中国疾病预防控制中心卫生毒理学专业攻读硕士学 位期间,在导师指导完成的硕士学位论文。我承诺:本论文中 所涉及的所有数据、试验以及研究结果均真实可信,引用资 料已注明出处,无剽窃、篡改、抄袭之行为。如本论文原创性方 面出现问题,我愿负法律责任。 本课题的研究成果归中国疾病预防控制中心所有,发表文章 的单位署名为中国疾病预防控制中心。 特此声明 学位论文作者签名: 研究生导师签名: 、 伊 、~ 弛 ‘ 年月。日 年月日中国疾靖预防控制中乜硕士学位论文 中文摘要 目的 从体外实验方面初步研究了茶氨酸对谷氨酸致体外原代培养神经细胞兴奋性 损伤的保护作用剂量范围及其可能涉及的机理;通过建立大鼠脑缺血模型,初步 研究了茶氨酸对脑缺血损伤的保护作用,并探索了其神经保护功能与氧化酶活性、 自由基水平的关系。为茶氨酸进一步作为天然植物神经保护剂应用于神经保护提 供科学依据。 、茶氨酸对细胞 还原率的影响:将培养?天的 细胞以×/的密度接种于孔板,每孔肛,,%条件下培养 个浓度梯度的茶氨酸工作液,同时设阴性对照和 ?,加入?? 损伤对照组继续培养,后换液一次,再加同样的受试物工作液培养 后,加入工作液测定细胞活力。 、茶氨酸对原代培养大鼠大脑皮层神经细胞 还原率的影响:分 离收获新生一天大鼠大脑皮层神经细胞,以/的密度共培养法 接种于孔板,每孔?,,%条件下培养第天加入终浓度? 阿糖胞苷抑制非神经细胞的生长,取培养?的细胞,加入?? 个浓度梯度的茶氨酸工作液,同时设阴性对照组,继续培养,后换液一 次,再加同样的受试物工作液培养后,加入 作液测定细胞活力。 、茶氨酸对致原代培养大鼠大脑皮层神经细胞兴奋性损伤后细胞 还原率的影响:以上述方法培养大鼠原代大脑皮层细胞?,加入? .个浓度梯度的茶氨酸工作液,同时设阴性对照组、损伤组、 保护组,继续培养,后弃原培养基,所有保护组和损伤组均加入终浓 液作用,然后再置换成等体积的保 度为?’的谷氨酸 护剂工作液,其中阴性和损伤对照组只加不完全培养基,继续培养后, 加入 工作液测定细胞活力。 、茶氨酸对致原代培养大鼠大脑皮层神经元兴奋性损伤后细胞上清中中国疾 病预防控制中心硕士学位论文 漏出量和释放量的影响:在六孔板中分离式原代培养大鼠大脑皮层神经 元,待神经元生长到一时,分别加入、、岬?。个浓度梯度的茶 氨酸工作液,同时设阴性对照、损伤对照、保护对照组,每组孔细 胞,培养,后弃原培养基,所有保护组和损伤组均加入终浓度为 ’液作用。然后再置换成等体积的保护剂 岬?。的谷氨酸 工作液,其中阴性和损伤对照组只加不完全培养基,继续培养后取上清, 全自动生化分析仪测定细胞上清中含量、化学法测定含量。 、 茶氨酸对致原代培养大鼠大脑皮层神经元兴奋性损伤后细胞内 、嬲船.表达量的影响:按上述方法孔板分离式原代培养大鼠大脑皮 层神经元?,加受试物作用后,取出生长有神经元的玻片,按照免疫组 化三步法步骤染色测定神经元内、鹊船一表达量,最后用岫 .对细胞着色深浅进行分析。 大鼠只,按体重随机区组分为组,每组 、取周龄体重一 只:缺血模型组、假手术组、茶氨酸保护低.,、中. ,吕、 高. 啦.剂量组。动物每天灌胃给予一次受试物,对照组给予蒸馏 水连续给予;末次给药后,进行单侧颈动脉插线法制备永久性局灶性脑缺血 模型,术后观察动物体征并进行神经功能学评分,然后断头处死动物,取缺 血侧大脑半球,称湿重,然后制各.%脑匀浆,叫?离心,取上 清依次测定、含量及、酶活性等指标。 结果 、各剂量茶氨酸作用于受试细胞后,斗?以下剂量茶氨酸组细胞对 还原率均与阴性对照组无显著差异,只有肛?’及以上茶氨酸 剂量组细胞对还原率与阴性对照组相比有所下降。 、与阴性对照组相比,损伤组细胞对锄还原率显著降低;而 ?“?。剂量的茶氨酸保护组细胞对锄盯还原率均与阴性对照组无 还原 显著性差异,其中岬剂量的茶氨酸保护组细胞对锄 率显著高于损伤组。中国疾病预防控制中也硕士掌位论文 、与阴性对照组相比,损伤组细胞培养液上清中含量有所增高, 含量显著增高;而各保护组细胞培养液上清中、含量与阴性对照组 相比均无显著性差异,与损伤组相比均有所增高。 、与阴性对照组相比,损伤组细胞内、私一表达量显著增高, 各保护组细胞内、嬲表达量都显著低于损伤组。 、茶氨酸处理组脑缺血大鼠神经功能缺陷评分结果显著低于缺血模型组。茶 氨酸低中剂量组脑半球湿重显著低于缺血模型组。 、茶氨酸各处理组大鼠脑匀浆上清液中、含量均与缺血模型组无 显著性差异,但是从数值上看各茶氨酸处理组、含量均有小于缺血模型 组的趋势。 、假手术组大鼠脑匀浆上清液中及酶活性高于缺血模型组。 低剂量茶氨酸组酶活性显著高于缺血模型组,各茶氨酸处理组酶活性结果在 数值 上均有高于缺血模型组的趋势。 结论 .体外实验显示岬?‘剂量以下的茶氨酸对体外培养及大鼠原代皮 层神经细胞都没有可观察到的毒性;肛?剂量的茶氨酸均具有拮抗 谷氨酸毒性的作用,其适宜的作用剂量范围为一?~。 .?“?剂量的茶氨酸在体外可以显著降低谷氨酸损伤后神经细胞培 养液上清中的水平、降低细胞的漏出率、减少细胞内及 硒髂.的表达。体外实验提示,茶氨酸对神经细胞的保护作用与其拮抗谷 氨酸的毒性有关,其作用机制涉及兴奋性氨基酸对神经细胞损伤的多个位 点。 .体内实验提示茶氨酸对大鼠脑缺血模型具有明显的保护作用,它可以显著 减 轻大鼠脑缺血后神经功能缺陷症状、降低脑水肿程度;并可以在一定程度上 降低脑组织内自由基水平,并提高氧化酶的活性。体内实验进一步佐证了体 外实验的部分研究结果。 关键词 茶氨酸谷氨酸脑缺血 神经细胞兴奋性毒性中国疾病预防控制中心 硕士掌位论文 : .. 孤. . . ..,,. :. : .. ,., , .. : ,.,. , , .. .., ’ , / ’ ?; 一中国疾病预防控制中心硕士掌位论文 , .. : . . . .. .: . 咖., :.曲.. . , ., ,, . ? : ’ . ?‘ .?‘.’.. , . ? .. , ..???? 墨竺望竺竺型竺竺主竺竺竺查 . ,, . 肛?~ . , . ,,,?‘驰. , . . , .? . 盯 // . ? . . : ’一 .。~ . ?~. // : ,. ’. . ..中圄疾病预防控制中心硕掌位论文. ,, ?, , .. : ..中国疾病预防控制中心硕士掌位论文 前 言 茶是世界三大饮料之~,关于茶的保健作用自古便有记载。在上个世纪至 年代,关于茶叶中的功效成分茶多酚和茶色素的研究业已取得了科学界的广 泛 认同。最近,在该领域又出现了一种颇引人注目的天然植物化学物??一茶氨 酸 。 ,其化学 .茶氨酸又名.乙基.一谷氨酰胺?? 结构如图一所示【?。早在年,.茶氨酸就作为绿茶中的一种独特成分而 被首次报道,并于年在日本被批准为食品添加剂,用以提升茶的风味【。但 是,由于茶氨酸在茶叶中含量只占茶叶干重的%一%【,不易提纯,所以多年 来人们对它的研究甚少,直至上世纪末,随着茶氨酸人工合成技术的日益成 熟, 茶氨酸的多种生理功能及药理活性才逐渐引起学者们的重视。 、/? /\/ /\/ ? . 图卜.茶氨酸的化学结构‘ 从茶氨酸的化学结构式上可以看出,和大多数氨基酸一样,茶氨酸也含有手 性碳原子,有左旋体和右旋体之分,天然存在的茶氨酸以型为主】。所以,国 内外研究中所提到的茶氨酸常常就是指一茶氨酸。 茶氨酸为水溶性氨基酸,经口摄入后在小肠粘膜刷状缘经钠离子依赖的转运 体转运/。吸收后的茶氨酸被运输到身体的多个器官,并可以通过亮氨酸转 运系统完整地跨过血脑屏障进入脑部。研究表明,大鼠经口摄入茶氨酸 后即可到达脑部,后血浆浓度达到最高,之后脑部浓度达到最高,然后逐渐 降低‘。茶氨酸在肾脏被谷氨酰胺酶分解为谷氨酸和乙胺而排出体外,后在 体 内完全消失【’”。 据近年来国内外研究报道,一茶氨酸在神经、肿瘤、免疫、心血管等方面均 中国疾病预防控制中心司【士掌位论文 有许多独特的生理功能,如抗焦虑、抗疲劳、提高机体免疫力、提高抗肿瘤 药物 的疗效、降血压等‘。在茶氨酸的这些生理功能中,有一种是比较特殊且研究报 道尚不充分的,那就是茶氨酸在脑缺血中的神经保护作用。与茶叶中的另一成分 茶多酚的抗氧化机制不同的是,茶氨酸的这一生理功能很可能与其与谷氨酸类似 的化学结构有关见图.。 . . . 图.茶氨酸与谷氨酸化学结构比较嗍 谷氨酸是中枢神经系主要的兴奋性神经递质,在维持神经元正常信号传递过 程中起重要作用。脑缺血时,合成减少,神经细胞氧化磷酸化能力减弱,离子 泵功能部分失效,特别是酶功能减弱,使大量内流,外流,细胞膜 电位下降,产生去极化。细胞膜去极化导致神经细胞突触前释放兴奋性氨基酸, 兴奋性氨基酸主要通过受体活化方式而起兴奋性介质作用。离体研究证吲, 受体活化效应包含两个明显不同的过程,一是主要受体和受体过度兴奋 所介导的神经细胞急性渗透性肿胀,二是主要受体过度兴奋所介导的神经 细胞迟发性损伤,可在数小时至数日内发生,以持续的”内流为特征。在大多数 病理情况下,由受体过度兴奋所介导的”内流引起的神经细胞迟发性损伤在 兴奋性毒性的病理中占主导地位。内流同时激活细胞内库的释放,导致细 胞内游离超载,引发一系列反应。一方面游离激活各种降解酶如酶、钙 调磷酸酶、蛋白酶和磷脂酶,引起、蛋白质和磷脂降解,细胞代谢、结 构与功能多方面的异常改变,使神经细胞逐步死亡。另一方面,”与钙结合蛋白 与靶细胞中 结合可激活神经元,使合成增加。作为胞内和胞间信使, 的血红素基团的铁结合后后,激活,促使胞内生成增多。继而激活 依赖的蛋白激酶,通过靶蛋白磷酸化,导致细胞功能改变。同时脑缺血后产生的 过量迅速与:一反应,生成强氧化剂硝基阴离子一,后者可导致级联式神中国疾病预防控制中心硕士掌位论文 经损伤【】。此外,过量‘沉积于线粒体,使线粒体氧化磷酸化失偶联进一步加 重,膜电位丧失,呼吸链解体,导致细胞能量的严重丢失,同时致使经单电子 还原生成超氧阴离子:一增多,产生的大量自由基与脂质、蛋白质、及核酸发生 反应,引起膜脂质过氧化,导致膜损伤,线粒体功能障碍,细胞溶解和组织水肿 等一系列损害作用。线粒体通透性转运通道开放,定位于线粒体的一些因子,如 细胞色素、一家族和前体等释放到细胞质中,引发蛋白水解 激活的级联反应,最终导致依赖和途径的细胞凋亡【引。实验证明, 用抑制谷氨酸释放或抗谷氨酸毒性的药物可以减轻脑缺血再灌注损伤。 进入世纪以后,我国正逐步步入老龄化社会,缺血性脑血管病正逐渐成为 威胁广大老年人健康与生存的主要疾病之一。在的研究中,和是 很多学者关注的焦点。分为离子型受体和代谢型受体两种,其中,离子型受 】,和海藻酸受体主要调 体又分为受体,海藻酸受体和受体三种【 节传统的快速离子通道,受体主要调节钙离子和钠离子内流,与突触的形成 和记忆的获得有关。代谢型受体是通过蛋白激活磷脂酶起作用。由于不同的 受体拮抗剂与这些受体亚型的亲和力强弱不同,因此当它们达到拮抗谷氨酸毒性 的剂量时也往往会产生一些不可避免的毒副作用。 茶氨酸作为一种天然植物化学成分,动物经口为蚴,属安全无 毒的物质【】。由于.茶氨酸与谷氨酸具有类似的化学结构,国外不少学者对其作 为谷氨酸受体拈抗剂发挥神经保护作用的可能性进行了研究。首先是在日本,流 行病学研究发现,每天饮用杯以上的绿茶可以明显降低脑中风的发生率”,然 后国内外学者对该物质的神经保护作用进行了多方面的研究??据日本 等研究报道,沙鼠脑缺血手术前侧脑室微注射茶氨酸可以明 显的增加损伤后完整存活的神经元的数量,并且呈剂量一反应关系埽】。随 后, 等对小鼠腹腔注射茶氨酸的神经保护效果进行了研究,发现腹腔注射 啦 给予茶氨酸可以明显减小小鼠大脑缺血再灌注之后的脑梗死面积【”。另外, 等【】向原代培养的大鼠大脑皮层细胞中加入谷氨酸作用 可使细胞存活率明显下降,而在加入谷氨酸的同时给予终浓度为 及以上剂量的茶氨酸即可使细胞存活率恢复至空白对照水平。说明茶氨酸可以直中圄疾病预防控制中』乜硕士掌位论文 接拮抗谷氨酸对培养神经细胞造成的兴奋性毒性。 综上所述,茶氨酸作为一种天然植物化学物质,不仅仅可以作为呈味物质应 用于食品的加工合成,其多种生理功能也越来越受到人们的重视。在神经保护的 研究方面,天然植物性化学物质也不失为一种可探索的途径。从当前收集到的资 料来看,茶氨酸的神经保护作用研究尚有不足,在体内抗缺血功能方面,当前文 献报道仅限于病理观察、脑血流、大体组织切片电镜观察等方面,并没有深入的 研究;体外研究报道则相对更少,各方面研究切入点不同,文献资料相对分散。 本课题拟通过体外体内两种方式研究茶氨酸对神经细胞兴奋性损伤的保护作用。 首先,通过孔板中体外混合式培养大鼠原代神经细胞,利用 测定 各剂量茶氨酸对神经细胞活力的影响,以及各剂量茶氨酸对谷氨酸致兴奋性损伤 后神经细胞活力的影响,从而为本课题初步了解茶氨酸的体外安全性剂量范围, 并进一步开展茶氨酸在体外原代培养神经细胞体系中对谷氨酸毒性的拮抗作用机 理及其适宜的保护剂量的研究提供依据。其次,在此基础上,选取低中高三个剂 量的茶氨酸,分离式培养大鼠原代神经细胞,并在此受试体上建立谷氨酸兴奋性 损伤模型,从漏出量、细胞培养上清液含量、细胞内、凋亡蛋白 .蛋白的表达等几个方面对茶氨酸的体外神经保护作用机理进行了初步 探讨;最后在体内实验中,经口给予大鼠低中高三个剂量的茶氨酸三周后, 通过大鼠单侧颈总动脉插线法阻断血流,建立大鼠脑缺血损伤模型,然后通过神 经功能评分、脑匀浆上清氧化酶活性、自由基水平等几方面对茶氨酸的体内神经 保护作用进行观察。为茶氨酸作为天然植物神经细胞保护剂的应用研究提供初步 的线索,也为其他植物化学物质神经保护作用的研究工作提供参考。中国疾庸预防控制中心硕士掌位论文 第一部分:茶氨酸对原代培养神经细胞有效作用剂量的研究 近年来,对于植物化学物质健康影响的研究已经成为人们关注的热点之一。 但是在对每一种植物化学物质的健康影响作用进行研究之前,都必须先对其安全 性进行。对于本课题所研究茶氨酸这一物质,之前已有文献报道其为 /以上,在动物及细菌实验中均未发现其有致癌或致突变作用【】, 年又有日本学者对茶氨酸的毒性进行了周喂养实验,该文章报道其为 /./”。但是,在我们所获取的资料中,并未见关于茶氨酸对神经 细胞毒性的报道。因此,在本课题中,为研究茶氨酸的体外神经保护作用,我们 首先对茶氨酸在体外对神经细胞的毒性范围进行了探索。我们选取了两种细胞体 系作为受试体:细胞和混合单层培养大鼠原代大脑皮层细胞。细胞为大 鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞,其细胞质中含有大量嗜铬颗粒,富含多巴胺受体及合 成、分解多巴胺所需的各种酶类。在有神经生长因子存在的培养条件下,其胞体 可以生长出突起,类似神经元的轴突,分化成交感神经元样细胞,在形态、生理 及生化功能等方面更接近于神经元,被广泛应用于神经元死亡方式及毒性损害的 研究‘。细胞株的培养虽然相对简单,但细胞经过多次传代之后,其生物学特 性 有所改变,不能很好的反映活体的生物学特点。而原代培养细胞则保持了部分体 内细胞的功能活性,在毒性研究中必不可少。因此,我们在细胞实验的基础 上设计了梯度浓度的茶氨酸受试液,利用单层混合培养法原代培养大鼠大脑皮层 神经细胞,用此体系研究了不同浓度茶氨酸对神经细胞的毒性。 在掌握了茶氨酸的毒性范围后,根据国外文献资料报道数据和本课题毒性实 验结果,选取有效且无毒的茶氨酸剂量范围,开展了茶氨酸对谷氨酸致原代培养 大鼠大脑皮层神经细胞兴奋性损伤后细胞活力的影响研究,进一步了解了茶氨酸 的体外神经保护作用的适用剂量,为将来进行茶氨酸体外神经保护作用的机制的 研究提供线索。中国疾病厕胃方控制中心硕士掌位论文 材料与方法 .材料 .实验动物和受试细胞 实验中取原代大鼠神经细胞所用乳鼠为新生一天大鼠,由北京康 蓝生物技术有限公司协和医科大学实验动物研究所提供。 原代大鼠神经细胞制备方法参考国内外常用的神经细胞与胶质细胞单层混合 培养法并加以改进。 实验所用细胞由中国疾病预防控制中心职业卫生与中毒控制所院士实 验室提供。 .受试物及试剂 一茶氨酸由日本太阳化学株式会社惠赠,为生物合成品,纯度为%以上。 培养基、硫酸链霉素、胰蛋白酶为公司产品。 、、二甲基亚砜、谷氨酸等均为公司产品。 胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司。 青霉素为华北制药股份有限公司生产。 注射用盐酸阿糖胞苷购自中国医学科学院肿瘤医院。 试剂购自公司 实验中所用其他试剂均为国产分析纯 .主要实验仪器设备 细恒温胞培养箱公司型 普通离心机 北京医用离心机厂?型全波长酶联免疫监测仪 倒置相差显微镜 公司型 水浴恒温振荡器 江苏金坛荣华仪器制造有限公司一型 超净工作台 北京昌平长城空气净化工程公司 .主要工作溶液的配制 ?’液:.、.、.、中国疾病预防控制中心硕士掌位论文 .、.,溶于三蒸水中,经.滤器过滤 除菌,置冰箱中保存。 培养基:将购买的一袋高糖培养基充分溶解于三蒸水中, 加入 .、 .、青霉素 、链霉素,由 于神经细胞对糖分要求较高,另外补充.葡萄糖,调节至中性,定 容至,.滤器过滤除菌,置冰箱中保存。 .%胰蛋白酶消化液:称取.胰蛋白酶粉, .,加入’ 溶液,室温振荡,如果混浊,则在。冰箱中放置一夜后再用. 滤器过滤除菌,置冰箱中保存。 . /、 /、 无’液吲: . ./、 ./、葡萄糖. /, /、 .,用.滤器过滤除菌,置。冰箱中保存。 .方法 .细胞的收获及培养 .. 细胞培养及传代方法 ...细胞复苏 从液氮罐中取出两管之前冻存的细胞,迅速投入水浴锅中加热? ,待细胞悬液融化后迅速取出冻存管,喷酒精消毒管口后在超净台内旋 开盖子。 用玻璃吸管将融化的细胞悬液移入之前加有? .液的离心 管中,/离心; 离心后,弃上清,加入?含有%胎牛血清的培养基,吹散细 胞,转移到的细胞培养瓶中,?、%。培养,后待细胞约 %铺满瓶底后进行传代或接种到细胞培养板中加受试物。 ...细胞传代和接种: 取出培养?的细胞,弃培养液,用.液洗一次; 加入? ./胰酶,以盖过细胞为宜,置培养箱内?消化左右, 镜下看到细胞边界变清晰为宜;中国疾病预防控制中心硕士掌位论文 用玻璃吸管吸取培养基加入培养瓶中,不断吹打下贴壁的细胞,制成细胞悬 液,调整细胞密度到×个/左右,将细胞悬液移入需要接种的新瓶子或 培养板中,补足培养基即可。 ..大鼠原代大脑皮层神经细胞的获取及混合式培养方法 取一离心管加 培养基备用,另取两只空管备用。取一 培养皿加一半培养基备用。 取两只乳鼠放小烧杯中,喷洒%酒精皮肤消毒; 用无菌镊子取出乳鼠,用剪刀断头,将头放入前述培养皿的盖中,用 齿镊夹住眼球部位固定,沿中线切开皮肤,从后向前剪开颅骨,再向两侧侧 切,用小止血钳撕去颅骨,从鼻侧入钳将全脑取出放入已有培养基的 的培养皿中。 在解剖显微镜下分离取下两侧大脑半球,剥离脑膜及血管后放入已加 培养基的离心管中。用无菌玻璃滴管轻轻吹打?次,静置。 吸取上清,放入另一离心管中,加培养基至,吹打一 次,离心转/分,。 弃上清,加培养基至,吹打一次,进行活细胞计数,调整细 胞密度到个/左右,将细胞接种到孔板中,每孔,置细胞 培养箱?%培养。 培养第加入终浓度/的阿糖胞苷抑制胶质细胞的生长。 培养到第?左右,加入受试物工作液用于细胞存活率的测定。 .受试物作用及指标测定 ..茶氨酸对细胞对 还原率的影响冽 称取茶氨酸粉末.,溶于三蒸水中,配成茶氨酸储备液,过滤除菌, 移入管中一?冻存,一周之内使用,使用时,取储各液加入 不完全培养基中,储备液倍稀释为/,按此剂量依次倍比稀释, 配成?珊/ 个浓度梯度的茶氨酸工作液。 取孔板中培养左右的细胞,弃原培养基,加入洗次,孔板留 两排孔不加细胞,作为培养液对照和 对照。取中间排细胞,依中国疾病预防 控制中心硕士掌位论文 次加入个剂量的茶氨酸工作液作用:同时设阴性对照组一排和损伤 对照组/一排,阴性对照组加不完全培养基,同样用不完全培养 基稀释储备液。 后弃培养基,加入洗次,再加入茶氨酸工作液作用。 后弃培养基,用?洗次。 取 原液,用不完全细胞培养基稀释至, 将此试剂分别 加入到孔板各孔, ,孔。在留出的两排空白孔中分别加入 不完 全培养基和 工作液,继续培养。 在加入试剂后的第、、,用酶标仪分别测定、 吸光度。 细胞对 的还原率。: 还原率%,/ :波长时对照的吸光度; ..波长时培养液对照的吸光度; :波长时 对照的吸光度: :波长时培养液对照的吸光度; : 波长时的受试孔吸光度: : 波长时受试孔吸光度。 细胞存活率%各组细胞还原率/阴性对照组细胞还原率 ..茶氨酸对原代培养大鼠大脑皮层神经细胞 还原率的影响 取培养一,阿糖胞苷作用后的混合培养法原代大鼠大脑皮层细胞,用 个浓度,同 ..中同样的方法加受试物,茶氨酸剂量调整为一./ 样的方式作用后测定茶氨酸本身对细胞 还原率的影响。 还 ..茶氨酸对原代培养大鼠大脑皮层神经细胞损伤处理后对 原率的影响 称取茶氨酸粉末.,溶于三蒸水中,配成茶氨酸储备液;称取 .谷氨酸粉末,溶于三蒸水中,配成谷氨酸储备液;称取 .溶于三蒸水中,配成储备液,均过滤除菌,移入中国疾病预防控制中心硕士 掌位论文 管中一?冻存,一周之内使用。 使用时,取储备液加入不完全细胞培养基中,按剂量依次倍比稀释,配成 ??/个浓度梯度的茶氨酸工作液、./的工作液。其 中,./的谷氨酸工作液用无”’液配制。 取孔板培养的原代大鼠大脑皮层神经细胞,弃原培养基,无 ’液洗次,排细胞分成?/ 个浓度梯度的茶氨酸 保护组、保护对照组、阴性对照组、损伤组,每组孔;茶氨酸保 护组加入不同浓度的茶氨酸工作液。其余各组加入不完全培养基,培养。 后弃原培养基,无’液洗一遍,然后阴性对照组加入无矿 ’液,其余各组均加入工作液和保护剂,置培养箱中同时作用? : 弃工作液,换回各保护剂工作液,其中阴性对照组和损伤组 加入不完全培养基,置培养箱培养。 按照上述..中方法测定细胞还原率。 .数据处理和统计方法 所有计量资料数据采取牙?表示,采用 .统计软件分析,组间比 较首先分析各组数据是否服从正态分布,并方差齐性,如果数据符合正 态分 布并且方差齐,然后采用单因素方差分析及 单侧检验。中国疾靖预防控制中 心硕士掌位论文 结 果 .茶氨酸对细胞 还原率的影响 孔板中加入 试剂后,通过肉眼观察,可见随着培养时间的 延长,含有细胞的各孔 颜色由蓝色逐渐向粉红色转变,但组 ./各孔颜色基本没有变化。..是颜色对比差距最明显的阶段, 随后颜色对比差距逐渐缩小。选取.时点的吸光度结果,按照前述公式计算还 原率并进行分析和 单侧检验,比较各组还原率均值与阴 性对照组均值有无显著性差异。结果显示阳性对照组还原率均值显著低于阴 性对照组.,各茶氨酸处理组细胞还原率均值与阴性对照组相比,只有三 个高剂量组,, ?的细胞还原率均值明显低于阴性对 ?组细胞还原率与阴性对照组相比,没有显 照组.,而? 著性差异.。以阴性对照组细胞 还原率为分母,按照前述公 式进行细胞存活率%的计算。结果如图?所示。 ?.? 细. 胞 存 活 紊. .? 组别 图:茶氨酸对细胞存活率的影响 工。重复三次,?与阴性对照组有显著性差异,.中国疾精却”疗控制中心司士 掌位论文 表.茶氨酸对细胞还原率%的影响牙,,重复三次 该组还原翠均值小于阴性对照组均值一有显著性差异,.? 对各组细胞存活率进行直线回归分析,得出回归方程为... 茶氨酸剂量,细胞存活率,由此推算出茶氨酸对细胞的半数致死量 为.肛‘一。 .茶氨酸对原代培养大鼠大脑皮层神经细胞 还原率的影响 在上述实验的结果的基础上,我们在做茶氨酸对原代神经细胞活力的影响 时, 将最低浓度从 ?调到了 ?。实验结果表明,孔板中加入 试剂后,通过肉眼观察,可见随着培养时间的延长,含有细胞的各 孔 颜色均由蓝色逐渐向粉红色转变,到时各孔颜色都变为粉红, 酶标仪测定值,按照前述公式计算还原率并进行分析和 单侧检验,比较各组还原率均值与阴性对照组均值有无显著性差异。结果显示经 过茶氨酸处理过的各组细胞还原率均值与阴性对照组均值相比,只有后三个高剂 量组,, ?的细胞还原率与阴性对照组有显著性差异.,而? 组细胞还原率与阴性对照组相比,没有显著性 差异.。 表茶氨酸对大鼠皮层神经细胞对还原率的影响孟,,重复三次 该组还原率均值等于阴性对照组均值;该组还原率均值小于阴性对照组均值,有显著性差异, .. 以阴性对照组细胞 还原率为%,按照前述公式进行细胞存活中国疾病预防控制中心硕士掌位论文 率%的计算。结果如图?所示。 ” 麓 存 活 耋 占.? 呷 ?组剐 图:茶氨酸对原代培养大鼠皮层神经细胞存活率的影响 牙土 .重复三次,?与阴性对照组有显著性差异,. 对各组细胞存活率进行直线回归分析,得出回归方程为... 茶氨酸剂量,:细胞存活率,由此推算出茶氨酸对原代培养大鼠大脑皮层神 经细胞的半数致死量为:.?~。 .茶氨酸对致原代培养大鼠大脑皮层神经细胞兴奋性损伤后细胞 还原率的影响 在前述实验结果的基础上,我们选取了?。以下剂量的茶氨酸作为其 试剂后,通过肉眼观 神经保护作用探索的剂量范围。孔板中加入 察,可见随着培养时间的延长,含有细胞的各孔锄颜色由蓝色逐渐向粉 红色转变,但损伤组各孔颜色变化较慢。...是颜色对比差距最明显的阶段, 随后颜色对比差距逐渐缩小,,时包括谷氨酸损伤组在内的各孔颜色基本上 都 变为红色。选取.时点值,按照前述公式计算还原率并进行分析和 单侧检验,分别比较各组细胞还原率均值与阴性对照组 有无显著性差异,以及各组均值与损伤组均值有无显著性差异。结果如表中 国疾病预防控制中心硕士掌位论文 还原率均值比阴性对照组显著降低 所示。结果显示损伤组细胞 .,经茶氨酸处理的各组以及【保护组细胞还原率均值与阴性对照 单侧检验比较各组与 组均值相比,均无显著性差异.。以 损伤组细胞锄还原率均值有无显著性差异,结果显示,除? 还原率与损伤组相 和茶氢酸保护组之外,其余各组 比均有显著性差异.。 表茶氨酸对谷氨酸致大鼠皮层神经细胞兴奋性损伤后还原率的影响 士,,重复三次 ?该组还原率均值小于阴性对照组均值,有显著性差异?.. 该组还原串均值大于损伤组均值,有显著性差异,.. 以阴性对照组细胞 还原率为%,按照前述公式进行细胞存活率 %的计算。结果如图?所示。中国疾辩,甄防控制中心硕士掌位论文 ?肿 细 .? 胞 存 活 套 轴.? .? ? ?? 组剐 图.茶氨酸对原代培养大鼠皮层神经细胞经损伤处理后细胞存活率的影响 互?。,重复三次,?与阴性对照组有显著性差异,.,与组有显著性差 异,. 按照下述公式计算各保护剂对细胞的死亡保护率: %. 细胞死亡保护率对照组细胞死亡率一各保护组细胞死亡率 计算结果如表?。对各组均值进行分析和 ?单侧检验, 分别比较各组死亡保护率均值与对照组有无显著性差异,结果表明各组均值 之间无显著性差异., 单侧检验茶氨酸各保护组细胞死亡 保护率均与保护组无显著性差异.。但是从数值上,我们可以看出, 茶氨酸 ?一和 ?。的保护率数值相对其他各组较小。结果如图 ?及表~。中国疾病预防控制中心硕士掌位论文 表.茶氨酸对谷氨酸致大鼠皮层神经细胞细胞兴奋性损伤后的死亡保护率 士,两,重复三次 阴性对照组 ?.。一 .’. 组别 ?~’~ .. .. .士. .士. 一 保护率% 保护组 损伤组 组别 .?. .一 ?. 一 .. .土. 】.士. .. 保护率% 该组保护率均值小于对照组均值,有显著性 该组保护率均值等于对照组均值; 差异... 细胞死亡保护奉毋 图茶氨酸对谷氨酸致大鼠皮层神经细胞兴奋性损伤后的死亡保护率 ,,王士, ..中国疾病预防控制中?啊炙士掌位论文 讨 论 近年来,随着动物保护观念的普及及细胞生物学技术的不断进步,体外实验 在毒理学药理学研究中发挥着越来越重要的作用。在各种体外实验方法中,细胞 培养是最为常用的一种。在神经科学领域,相对于其他各种建系的细胞来说,原 代神经细胞具有更好的生物利用性,被越来越多地应用于神经科学研究。 茶氨酸是茶叶中最主要的氨基酸,它由于与体内重要的兴奋性氨基酸谷氨酸 具有类似的化学结构而可能具有拮抗谷氨酸兴奋性毒性的功能。对此方面的研究, 国外近十年有不少报道,但以体内动物实验为主。虽然体内动物实验与人体内的 代谢情况较相似,更有说服力。但是由于体内存在多种影响因素,要证明某一单因 素的具体作用,其说服力反而受限。本研究拟通过建立谷氮酸对原代培养大鼠大脑 皮层神经细胞的兴奋性损伤模型,研究茶氨酸对兴奋性氨基酸毒作用的干预效果。 在此部分中,我们首先对茶氨酸自身的毒性进行了研究。 本研究采用 来测定茶氨酸本身对神经细胞存活率的影响。 是近年发明的用来定量检测细胞活力的一种物质,可以用于评价多种化学 物质的细胞毒性。由于它对活细胞几乎没有毒性,可以实现多个时间点的连续观 察。因而得到了越来越广泛的应用。在本部分我们采用了细胞和混合培养原 代神经细胞在孔板内进行了存活率的测定。从实验结果可以看出,茶氨酸对两 种细胞的均在.。以上,而且在?。及其以下的剂量中, 茶氨酸本身对细胞和原代大鼠神经细胞都没有任何可观察到的毒性。其结果 与之前文献报道“茶氨酸的,。值为/.以上,为“安全无毒物质”, 为 /./。是基本一致的。 验证了茶氨酸本身的安全性范围之后,我们用 方法初步摸索了 茶氨酸的保护剂量范围。在本实验中,作者采用,,,,,, ?个剂量的茶氨酸对兴奋性氨基酸对大鼠原代皮层细胞的毒性损伤实行 保护,并同时用受体阻断剂做保护剂对照。是 非竞争性受体拮抗剂,是目前公认的治疗缺血性脑损伤较好的化合物,同时 也是脑缺血实验研究经典的工具药‘矧。大量文献报道其在体内及体外均具有良好中国疾病预防控制中心硕士掌位论文 的抗脑缺血或神经保护作用【。 从本文实验结果可以看出,茶氨酸各保护组及《保护组细胞存活率均与 阴性对照组无显著性差异.,只有损伤组细胞存活率显著低于阴性对 照组.。说明我们实验所用剂量的对神经细胞产生了预期的毒性,并 且包括各剂量茶氨酸在内的保护剂对对神经细胞造成的细胞活力下降都产生了一定的保护作用。而以损伤组为对照,、、、、 茶氨酸保护组与保护组细胞存活率均显著高于损伤组.,但、?“茶氨酸保护组细胞存活率既与损伤组无显著性差异., 也与阴性对照组无显著性差异.,其数值介于二者之问。说明,、、 、、 ?。剂量的茶氨酸在体外可以对造成的神经细胞活力下 降产生显著的神经保护作用,但是、??。剂量的茶氨酸对的兴奋性损伤有一定的拮抗趋势,但是作用却不够显著。其原因,笔者认为, 的剂量的茶氨酸浓度较低,可能不足以拮抗 ?的兴奋性毒作用; 而 ?。剂量的茶氨酸作用效果不佳,其原因可能与茶氨酸本身的作用 机制有关,也有可能是这一浓度的茶氨酸已经对细胞存活率产生了不良影响。 为了迸一步比较各剂量组茶氨酸的保护作用大小及可能存在的剂量反应关 系,我们又换算了各剂量组茶氨酸对细胞的死亡保护率。这是一个更为直观 的指 标,结果显示茶氨酸各剂量组保护率与组无显著性差异,说明茶氨酸与 一样可以在体外拮抗的兴奋性损伤,产生明显的神经保护作用。虽然各 组死亡保护率数值在统计学上无显著性差异,但是相比之下,?’和 ?‘茶氨酸组细胞还原率还是相对较低。此前,等曾经以 法测定茶氨酸对体外培养大鼠大脑皮层神经细胞兴奋性损伤的保护作用, 设定了、、、、、??个剂量组,同时设阴性对照、损伤 对照和对照。其结果为和?“的剂量的茶氨酸都没有显著的神经保 护作用,而?。的茶氨酸保护组细胞存活率是最高的,而在‘以上 的几个有效保护剂量组内肛剂量组细胞存活率是最低的。由于原代神 经细胞的培养中细胞容易聚集成团生长,细胞密变异较大,所以我们可以认为本 部分的实验结果与等【的报道基本上是一致的。中国疾病预防控制中心硕士学位论文 本部分设计的个剂量的茶氨酸均可以明显降低原代神经细胞对兴奋性氨 基酸毒性的易感性,产生显著的神经保护作用,但最低和最高两个剂量的茶氨酸的 保护效果不够显著。从本次结果和等】的报道来看,茶氨酸的神经保 护作用剂量反应关系曲线很可能不是一条直线,而是呈开口朝下的抛物线状。其 对神经细胞兴奋性损伤的保护率在?剂量以下与茶氨酸的剂量成正比, 但是在斗?。剂量以上,反而随着茶氨酸剂量的增加而减弱。其原因可能与 茶氨酸的神经作用机制有关,下面本文就对此进行进一步的探索。中国疾府预防控制中心硕士掌位论文 第二部分:茶氨酸对原代神经元兴奋性损伤的保护作用机制 的初步研究 年,等首次发现口服谷氨酸可破坏新生小鼠缺乏血脑屏障保护的 脑神经元【引,此后一系列的研究证明了谷氨酸参与了脑缺血神经元损伤的病理生 理过程【。在第一部分的研究中,我们已经利用原代培养的大鼠神经细 胞初步证实了茶氨酸对谷氨酸兴奋性毒性的拮抗作用。在这一部分,我们将进一 步从谷氨酸兴奋性毒性通路上选取指标,了解并寻找茶氨酸拮抗谷氨酸兴奋性毒 性的作用位点和可能机制。 谷氨酸兴奋性毒作用的主要作用机制是由于谷氨酸与受体结合,引发大量的 内流,同时激活细胞内库的释放,导致细胞内游离’超载,激活了各种 降解酶、引发及各种氧化自由基释放并造成线粒体功能障碍,最后导致细胞坏 死或凋亡。因此,我们分别测定了谷氨酸兴奋性损伤后神经元内或细胞培养液上 清中的、、、一的水平,期待从各个环节的一系列指标的反 应中去探讨茶氨酸的作用机制和效果。 在神经细胞培养方法的选择上,常见的方法是将神经元与胶质细胞进行混 合培养,这种方法虽然很好的模拟了体内神经元与胶质细胞共同生长的状态,但 是由于神经胶质细胞在体外生存能力远远强于神经元,所以培养一段时间之后就 会出现胶质细胞过度生长而使神经元生长发育受限制的现象;另外,神经元与神 经胶质细胞混合生长,也给实验后期指标的测定及作用机理的讨论带来一定的干 扰。因此本文在本部分研究中采用了白雪澍等人建立的利用胶质细胞滋养层进 行分离式原代神经元培养的方法,将胶质细胞和神经元在同一培养基中的两个层 面上进行培养,通过大量胶质细胞向培养基中释放足够的神经营养因子以供神经 元生长所需,又不至于因胶质细胞过度生长而影响神经元的生长,而且长有神经 元的盖玻片可从培养皿中自由取出,从而,最大程度上实现了体外受试体的优化。中国疾病预动控制中心司士掌位论文 材料与方法 .材料 .实验动物和受试细胞 实验中取原代大鼠神经元所用乳鼠为新生一天大鼠,由北京康蓝 生物技术有限公司协和医科大学实验动物研究所提供。 原代大鼠神经元制备方法参考白雪涛口川建立的利用胶质细胞滋养层进行 分 离式原代大鼠神经元培养方法。据文献报道【加】,此方法培养的神经元纯 度在 %左右。 .受试物及试剂 一茶氨酸由日本太阳化学株式会社惠赠,为生物合成品,纯度为%以上。 培养基、硫酸链霉素、胰蛋白酶为公司产品。 一、卵清蛋白、丙酮酸、多聚赖氨酸、、、二甲基 亚砜、谷氨酸等均为公司产品。 胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司。 青霉素为华北制药股份有限公司生产。 注射用盐酸阿糖胞苷购自中国医学科学院肿瘤医院。 一氧化氮测试盒化学法测‘、乳酸脱氢酶测试盒等生化 分析试剂盒购自南京建成生物技术有限公司。 免疫组化用试剂盒、兔试剂盒、一抗稀释液、香味封片剂等均购自北 京中杉金桥生物技术有限公司。 一抗、一抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司,为 公司产品。 实验中所用其他试剂均为市售分析纯。 .主要实验仪器设备 细恒温胞培养箱公司型 低温高速离心机 刑.型 北京医用离心机厂.型 普通离心机中国疾病预防控制中心硕士学位论文 . 全自动生化分析仪全波长酶联免疫监测仪 倒置相差显微镜 公司型 水浴恒温振荡器 江苏金坛荣华仪器制造有限公司.型 超净工作台 北京昌平长城空气净化工程公司 .主要工作溶液的配制 .’液: 同第一部分“材料与方法”.。 无”’液:同第一部分“材料与方法”.。 胶质细胞接种培养基:同第一部分“材料与方法”.中高糖培养基 的配制。 .%胰蛋白酶消化液:称取.胰蛋白酶粉, ,加入’溶 液,室温振荡?,如果混浊,则在冰箱中放置一夜后再用.. 滤器过滤除菌,置冰箱中保存。 .保持液:每含 、终浓度为.%的卵清蛋白 、双抗,另 、 丙酮酸终浓度为 用配好的高糖补足至。 多聚赖氨酸处理液:称硼酸、硼砂用双蒸水溶解后再加过滤器过滤,分装 多聚赖氨酸 ,用三蒸水定容至。. ?冻存。 .方法 .细胞的收获及培养加 ..大鼠原代胶质细胞滋养层的培养 取一离心管加毫升胶质细胞接种培养基备用,另取两只空管备用。取 一培养皿加一半胶质细胞接种培养基备用。 取两只乳鼠放小烧杯中,喷洒%酒精皮肤消毒五; 用无菌镊子取出乳鼠,用剪刀断头,将头放入前述培养皿的盖中,用 齿镊夹住眼球部位固定,沿中线切开皮肤,从后向前剪开颅骨,再向两侧侧 切,用小止血钳撕去颅骨,从鼻侧入钳将全脑取出放入已有胶质细胞接种培 中国疾病预防控制中心硕士掌位论文 养基的的培养皿中。 在解剖显微镜下分离取下两侧大脑半球,剥离脑膜及血管后放入己加胶 质细胞接种培养基的离心管中。用无菌玻璃滴管轻轻吹打?次,静置 。 吸取上清,放入另一离心管中,加胶质细胞接种培养基至,吹打 一次,离心转/分,。 去上清,加胶质细胞接种培养基至,吹打?次,进行活细胞计数,调 整细胞密度到×个/左右,将细胞接种到孔板中,置细胞培养箱 ?%培养。 第二天用新鲜配制的胶质细胞接种培养基换液,以后每?换液一次。 培养一后,细胞呈亚融合状态,适合于神经元的培养。在接种神经元的 前一天晚上用.保持液换液备用。 ..大鼠原代神经元的培养 取直径盖玻片数十片,双蒸水浸泡漂洗次,每次,放入盛有浓硝 酸的玻璃缸中浸泡,然后用双蒸水漂洗次,每次一,度烘箱烘 干,最后将玻片放进锥形瓶中,?干热消毒,备用。 将盖玻片放入无菌玻璃平皿中,用玻璃滴管蘸取融化的石蜡,在每个盖 玻片上点个三角形分布的蜡点,然后紫外灯照射,然后每个盖 玻片蜡点侧点肛多聚赖氨酸,盖上平皿盖放入一湿盒中,常温过夜备用。 第二天将玻片取出,用无菌蒸馏水清洗三次,每次;然后取所需数量六 孔板,每孔移入一个盖玻片,蜡点朝上。每皿加入胶质细胞接种培养基?, 放培养箱备用不宜超过。 取、培养皿各一个,加入至一半。 取出生?天大鼠?只,取所需部位皮质放入培养皿中,快速剪碎, 移入~离心管中,加至.,再加.%胰酶.,置培养 箱?消化。 吸除上清,加 ,用手指轻弹振后静置。 吸除上清,加 ,吹打?次,静置。吸取上部进行细中国疾病预防控制中心硕士掌位论文 胞计数。 从上部吸取适量细胞悬液入一无菌瓶中,加入胶质细胞接种培养基调整细胞 密度到×个/接种于所备放有盖玻片的六孔板中,置细胞培养箱? %培养。 将贴壁了的神经元细胞连同盖玻片移入之前培养好的胶质细胞培养板中,蜡 点朝下,每孔一个,置细胞培养箱?%温箱中培养。 第二天加阿糖胞苷终浓度岫/抑制胶质细胞的生长。每或天更换 一次.保持液,每次换液量为/。 .受试物处理方式及指标测定 ..茶氨酸对原代培养大鼠大脑皮层神经元损伤处理后漏出量的影响 六孔板中分离式培养原代大鼠大脑皮层神经元?左右,取三板细胞,分 为组,每组孔,分别为阴性对照组、损伤组、保护组、、、 岬/茶氨酸保护组。 取出细胞,弃培养基,按照第一部分“材料与方法”..中所述方法,阴性 对照组和损伤组加入不完全培养基,各茶氨酸保护组加入不同浓度的茶 氨酸保护工作液,保护组加入工作液,作用;后,换入 岬/谷氨酸工作液作用;然后,弃去谷氨酸,重新加入茶氨 酸工作液或工作液,阴性对照组和损伤组加不完全培养基,继续 作用。 后,取细胞培养液上清,移入. 管中,按照南京建成生物 工程有限公司生产的试剂盒所述方法,用全自动生化分析仪测定细胞培 养液上清中含量。 ..茶氨酸对原代培养大鼠大脑皮层神经元损伤处理后释放量的影响 按照..中方法取细胞,加受试物作用,前后满后取细胞上清液。 加入. 本身半衰期很短,取出后迅速移取 管中待测。 按照南京建成生物工程有限公司生产的测定试剂盒化学法步骤,分别 的 取 三蒸水和 /亚硝酸钠作为空白对照和标准对照 管,依次加入号和号试剂,漩涡混匀器混匀后放置。中国疾病预防控制中心硕 士掌位论文 ,加入显色剂 ,混匀后放置, /离心,取上清 依次将各管上清液移入孔板中,置酶标仪中测定吸光度,水调零。 岬/々一?自/准空自/ ..茶氨酸对原代培养大鼠大脑皮层神经元损伤处理后表达量的影响 】按照..中方法取细胞,加受试物作用,取出细胞上清测定的同时, 另取有神经元贴壁生长的盖玻片,去掉蜡点,细胞面朝上,洗两遍。 丙酮冰上固定 洗次,每次: 滴加%过氧化氢去离子水去除内源性过氧化物酶活性,孵育?; 洗次,每次; 滴加封闭用正常山羊血清工作液,室温孵育?;倾去,勿洗; 滴加用一抗稀释液:稀释的一抗两滴,放过夜; 洗次,每次; 滴加生物素标记山羊抗兔、大鼠等,孵育; 洗次,每次; 滴加辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素工作液,孵育一; 洗次,每次; 滴加工作液显色?;放显微镜下看到细胞显橙色即可; 自来水充分冲洗,梯度酒精脱水; 二甲苯透明,香味封片剂封片,显微镜下拍照, .分析。 ..茶氨酸对原代培养大鼠大脑皮层神经元表达量的影响 按照..中方法取细胞,加受试物作用。取有神经元贴壁生长的盖玻片, 去掉蜡点,细胞面朝上,洗两遍。 按照..中方法依次固定、封闭。 滴加滴加用一抗稀释液:稀释的一抗两滴,放过夜; 依次滴加生物素标记二抗、/。 显色。 梯度酒精脱水,二甲苯透明,封片剂封片,显微镜下拍照, .中国疾病预防控 制中心硕士掌位论文 分析。 .数据处理和统计方法 免疫组化实验所得细胞图片,利用 .进行光密度分析。每张 图片用该软件自动识别出着色部位,然后对这些部位的平均光密度值进行测 定,用各个图片中的平均光密度数值来代表每张玻片上所拍视野内所有神经 元中 目标蛋白的平均表达量。 所有计量资料数据采取牙表示,采用 .统计软件分析,组间比 较首先分析各组数据是否服从正态分布,并检测方差齐性,如果数据符合正态分 布并且方差齐,然后采用单因素方差分析及 单侧检验。中国疾病预防控制中心硕士掌位’沦文 结 果 .茶氨酸对致原代培养大鼠大脑皮层神经元兴奋性损伤后细胞上清液中 含量的影响 原代培养大鼠大脑皮层神经元经一损伤处理后,细胞培养液上清 中含量有所增加。经分析结果显示,组细胞培养液上清中含量 单侧检验,各组细胞培养液上清 没有显著差异