蛋白质含量测定法

实验一 蛋白质含量测定法 [实验目的] 1． 掌握考马斯亮兰法（Bradford法）测定蛋白质含量的方法 2． 掌握紫外吸收法测定蛋白质含量的方法 一、考马斯亮兰法（Bradford法） [实验原理] [器材与试剂] （一） 器材 1． 722型和753型可见光分光光度计 2． 漩涡混合器 3． 试管16支 （二） 试剂 1． 蛋白质溶液，用牛血清清蛋白（BSA），配制成1.03mg/ml和0.103mg/ml。 2． 考马斯亮兰G-250染料试剂：称100mg考马斯亮兰，溶于50ml 95%的乙醇后，再加入120ml 85% 的磷酸，用水稀释至1升。 [实验方法] 1． 标准方法 （1） 取10支试管，分别编号后按 表1-1 剂量依次加入标准蛋白（或未知蛋白）、去离子水和考马斯亮兰染料。每支试管加完后，立即在漩涡混合器上混合。 （2） 加完染料20min后，使用722分光光度计（灵敏度4），塑料比色皿，在595nm处测量吸光度A595。 （3） 用标准蛋白浓度（mg/ml）为横坐标，用A595为纵坐标，进行直线拟合，得到标准曲线。根据测得的未知样品的A595，查表即可求得未知样品的蛋白质含量。 2． 微量法 取10支试管，分别编号后按 表1-3 剂量依次加入稀释的标准蛋白（或未知蛋白）、去离子水和考马斯亮兰染料。其他步骤同上，不过使用753分光光度计（狭缝4）。 3． SDS干扰实验 （1） 取5支试管，分别编号后按表1-5剂量依次加入标准蛋白、SDS、去离子水和考马斯亮兰染料。每支试管加完后，立即在漩涡混合器上混合。 （2） 加完染料20min后，使用753分光光度计（狭缝4），塑料比色皿，在595nm处测量吸光度A595。 [实验数据与结果分析] （一） 标准方法的数据和图 表1 考马斯亮兰标准法实验表格 管号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 标准蛋白质 （1.03mg/ml） 0 0.01 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10       未知蛋白质 （约0.5mg/ml）               0.04 0.08 0.10 蒸馏水 0.1 0.09 0.08 0.06 0.04 0.02 0 0.06 0.02 0 考马斯亮兰 G-250试剂 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 对应的吸光度A595 0.200 0.311 0.362 0.483 0.624 0.752 0.845 0.387 0.501 0.572                       根据表1，以A595为纵坐标，标准蛋白质量/（μg）为横坐标，作图1。 图1 考马斯亮兰标准法 根据线性拟合公式y=6.1884x+0.2287计算所测溶液的蛋白质的含量分别是8号管0.637mg/ml，9号管0.5547 mg/ml，10号管0.550 mg/ml。因为8号管测出结果误差太大，取9和10管的平均值，所以，未知溶液的蛋白质含量为0.5524 mg/ml。 （二） 微量法的数据和图 表2 考马斯亮兰微量法实验表格 管号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 标准蛋白质 （0.103mg/ml） 0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0       未知蛋白质 （约0.5mg/ml）               0.4 0.8 1.0 蒸馏水 1.0 0.9 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0.6 0.2 0 考马斯亮兰 G-250试剂 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 对应的吸光度A595 0 0.088 0.184 0.292 0.411 0.542 0.631 0.171 0.289 0.362                       根据表2，以A595为纵坐标，标准蛋白质量/（μg）为横坐标，作图2。 图2 考马斯亮兰微量法 根据线性拟合公式y=6.0579x+0.0305计算稀释10倍后的未知溶液的蛋白质含量分别是8号管0.05798 mg/ml，9号管0.05334 mg/ml，10号管0.05472 mg/ml。取平均值再乘10倍，得未知溶液的蛋白质含量为0.5534 mg/ml。 （三） SDS干扰数据和图 表3 考马斯亮兰SDS干扰实验表格 管号 1 2 3 4 5 6 标准蛋白质 （1.03mg/ml） 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 SDS (1mg/ml) 0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 蒸馏水 0.9 0.8 0.7 0.5 0.3 0.1 考马斯亮兰 G-250试剂 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 对应的吸光度A595 0.423 0.336 0.275 0.200 0.213 0.198               根据表3，以A595为纵坐标，SDS浓度为横坐标，作图3。 图3 考马斯亮兰SDS干扰实验 由上图可以看出，十二烷基硫酸钠(SDS)对考马斯亮兰法测蛋白质含量有干扰，同是0.103mg/ml的标准蛋白与3.0ml考马斯亮兰，但随着SDS浓度的增加，其混合液的595nm处的吸收峰逐渐降低，而后有一小段回升，最后趋于渐近线。 二、紫外吸收法 [实验原理] 280nm的光吸收法：蛋白质分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸在280nm处有最大吸收。 215nm与225nm的吸收差法：蛋白质因为含量低而不能使用280nm的光吸收测定时，可用215nm与225nm吸收值之差，通过标准曲线法来测定蛋白质稀溶液的浓度。 肽键测定法：蛋白质溶液在238处的光吸收强弱，与肽键的多少成正比。可以测238nm处吸收值，通过标准曲线法来测定蛋白质稀溶液的浓度。 [器材与试剂] （一）  器材 1．SPECORD200分光光度计 2．漩涡混合器 3．试管12支 （二） 试剂 1． 标准蛋白质溶液，用牛血清清蛋白（BSA），配制成1.03mg/ml。 [实验数据与结果分析] （一）紫外280nm吸收法数据和图 表4 紫外280nm光吸收法 管号 1 2 3 4 5 6 BSA (1.03mg/ml)体积 0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 H2O 5.0 4.0 3.0 2.0 1.0 0 BSA浓度（mg/ml） 0 0.206 0.412 0.618 0.824 1.03 A280 0 0.158 0.270 0.379 0.514 0.645               根据表4，以A280为纵坐标，SBA浓度为横坐标，作图4。 图4 紫外280nm光吸收法 根据直线拟和方程y=0.6105x+0.0132求解当标准蛋白（牛血清清蛋白） 与文献值6.3比较接近。 （二） 紫外215nm与225nm的吸收差法的数据和图 表5 紫外215nm与225nm的吸收差法 管号 1 2 3 4 5 6 未知 BSA (1.03mg/ml) 体积 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5   H2O 5.0 4.9 4.8 4.7 4.6 4.5   BSA浓度(μg/ml) 0 20.6 41.2 61.8 82.4 103   A215 0 0.287 0.459 0.794 1.090 1.401 0.574 A225 0 0.165 0.264 0.439 0.621 0.803 0.286 吸收差△ 0 0.122 0.195 0.355 0.469 0.598 0.288                 根据表5，以吸收差△为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标，作图5。 图5  215nm与225nm吸收差法 把未知蛋白质溶液稀释10倍后测得的吸收差0.288带入上图直线拟和方程y=0.0058x-0.0095得稀释10倍后的蛋白质浓度为51.83μg/ml，则原未知浓度溶液的蛋白质含量为0.518mg/ml。 （三） 肽键测定法数据和图 表6 肽键吸收法 管号 1 2 3 4 5 6 未知 BSA (1.03mg/ml) 体积 0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5   H2O 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5   BSA浓度 (μg/ml) 0 103 206 309 412 515   A280 0 0.190 0.301 0.541 0.735 0.921 0.441                 根据表6，以A238为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标，作图4。 图6  肽键测定法 把未知蛋白质溶液稀释1倍后测得238nm的吸收值为0.441，带入上图直线拟和方程 y=0.0018x-0.0125得稀释1倍后的蛋白质浓度为251.94μg/ml，则原未知浓度溶液的蛋白质含量为0.503mg/ml。 [结论]： 1．   考马斯亮兰标准法测得未知溶液中蛋白质含量为0.5524mg/ml, 用微量法测得未知溶液中蛋白质含量为0.5534mg/ml，最终结果相差不大，但是标准法所测的三个数据明显比微量法测得数据标准偏差大，这说明微量法比标准法实验稳定性高，准确性高。 2．   干扰考马斯亮兰方法的物质中，我们主要对SDS的干扰情况作了分析：总体上，当溶液中存在一定量的SDS后所测得的吸光度比正常值相对减小。但是随着SDS浓度的增加，吸光度的减小量没有呈现出很明显的规律。从SDS与蛋白质的作用机理来看，SDS可以断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构。SDS和蛋白质结合后使蛋白质-SDS复合物上带有大量的负电荷，平均每两个氨基酸结合一个SDS分子，这时各种蛋白质分子本身的电荷完全被SDS掩盖。由于SDS 的存在，阻碍了染料与碱性氨基酸和芳香族氨基酸的结合，使得吸光度减小。由于SDS与染料分子对蛋白质的竞争结合，使得显色减弱，吸光度值降低，因此在曲线前段呈下降趋势；但由于SDS破坏氢键，使得蛋白质的空间结构更加伸展，一些原来包裹在结构中的碱性氨基酸和芳香族氨基酸暴露出来，所以会有少量的吸光度回升；但最终SDS与蛋白质的结合达到所处溶液条件下的“饱和”时，过量的SDS就不起作用了，曲线是最后为平缓段。 要去除SDS的干扰，可以利用它与K+结合生成沉淀的性质将其去除。K+对考马斯亮兰方法不产生干扰。 3．   紫外280nm吸收法中，从文献中查得牛血清清蛋白的 。实验得出 相对误差为： 4． 紫外吸收差法和肽键测定法所测的未知溶液蛋白含量分别为0.518mg/ml 和0.503mg/ml，与考马斯亮兰法的结果有差距，这与两个方法用蛋白质分子中不同的物质的测量值近似代替蛋白质含量有关。考马斯亮兰染料主要与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合，测吸收峰；而紫外吸收法是测酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有的共轭双键。 [思考与讨论] 1.用考马斯亮兰法G-250测定蛋白质含量有何特点，操作过程中应注意什么？ 答：Bradford 法的优点是（1）灵敏度高，其最低蛋白质检测量可达1μg。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质-染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化很大。（2）测定快速、简便、只需要加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要5min左右，颜色在5min至20min之间稳定性也很好。（3）干扰物质相对其它方法少。缺点是（1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差。（2）仍有些物质干扰此法测定：去污剂、Triton X-100、十二烷基硫酸钠（SDS）和0.1mol/L的NaOH。（3）标准曲线也有轻微的非线性。  操作注意事项：不可使用石英比色皿，可用塑料或者玻璃比色皿，使用后立即用少量95%的乙醇荡洗，以洗去染色。塑料比色皿决不可以用乙醇或丙酮长时间浸泡。 2.考马斯亮兰G-250和R-250各有何特点，在电泳染色方面有何异同？（详见讲义参考文献12.） 答：考马斯亮兰G-250和R-250的结构式不同，配方不同，染色方法也适合于不同性质的蛋白。考马斯亮兰R-250即三苯基甲烷（triphenylmethane）。每个分子含有两个-SO3H，偏酸性，与蛋白质的碱性集团结合。在一定pH时，染料—蛋白复合物可以被完全解聚。与不同蛋白结合呈现基本相同的颜色，并且在比较宽的范围内(15-20μg)，扫描峰的面积与蛋白量有线性关系。通常用先固定，再进行染色和脱色的方法。考马斯亮兰G-250即二甲花青亮兰（Xylene Cyanine Brillian Blue）其染色方法经常是对蛋白质同时进行固定和染色。这种方法的特点是快而简便，有时甚至不需脱色。但灵敏度略逊于R-250。同时考马斯亮兰G-250对小肽染色效果很好。