谷氨酸发酵生产的过程优化与控制研究

谷氨酸发酵过程优化与控制研究 【摘要】:谷氨酸产生菌既是谷氨酸发酵反应过程的主体,也是反应过程的生物催化剂。通过对影响谷氨酸发酵生产的菌种、原料、发酵环境条件等因素进行,指出采用代谢优化生产菌种和发酵工艺,能够使菌种发酵的综合技术得到不断提高。 关键词:谷氨酸发酵;菌种;流加糖;生物素;发酵环境条件;控制 谷氨酸发酵生产是谷氨酸产生菌在其生命活动过程中分解、代谢营养物质、合成所需产物———谷氨酸的生化过程。在这个过程中,影响谷氨酸产生菌生长、繁殖、代谢及合成产物的因素很多,通过人工干预有目的地控制这些因素,使其最终满足谷氨酸菌种的代谢合成需要,可以达到增加产物、降低消耗的目的。谷氨酸产生菌既是反应过程的主体,也是反应过程的生物催化剂,它摄取原料的营养,通过细胞内特定的酶系列进行复杂的生化反应。其底物中的反应物透过细胞壁和细胞膜进入细胞体内,在酶的作用下进行催化反应,将反应物转化为产物并释放出来,细胞的内在特性及其代谢规律是影响生化反应的关键因素。因此,发酵是一个比其他工业过程更为复杂的动态过程。 1 选育优良菌种 高产、纯正、优良的菌种是保证发酵成功的前提,因此优良生产菌种的选育一直是谷氨酸发酵的主要研究课题。谷氨酸发酵一般采用黄色短杆菌(Brevibacterium fLavum)为出发菌株,根据代谢控制发酵原理进行人工诱变,定向选育高产率的菌种。 在菌种的保藏和培养过程中,与一切生物发酵生产一样,菌种是发酵生产成败的内因,生产选用高产、纯正、优良的菌种,必须做好 5 个方面的控制:①严格保藏温度和干燥的环境,满足菌种不变异、不退化、不污染的条件。保藏菌种要经分离、纯化、筛选,要有专门的冷藏设备,周围的环境要清洁无污染,对于细菌的保藏可采用- 80 ℃冰箱保藏液体菌种的方法。②生产使用的菌种要尽量减少传代次数,斜面菌种一般以 2 代~ 3 代可用于生产的为佳。③严格菌种培养的原,试剂原料经过摇瓶和生产试验后,要基本固定规格和生产厂家。有机原料更换批号要做摇瓶试验,每批都要留样做下批试验的对照。④一级种子的 培养要严格摇瓶培养间的温度、无菌等级,有条件的情况下摇瓶间可送无菌风。要保证摇床的转速和振幅,经常检查摇床的皮带或齿轮是否松动。⑤控制好一级种子下瓶的时机,除进行OD (光密度)的检测外还可进行湿菌体或用血球计数器计数检测,镜检菌体的形态和同步性,同时要尽量缩短一级种子的冷冻时间,为下一步的扩大再培养提供活力强、同步性好、数量多、无污染的一级菌种。 2 流加糖的控制 流加糖工艺的关键技术在于开始流加的时机的选择、流加过程中的流加速度、流加期间残糖的含量及流加糖量占总投糖的比例。根据菌种的耗糖能力、生物素,在采用适量法的工艺条件下,总投糖含量为18%左右的转化率较高,投糖超过20%的转化率就有低于58.0%的危险(转化率低于58.0%对淀粉的单耗和成本造成升高的影响),投糖量过低虽然可以提高转化率,但产酸低、影响设备利用率和能源的消耗。 2.1 初糖浓度 一般情况下,大罐初糖12%~14%、菌种10 h左右达到平衡,初糖15%~16%、菌种12 h 左右达到平衡,12 h 的转化率为55.0%左右;初糖16.0%以上菌种要在14 h 左右达到平衡,12 h 的转化率一般为52%左右。总之,初糖含量的要考虑对菌种生长和转化率的影响也要考虑到发酵培养基的平衡,在发酵周期30 h 左右、流加糖含量为36.0%左右的条件下,初糖设计含量为14%~16%是比较适当的。如果流加糖含量提高至50.0%以上,初糖质量分数设计在13%~14%即可。 2.2 流加时间 选择适当的时机是相当重要的,对发酵的产量有很大影响。补糖的时机不能单纯以培养时间作为依据,要根据糖的耗用速度、值变化、残糖的高低、菌体活力、菌体形态是否转型等因素判断比较符合实际。补糖的时间原则是控制微生物的中间代谢,使之向有利于产物积累的方向发展。能控制菌体量的增加、糖的消耗速度与发酵单位增长三者之间的关系,就可获得更长的生物合成期,以利于谷氨酸的积累。其控制要点是谷氨酸生产菌转型期和乳酸峰值期相结合进行糖流加。开始流加时机应以残糖量、耗糖速度、菌体的活力和转型情况为依据,通过耗氧及需氧情况的计算显示,发酵残糖在5.0%~2.0%时是流加糖的最佳时机。在流加过 程中流加速度主要根据残糖量控制,根据生产经验残糖控制量为 2.0% ~1.0%、流加糖占总投糖的60%~70%时产酸和转化率较为理想。 糖液质量直接影响谷氨酸发酵生长、耗糖速度,进而影响产量和酸糖转化率, 控制好糖液的质量是发酵成功的基础,糖液的质量应该是具有高DE 值(97%以上)和高DX 值(95.0%以上),复合二糖3.0 以下,三糖、四糖以上的糖含量不超过0.5%。 2.3 流加方式 连续流加比间歇流加控制效果好,这样可以避免一次性大量流加而引起菌体的代谢受到环境突然改变的影响。如此在恒定状态下微生物所处的环境条件,如培养物浓度、产物浓度、pH 值以及微生物细胞的浓度、生长速率等可以始终维持不变,以达到产生大量代谢产物的目的。对谷氨酸发酵而言,其控制要点有以下3 个方面:①流加糖质量分数在45%~50%之间,糖色泽不增加,糖不被分解,蒸发过程中损失尽量减小,蒸发温度不宜过高,时间不宜过长,避免产生焦糖和色素,浓缩前后的糖DE 值(或DX 值)与透光率差距不能过大;②流加糖消毒灭菌温度不宜过高,而且要迅速降温至30 ℃~45 ℃,保压备用;③流加过程中残糖控制量不宜忽高忽低,宜根据糖耗速率控制流加数量,保持残糖含量稳定。 3 生物素的控制 在生物素用量的控制中不但要考虑到培养基中原料(包括玉米浆、糖蜜纯生物素)的生物素总量,同时还要考虑到糖液因玉米淀粉和生产工艺的变化造成的营养素(生物素和维生素)的变化,适时地根据发酵耗糖、产酸及发酵的容氧情况调整培养基中生物素配比,控制生物素用量,充分满足生长、耗糖、合成谷氨酸的需要,并且不能出现负面的影响。在采用生物素适量法工艺控制中,发酵培养基的总生物量控制在10.0 μg/L 以上,与生物素用量相配套的二级种子到大罐的接种量达到10.0%以上,湿菌体量控制1.0 mL/10 mL 以上;大罐初糖采用14%~16%的中高糖发酵,大罐前期(对数生长、转型期、发酵期)的通风量已达到0.35 m3/s~0.45 m3/s,大罐最大湿菌体量达到0.9 mL/10 mL~1.0 mL/10 mL;在低糖(36.0%左右)流加的情况下周期缩短到28 h~30 h,产酸可达到12.0%左右,转化率达到59.0%以上[1]。适量法成功的经验说明,生物素量的设计不是孤立的一个条件,要与其他的工艺条件相配合。 4 发酵环境条件控制 4.1 温度控制 发酵罐温度根据发酵时间进程,在不同阶段按最适宜的微生物生长环境设定温度值。、 4.2 pH 值控制 发酵罐pH 值程序控制根据生产实践长期摸索的规律,确定一条优化设定曲线,采用液氨流加,控制发酵液的pH 值。考虑到pH 值过程的非线性特性,为了提高控制效果,采用了有约束力的非线性补偿控制方法,pH 值的跟踪性能与抗干扰性能都较强,最大稳态误差pH 值不超过0.1。 4.3 压力控制 发酵罐压力的稳定不仅可以有效地防止染菌,减小供风阻力的波动,也有助于气液两相氧气分压的平衡和DO 值的稳定。该系统与空气流量控制系统虽然有明显的关联性,但通过调整控制器的有关参数,可以将这2 个变量分别控制稳定。 4.4 溶解氧控制 在发酵过程中恰当控制溶解氧,改变代谢分布,可以增大谷氨酸产率,减少杂酸的生成。溶解氧最优控制水平为10%左右。在一般情况下,当发酵罐内有富余的空气且搅拌电机转速适中时,通过对搅拌电机转速控制可以得到良好的溶解氧动态过程,而在空气量不足或搅拌电机达到一定转速后,DO 变化受到限制,这时可以通过溶解氧和风量调节回路得到继续改善。 5 结语 目前,国内发酵法生产出谷氨酸的产酸水平和糖酸转化率与国际同行业尚有较大差距。主要体现在以下几个方面:①自动化程度低,生产设备陈旧,生产中多数采用常规仪表来控制温度、罐压、通风量等几个基本物理参数,有些发酵罐甚至连pH 值自动控制也没有。②缺乏对生化参数的自动检测与控制手段,对于表征发酵过程状态的主要生化指标,如菌体浓度、糖酸转化率、产酸率、残糖等基本上由人工在现场采样再到化验室分析。对溶解氧(DO)值、尾气(CO2 和O2 )、呼吸商、耗氧速率、氧利用率等更是很少进行在线检测或计算。③优化控制处于起步阶段,由于间歇发酵过程的批量特点及流加操作的影响,模型参数的分散性、 非线性、时变性、相关性、滞后性以及不可避免的人为干预等影响,使有关底物消耗、菌体生长、产物生成的数学模型付诸实施的可能性较小。 谷氨酸发酵是一个复杂的过程,当前对其发酵过程的控制还需要不断深入,如高产菌种的选育、微生物代谢过程的本质、产物积累、发酵过程动力学模型的建立及应用等还需进一步探讨。影响谷氨酸发酵的因素很多,随着生物技术、计算机自控技术的提升,相信谷氨酸发酵控制技术也会得到不断提升。针对氨基酸行业发酵生产现状,应采用代谢工程等方法,优化生产菌种和发酵工艺,使得菌种发酵的综合技术不断提高,对谷氨酸产业提高国际竞争力具有十分重要的现实意义。 参考文献: 【1】蔡云苓,张恒忠,张兵,等. 谷氨酸发酵主要影响因素及其控制[J]. 发酵科技通讯,2007,36 (3):11- 13. 【2】姜长洪,姜楠,王贵成,等. 谷氨酸发酵过程先进控制[J]. 化工自动化及仪表,2004,31 (2):28- 30. 【3】马占龙. 谷氨酸发酵过程的控制[J]. 发酵科技通讯,2006,35 (3):1- 2.