【doc】变形链球菌表面粘结素与唾液受体结合特异性的初步研究

【doc】变形链球菌表面粘结素与唾液受体结合特异性的初步研究 变形链球菌表面粘结素与唾液受体结合特 异性的初步研究 卜2I 中华口腔医学杂志1999年1月第34卷第1期ChinJSt~natol 变形链球菌表面粘结素与唾液受体结合 特异性的初步研究 ,j 壁皂刘天佳堡岳松龄周学东 【摘要】目的研究变形链球苗表面粘结素与唾液受体问的对应结合关系.方法采用H标 记的变形链球苗(简称变链)竞争性粘附抑制实验及自行的间接酵联免疫受体结合实验,检测纯 化唾液受体与纯化变链表面粘结素问的结台特异性及其强度结果唾液降解片段和相对分子 质量为130(D的酸性蛋白仅促进变链粘附,唾液淀粉酵具有促进粘跗及抗粘附双重作用.相对分子 质量为127000的变链表面粘结素及GTF组分分别可竞争抑制变链对igA降解片段及淀粉酶的粘附. 蛋白质P1和相对分子质量为117000的粘结索可同时竞争抑制变链对此二种唾液组分的粘附;间接 酶联免疫受体结台实验表明各变链粘结索不与igA降解片段有效结合.结论变链在牙面的粘附是 多种 . 论着 |;}Il/ 氟 Astudythecanju~ots臼哪oc??mutantadhe~ssaditssalivaryreceptorsZHAN//ag,uU ,跗M/ngde,dof,WestChinaUn/~yof地删艄,Oa~,da610041 【Abstract】aded1Toinvesti~tethe~~jugafionspec嘶of岛呻)mutans'a曲mand theirsaliwrfreceptors.M酬吣Includepusallva~receptoradhesh伽删耐vehacte6aadhesion inhi~tionte吐andergymelinkedinmmno-receptorassay(ELmA)ollsmutanswD9463A.Results.$elivaz T amylasescanboth魄11日r?ceand删npeIi曲ibittheattentionofthemaintoHA,wluleIgAdegraded 向bandM?=13000proteinonlylm~aoteitsattention.PIar,da117000surface咖i?W瑚嘶,Aboth inhibitadhesionofthestraintodegradedfragmentsandsaliva~a~4asesAn127O?proteinofWD9463A andakindofcJI‰inhi~titsac~esiontoigAdegra~d瑚唧bandsaliw--yamylasesvespectlvely.No e0II}u砸硼wasftmndbet,s~nigAdegra~丘舯bandthe8I瞄,whilereactionb毗weenamylasesandthe a&le~nshadbasically日cdn血眦ewithadbeinhibition.Ctmel~lanTIadheshn0fS.mutans_目a resultofl呻cti0llbetweenmLdtiI|,cep【oandmultiaAheaim 【Keywool&讪,?c琳,历删Bprs,_n-m0c 变形链球菌(血清型C,以下简称变链)对牙面 的粘附是其表面粘结素与牙面唾液获得性膜 (salivaryacquriedpellicle,SAP)受体的特异性结合, 了解其结合的特异性,可为特异性地抑制该菌在牙 面的粘附,控制菌斑形成及防治龋病的发生提供理 论基础.目前,对变链牙面粘附机理的研究已成为 国内外龋病研究的热点,但有关粘附受体配体结合 特异性的研究却很少lI|2J.我们通过对纯化变链表 面粘结素及其SAP受体对变链粘附的竞争抑制实 验和酶联免疫受体粘附实验,探讨了变链粘附受体 配体结合的特异性,以期深入认识变链在牙面粘附 初始阶段的分子机理. 作者单位~61o041成都,华西医科大学口腔医学院(詹玲,刘天 佳,岳梧龄,周学东),基础医学生化教研室(博明德) 和方法 一 ,变链SAP受体,表面粘结素的来源及鉴定 变链SAP受体从实验性SAP中纯化,变链表面 粘结素从细菌培养上清中纯化,二者分别经PAGE, SDS-PAGE,IEP-PAGE确认为单一蛋白质组分.此 外还采用淀粉酶活性测定,GTF活性测定,免疫双扩 散实验,氮基酸组分分析以及细菌粘附或粘附竞争 抑制实验鉴定,筛选受体或粘结素.我们选用了8 种变链SAP受体和4种变链粘结素成分.进行研 究,其组分名称及成分见表1,2. 二,细菌粘附实验 1.细菌的培养及标记:将变链(C)地方株 WD9463A接种于含370MB口/pH.胸腺嘧啶核苷的 , 20中华口腔医学杂志1999年1月第34卷第1期Ch 衰1游离SAP组分对细菌粘附的竞争 抑制实验结果(i,clam) =[1一(实验组一阴性对照 注:SAP:唾液获得性胰;抑制率(%) 组)/(阳性对JfI《组一阴性对照组)j×l帅%}*当实验组<胡性对照 组时,抑制率为100%;**当实验组>阳性对照组时,抑制率为0 T培养基中,微需氧(80%,10%CO2,10%H2) 37?培养l8小时,离心收集菌细胞.Kcl缓冲液洗3 次,将菌细胞悬浮于含5g/L人血清白蛋白的KCI 缓冲液中,55Ohm调A=0.62. 2.纯SAP组分对细菌粘附的竞争抑制实验:用 纯化的SAP组分(0.1?L)包被HA,洗3次,加人血 清白蛋白封闭,后加入8o苗悬液和20}ll纯化 SAP组分(0.5g/L),阳性对照组则加入菌液和加 人血清白蛋白(0.5g/L)37~C旋转l小时,洗3次后 进行液闪计数,阴性对照组用KCI缓冲液包被HA, 其余步骤同阳性对照组.实验均用双孔法. 3.变链表面粘结素对细菌粘附的竞争抑制实 验:用纯化SAP组分包被HA,人血清白蛋白封闭后 加入纯化变链表面粘结素100(O.5g/L),37?旋 转l小时,对照组加100Il1人血清白蛋白,洗3次, 加菌悬液100Ill,处理l小时,洗涤后进行液闪计 数.阳性对照.瑟阴性对照分别用全唾被和Ka缓冲 液包被HA.实验均用双孔法. 三,间接酶联免疫受体结合实验(EIJRA) 此方法根据EUsA实验原理建立.用于直接测 定变链表面蛋白与唾液受体间的结合.实验组,阴 性和阳性对照组分别用100纯化SAP组分(2.5 mg/L),包被缓冲液或纯化变链表面粘结素(10mS/ L),4?过夜,洗3次,1%牛血清白蛋白37?封闭l 小时,洗3次,前两组加入100fIl与阳性对照组一致 的纯化变链表面粘结素,阳性对照组加入洗涤液, 37?保温1小时,洗3次后加入100Ill兔抗变链表 面蛋白粗纯品血清(1:200)37?保温2小时,洗涤, 加入100HRP-羊抗兔I(1:5000)37?保温2小 时.洗5次,加入底物液反应30rain,2moL/L硫酸终 止反应,以波长492lira进行比色. 结果 一 ,纯SAP组分对变链粘附的竞争抑制实验结 果 由表I可见,游离唾液淀粉酶组分可不同程度 抑制变链粘附,其中sAG3和SBG4几乎可完全阻断 变链粘附;而rsA降解片段及相对分子质量为13000 的酸性蛋白的作用很弱. 二,变链表面粘结素对变链粘附的竞争抑制实 验结果 由表2可见,相对分子质量为127000的表面蛋 白可强烈抑制变链对I降解片段的粘附;蛋白P1 对细菌及5种唾液成分的粘附均有较强抑制作用; GTF组分主要竞争抑制细菌与淀粉酶的粘附;相对 分子质量为117000的蛋白可强烈抑制细菌对一 kA片段及2种淀粉酶的粘附. 三,酶联免疫受体粘附实验结果 由表3可见,4种变链粘结紊组份均不与 s日clDl,sBG2Dl发生有效结合;MD3s2,MD3S3, MD5sl可与4种淀粉酶组份有效结合. 讨论 一 ,变链粘附隐匿受体的存在及唾液淀粉酶组 分在其粘附中的双重作用 本研究发现,IgA降解片段及相对分子质量为 13000的酸性蛋白在吸附于HA上时可促进变链的 衰2变链表面粘结素对其与SAP受体粘附的竞争抑制实验 中华口腔医学杂志1999年1月第34卷第1期 ChinJS~matot,Jantuw~1999,Vol34.No.1 表3粘跗相关蛋白ELliL~测定结果 注:此表中的测定结果为阳性对照组与阴性对照组的光吸收值 之比,当比值>21时为阳性 粘附,但不竞争抑制其粘附;在直接测定变链表面蛋 白与各种唾液受体问的结合关系的ELIBA实验中, 它们也不与任何一种测试的变链表面粘结素成分有 效结合,提示它们为变链在牙面的隐匿受体,IsA片 段的促粘附作用也许不是通过抗原抗体反应进行 的,它具有高度的特异性.作者在过去的研究中还 发现唾液中的VoA成分呈现出多型性,而不同表型 的I在变链粘附中的作用亦不同,IsA降解片段 SBG1D1及SBG2D1可促进变链粘附,而其它IsA组 分则作用很弱-,提示口腔内细菌产生的IsA酶的 降解作用可减少sI的抗粘附作用,并增强它对粘 附的促进作用.由于这类受体不诱导细菌凝集,故 不利于细菌的清除,因此在细菌对牙面的粘附中有 十分重要的作用本实验中还发现几种唾液淀粉酶 组分既能明显促进变链对HA的粘附,又可有效地 竞争抑制其粘附,说明它们在变链粘附中具有双重 作用.其中两种酶组分在低浓度时即可完全阻断细 菌粘附,提示其抗粘附作用更为重要. 二,变链表面粘结素与其唾液受体结合特异性 的初步研究 我们通过纯化变链表面粘结素对该菌与纯化 SAP组分包被HA粘附的竞争抑制实验发现:变链 表面相对分子质量为1270C0粘结素可有效抑制该 菌对唾液IsA降解片段的粘附,提示其以IsA降解 片段为受体;P1和相对分子质量为1170C0的表面 蛋白则可同时有效抑制细菌对IsA降解片段和唾液 淀粉酶组分的粘附,提示它们可能有两类受体;而 GTF酶组分MD353主要抑制细菌与淀粉酶的粘附. 故主要以淀粉酶为受体.这一结果提示变链在牙面 的粘附是多种粘结素与多种受体共同作用的结果. 参考文献 lRm枷MW.Ma,mo-P,~etmllhBInteractionbetwemsurface"protein 明tiofSbeptococorsmutatlsandhumansalivm-ycm~otmats.Oral 埘czt/oiollmmmlo1.1989.4:106-1l1 2黄定明.罗宗莲,周学东.等.变链球菌表面蛋白Pl对^唾液接 受嚣的研究.华西口腔医学杂志.1995,13:150-162 3詹玲,傅明德,捌天佳.等.变形链球苗对唾液获得性膜粘附机理 的研究.?变形链球苗表面牯结素的筛选及分离纯化华西口 腔医学杂志,1998.16:76-79 (收稿:19984)4—10罄回:19984,9—14) (本文编辑:孔繁军) 中华口腔医学杂志第五届编辑委员会名单 名誉总编辑 顾问 总编辑 副总编辑 编委 朱希涛 郑麟蕃洪民 张震康 邱蔚六王大章 (按姓氏笔划为序) 于世凤马绪臣 史傻刘正 张志愿肖明振 范振荣罗颂椒 阎福华莫三 曹采方戚道一 傅民魁栾文民李玉晶 王永秀 刘宝林 步荣发 赵士芳 郭天文 潘可风 王邦康 刘洪臣 杨圣辉 赵云凤 袁文化 樊明文 王通谦 孙勤 扬宠莹 赵怡芳 袁祥民 翦新春 王强 宋一平 陈树华 胡永升 徐芸 魏奉才 王植三 李国珍 金友仁 俞未一 凌均荣 邓燕 李秉琦 欧阳喈 俞光岩 宿玉成 边专 李剑农 周学东 段银钟 靖良朋