选矿废水处理系统中微生物群落结构分析（可编辑）

选矿废水处理系统中微生物群落结构分析（可编辑） 选矿废水处理系统中微生物群落结构分析 分类号: 学校代号: : 密级: 学号: 广东工业大学硕士学位论文 工学硕士 选矿废水处理系统中微生物群落结构分析 罗丽丽 指导教师姓名、职称: 塞里缝副数攫 企业导师姓名、职称: 玉 . 专业或领域名称: 还撞工猩 学生所属学院: 坯撞型堂皇王猩堂院四 咖 ? 洲 洲 ?? 四: :. ,,..,摘要 摘要 选矿废水是选矿工艺排水、尾矿池溢流水和矿场排水的统称。选矿废水中主要污 染物是重金属离子、各种有机和无机浮选药剂,选矿药剂种类多,毒性大,物质结构 复杂,大多难以被微生物快速、有效利用,进入环境后可以长期存留,对生态环境和 人体健康构成严重威胁,特别是苯胺类化合物被列为优先环境优先控制污染物,在工 业排水中要求严格控制。用物化法难以保证出水中有机浮选药剂长期稳定达标排放, 长期回用后也会对生产指标产生不良影响,因此研究用生物法处理选矿废水达标排放 或便于回用已是势在必行。 本论文采用厌氧一好氧反应器和序批式生物反应器两种工艺处理模拟选矿 废水,在两个反应器中的活性污泥的培养驯化过程中,分析和浮选药剂的去除效 果及反应器运行期间活性污泥生物相的演化情况,最终驯化出能够有效降解浮选药剂 的微生物,采用.分子生物学手段对反应器处理效果稳定后的微生物群落结 构进行分析。主要研究结论如下: 厌氧.好氧反应器处理选矿废水的挂膜研究结果表明:即可达到较好的启 动效果,反应器运行稳定,总去除率稳定在%。挂膜和驯化期间,系统对 的去除主要集中在好氧反应器,厌氧反应器虽也有一定的去除效果,但去除率远远低 于好氧反应器。反应器启动内,苯胺黑药的降解率从.%逐渐上升至%,乙 硫氮的降解率逐渐上升至%,丁基黄药的降解率从%逐渐上升到%,说明微生 物己驯化成功。 序批式生物反应器处理选矿废水的试验研究结果表明:即可达到 较好的启动效果,反应器运行稳定,去除率最终稳定在%。反应器启动内, 苯胺黑药的降解率从.%逐渐上升至.%,乙硫氮的降解率从.%逐渐上升至 .%,丁基黄药的降解率逐渐上升到%,说明微生物已驯化成功。 虽然苯胺黑药、丁基黄药和乙硫氮属于难降解物质,但葡萄糖等有机物可有 效促进这三种选矿药剂的生物降解。 通过本试验的研究,说明了在工程上应用生物法处理选矿废水是可行的。 通过对反应器内生物膜和活性污泥微生物群落结构的分析得出:各样品 条带数目变化不大,但是亮度还是有差别的,说明整体上微生物的群落结构相广东工业大学硕士学位论文 ,只是某些特定种群的微生物在不同的条件下活力有所不同。各反应器处理效果达 稳定后,其内部菌群结构较为稳定。好氧池内微生物多样性普遍高于厌氧池。另外, 性污泥和生物膜的微生物群落组成存在着差异。生物膜可能更能反映废水微生物群 的结构。 键词: 选矿废水;生物法;微生物群落结构;. , . . ,, , , ? ., , .,.,..,. , ., . :. . . , %. . , . , .% %,%, .%.%广东工业大学硕士学位论文 ? ..%. ,.% .%, .% %. .%, .、 , . ., , .酣. . . 眦,. . : ; ; ; . 目录 目录 摘要。 ?. 目录?...?........??....,?。? 第一章 绪论?.. .本研究课题的来源、目的及意义.. ..课题来源 ..课题的目的?.. ..课题的意义?.. .选矿废水的特点及其危害 ..选矿废水的特点??.. ..选矿废水中污染物质的危害.. .选矿废水处理工艺? .研究微生物群落结构的分子生物学技术? .. 变性梯度凝胶电泳 .. .限制性片段长度多态性??. .. 末端限制性片段长度多样性?.. .. 荧光原位杂交??.. .. 基因芯片??. .本课题主要研究、思路和创新之处.. ..主要研究内容及思路. ..创新之处第二章试验材料与方法 .试验装置与工艺流程??。 ..厌氧一好氧反应器装置 .. 反应器装置..试验用水与接种污泥..试验用水??. 广东工业大学硕士学位论文 ..接种污泥??。 填料的选择。 分析检测项目及测定方法??. .. 浓度的测定??.. ..苯胺黑药浓度的测定【..乙硫氮浓度的测定】??. ..丁基黄药浓度的测定【击? ..生物相观察?. 厌氧一好氧反应器的挂膜研究 反应器的启动。 .污染物的去除效果? .. 的去除效果..三种药剂的降解效果. .生物相观察? .本章小结??. 第四章反应器的试验研究. .反应器的启动.污染物的去除效果.. 的去除效果..三种药剂的降解效果。 .生物相观察. .讨论?..??.??..? .本章小结:??。 ’ 第五章微生物群落结构分析。 .样品的采集和预处理?. ..生物膜样品的采集和预处理。 ..活性污泥样品的采集和预处理??.. .稳定期反应器各处理效率指标的分析测定??. ..厌氧一好氧反应器处理效率? .. 反应器处理效率..目录 .总的提取与纯化??.??:; ..试剂配制..总的提取??. .. 的纯化 .琼脂糖凝胶电泳 ..试剂配制 ..实验步骤??. . 技术??..?.?.??.. .. 扩增体系 .. 扩增程序. . 多子析?.?..? ..实验仪器、材料与试剂..实验步骤??. .结果与分析。?. ..细菌总提取结果??.. .. 扩增结果?....? .. 产物的变性梯度凝胶电泳分析 .本章小结??.??.??.; 结论与建议。 参考文献??。 攻读硕士期间发表的论文。 学位论文独创性声明 学位论文版权使用授权声明?. 波 谢??.?...?.?.... 广东大学硕士学位论文??..?...?....??.??.??..?..?.?. .? 、 ..??.,??. .... ..??. ...?.. .. . . ..??。.... .. ..? ...?.. ... . 、.... ..?..?..??.??.. .. . ..?......? ..?. ? ????????????????????川???? ...?..?...??. ..?..??.. ...??.?. .... ..??. ..??。: .. .?.?.。?.?..?..。? . .??...?..?.. .. ..?.. .??.??...??....??...??.. . .??。? . .??.?..??..:??:?.. ........? . ?.?. . ?..?...??.... .. .??..??..:;;. ..?。... . ..。 ...........? . ..?.. ...?. ....??.? . ..” ......?....??.??.??....??.?...??. ...??..?. ?..、??? .. .. .: .. .. .. ..? . ..??. 。?。.??.??.??.??。?”?”..??.??.?.。?.??。..??.?。.??.??.?. ...””??: 。.?.一”””第一章绪论 第一章 绪论 .本研究课题的来源、目的及意义 ..课题来源 本课题来源于由企业委托的横向课题,对选矿废水进行生物净化处理研究。 项目 名称:选矿废水深度生化处理技术研究与工程设计。 ..课题的目的 用生物法处理选矿废水已是势在必行,处理系统中微生物的组成和相对数量 是一 个十分重要的问题,研究选矿废水生物处理系统中微生物种类及其结构就有 非常重大 的意义。传统的生物处理方法较多的采用活性污泥法和生物膜法,而这种生物法是以 微生物菌群起作用,而微生物菌群具有多样性,这样就很难知道有哪些优势菌在选矿 ? 废水中起主要作用。因此,为了比较彻底地消除回用水中有机药剂对浮选指标的影响, 同时也作为紧急情况下排放选矿废水的可行技术,有必要进行选矿废水生化深度处理 的研究。 ..课题的意义 随着国家环保法律法规的日益严格,我国众多的矿山企业面临越来越大的环保压 力,有的地方政府部门要求矿山企业必须做到废水零排放。选矿废水如何经过适当的 处理后回用于生产过程,是国内矿山亟待解决的一个重要课题。 根据课题组生化深度处理中试系统的运行结果,进水由./降低 到/左右,但受多种因素的影响,污染物去除效果还不够稳定,一个突出的现 象是好氧池异常地低,只有.左右,有时达到.以下,但去除效果尚可,好氧 池内微生物相的组成、性能、生理生化特性等尚属未知,有必要进行专门研究,找出 对浮选药剂具有优良降解作用的菌群,研究其降解废水中主要污染物的规律, 对于工 程实践具有重要的指导作用。三是废水中所含的药剂品种多而且浓度高。选矿厂浮选过程中,为了有效地将有 用金属分选出来,需要在不同的作业加入大量的浮选药剂,主要有捕收剂、起泡剂、 活化剂、抑制剂、分散剂等,构成选矿废水中的主要污染物。 ..选矿废水中污染物质的危害 选矿废水中大多数物质的毒性数据是很广泛的。选矿厂的药剂在毒性上变化很大, 一些药剂有很高的毒性,而另一些却相对无毒。同样地,尾矿中的一些物质不稳定, 容易分解成相对无毒的成分,而另一些却相对稳定。 一般而言,浮选捕收剂中的硫醇类、磺酸盐类和胺类捕收剂具有中等到剧毒的毒 性。在较大程度上,起泡剂的毒性为: 聚丙烯乙二醇几乎无毒,较短链的醇类具有轻 微的毒性,而甲酚酸类有较大的毒性,长链聚合物往往无毒。调整剂在毒性上变化很 大,一些物质如氰化物和一些重金属离子有剧毒。按目前的研究水平,从生态毒理学 上讲,黄药是最有危害的。黄药对人和温血动物的毒性问题,国内外文献中已有报道。 第一章绪论 急性中毒实验表明,黄药对中枢神经系统具有明显的抑制作用,动物可死于呼吸衰竭; 慢性毒性实验的病理改变,主要为肝脏和肾脏有不同程度的营养不良性改变【】。相对来 讲,黄药对鱼类有更为显著的毒性和对较大的生态系统有危害。当黄药浓度为/ 时,在三天内可杀死大部分鱼类,当有油存在时毒性能产生协同效应。黄药具有恶 臭,嗅觉值为./,即使选矿废水中残存量极少,亦使尾矿湖周围空气都有异臭 。研究发现【】,浮萍在浓度为/的异丙钠黄药中接触三天能造成%的致死 性,水蛭浸泡在黄药中小时后取出,经过天时间,水蛭能生长出多于个头, 在浓度为‖的戊基钾黄药剂可导致红鳟死亡。 另外,废水中含有大量的重金属,由于重金属的毒性和其不可降解性,排入水体 后危害更大【列。不仅能使水体的值发生变化,而且废水中的重金属离子经过沉淀、 络合、螯合及氧化还原等作用影响水生动植物的生长,破坏生态环境,且因用受矿山 废水污染的水体灌溉,金属离子一部分流失,一部分被植物吸收,大部分将在土壤中 沉积,当土壤中金属离子富集达到一定浓度时,将使农作物发生病害,影响农 作物生 长【。最为严重的是通过食物链,最终将对环境和人体造成极大的危害。例如日本水 俣市年代初开始发生的水俣病事件是由于工厂排放出的汞经食物链而使食鱼的居民 所患的一种神经系统疾病。日本年代的骨痛病是因为日本神通川上游采矿过程排出 的氟所造成的全身骨痛病【。另外如六价铬对皮肤有刺激和过敏作用、易损坏呼吸系 统和内脏、其化合物有致癌作用;铅及其化合物对人体很多系统都有毒性作用、易引 起高血压和肾炎等疾病;镍进入人体后主要存在于脊髓、脑、五脏和肺中,易导致皮 疹、红斑丘疹或毛囊皮疹等疾病。因此,环境保护人员把重金属危害作为最重要的环 境污染之一。 .选矿废水处理工艺 选矿厂的用水量和废水量都很大,选矿废水的治理方法很多,通常采用自然澄清 法、混凝沉淀法、药剂中和法、冲气曝气法、生化氧化法等技术,对选矿废水进行达 标排放处理。 目前,选矿废水处理方法主要有: 絮凝法【】 絮凝法是通过絮凝作用而去除污染物。絮凝过程主要发生的作用有凝结作用、架 广东工业大学硕士学位论文 桥作用和沉降作用。 蒋克旭【针对钼选矿厂选矿废水的特点,采用石灰作絮凝剂,污水和石灰经过泵 混合后通过管道输送到尾矿库沉降,澄清水回用于选厂。王方东‘刀等利用两级串联旋 流絮凝沉淀的方法处理选矿废水,废水达标率为%,净化效率为.%,其他水 质指标均低于国家污水综合排放标准,并且可获得.万元/年的经济效益。刘翠霞 四等利用聚合硫酸铁混凝沉淀的办法将浮选尾矿水、生活污水混合排放量近万吨/天的 废水进行处理,达到了满意的效果。 氧化法【珈】 氧化法是通过强氧化性物质使黄药、黑药、乙硫氮等有机浮选药剂氧化,从而达 到去除污染物的作用。因此,氧化法对有机污染物去除率高。目前,处理选矿废水常 用的氧化剂有次氯酸钠、漂白粉、双氧水。氧化法具有处理效果好、工艺简 单、设备 投资少、沉淀少等优点,但处理成本高,一般絮凝处理后采用氧化法进行深度处理。 顾泽平,孙水裕等【】采用次氯酸钠法处理铅锌硫化矿选矿废水,在废水, 加入量为,反应时间为的条件下,选矿废水的去除率可达到 .%;当,反应时间为,加入量为/时,选矿废水的去 除率为.%。杜军‘针对某选矿废水经尾矿库自净处理,。其锑、丁黄药和二号油等 有害成分含量均达不到排放要求,而再经硫酸亚铁混凝沉降,漂白粉氧化分解处理后, 去除率分别可达.%、.%、.%,废水中残余活性氯小于/,有害成份均 达到了排放要求。 离子浮选法埘】 它是利用表面活性物质捕收剂在气一液界面上所产生的吸附作用,使溶液中的 离子与表面活性物质形成可深性络合物或不溶性沉淀物,附着于气泡上上浮而进行浮 选分离的【。据报道,在日本等国已成功地将它应用于选矿厂废水处理和重金属回收 利用【。国内葛永德四用丁基黄原酸钠为浮选剂,硫化钠为沉淀剂采用硫化沉淀浮选 的方法处理电解钻镍废水,可以使出水水质达到国家排放标准。王均扬利用 沉淀浮 选法处理铅锌矿浮选废水,将废水中的重金属转化成氢氧化物或硫化物沉淀,然后用 浮选沉淀物的方法回收有价金属,该法具有设备简单、处理效率高、适应性广、占地 少、产生泥渣少等优点。 活性炭吸附法【】 活性炭具有形状不同、大小不一的孔隙,一般孔径为微孔,孔径为 第一章绪论 为中孔,孔径为大孔。由于这些孔隙,特别微孔提供了巨大的表 面积。活性炭吸附主要是这些表面积物理吸附作用的结果。活性炭处理效果好,但处 理成本较高,一般用于后续处理,尽量使其反复多用,以降低处理成本。 生物处理法【】 在微生物新陈代谢过程中,废水中微生物分解有机物维持生命,从而去除有机污 染物,这种方法叫微生物处理法,也叫生物处理法。生物处理法具有效果好、成本低 以及无二次污染等优点。但由于微生物处理法仅能处理满足一定条件的废水,生物处 理法应用具有局限性。 日本的旧松尾矿山、栅原矿山和小坂冶炼厂已建成利用氧化亚铁硫杆菌法处 理废 水的工程,并取得很好成效‘。 .等从废弃酸性矿废水中分离出了能在条件下促进二价 铁氧化的中度嗜酸菌,并发现其数量远多于极端嗜酸菌。实验表明其废水中的主要优 势异养微生物为酸杆菌、痤疮丙酸杆菌,证明中度嗜酸铁氧化菌在酸性矿废水中发挥 着重要作用。 】等在分离湿地中酸性重金属废水的微生物时发现,在未处理的研究酸性 废水中首先是中性嗜酸铁氧化菌作为主要菌种,随后异氧嗜酸菌成为优势菌种。在好 氧废水中异养嗜酸菌作为优势菌群,而厌氧废水中则是中性铁硫氧化嗜酸菌作为优势 菌种,这些嗜酸菌占了微生物总量的%一%。 .研究微生物群落结构的分子生物学技术 世纪年代以前,传统的微生物群落多样性和结构分析大多是将微生物进行分 离培养,然后通过一般的生物化学性状或者特定的表现性来分析,局限于从固体培养 基上分离微生物。培养基的成分影响微生物的生长状况,因此培养基的选择可强烈影 响所得菌群的多样性【。据估计,传统培养方法能够培养的细菌数量只占活性污泥微 生物总数的%%,只能反映极少数微生物的信息。同时,采用传统的分离培养 方法所测得的结果误差较大,丢失了大量有价值的微生物资源,因此这种传统研究方 法只能作为一种辅助手段。 在和年代,现代分子生物技术以为目标物,通过基因测序技术 和基因指纹图谱等方法,比较精确地揭示了微生物种类和遗传的多样性,并给出了关广东工业大学硕士学位论文 于群落结构的直观信息。分子生态学研究方法可克服传统微生物学分离培养方法的不 足,从分子水平反映该环境中微生物的种类组成和结构。因此,近年来分子生态学研 究方法正在被越来越多的微生物学工作者所采用。主要研究方法包括: 核酸探针杂交 技术 ; ;克隆技术 印迹技术 ;序列同源性分析技术,等。 梯度凝胶电泳技术 尤其是以基于 的细菌分子分类学的发展,技术、电泳技术、克隆文库 技术、荧光原位杂交 ,和流式细胞技术 ,等分子生物学技术逐渐成为研究菌群的主要手段。 .. 变性梯度凝胶电泳,的基本原理 变性梯度凝胶电泳 是根据的热变性行为来分离片段。双链片段在含有浓度梯度递增的 变性剂如尿素或甲醛的聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳,在某一变性剂浓度下, 的一个区域“结构域发生变性,则含有部分单链的片段的迁移速率明显下降。由 ? ? 于不同片段在变性剂浓度梯度的不同部位发生变性,因此个同样大小的片段可以彼 此分开,如果变性剂的浓度梯度平缓,这一技术的灵敏度足以将相差一个碱基对的 片段分开。 .技术的一大优点是能快速同时对比分析大量的样品,因此它既可以对 比分析不同的微生物群落之间的差异,也可以研究同一个微生物群落随时间和外部环 境压力的变化过程。另一个优势在于,可以对胶中所感兴趣的条带进行进一步的研究, 得到它们的序列,从而可以直接获得和系统生态功能相关的微生物种群的系统进化信 息。同时也存在一些缺陷,在分析微生物群落结构组成时,存在偏差;一般只 能分析个碱基对以下的片段,因此得到的系统进化相关的信息相对较少。所 研究的环境样品,微生物种类很多,但图谱中一般只有一二十个条带,这些条 带反映的是群落中的优势菌群,而那些数量少可能具有重要功能的关键微生物则被忽 略了。 最初是等人于世纪年代初期发明的,起初主要用来检测 片段中的点突变‘.】。等人在年首次将其应用于微生物群落结构研究‘, 第一章绪论 证明了这类电泳技术是揭示自然环境中微生物群体遗传多样性的有效手段,可用于特 定环境中微生物群落结构。.技术在微生物生态学中的一个主要用途是分析 微生物群落结构组成。此后,该技术被广泛应用于各微生物生态系统,包括土壤【引、 活性污泥【舯】、生物膜‘、底泥四等,目前已经发展成为研究微生物群落结构的主要 分子生物学方法之一。 高风玲【】采用方法分析了广东云浮硫铁矿酸性矿坑水样品中细菌的分布情 况,并用?技术检测了酸性矿坑水样品在不同能源黄铜精矿和镍铜铁矿培 养过程中体系微生物群落的变化。研究表明:在广东云浮硫铁矿酸性矿坑水样品中共 检测到个,根据系统发育树可分为大类即硝化螺菌纲,.变形菌纲,.变 形菌纲和丫.变形菌纲。其中占大多数的是丫一变形菌纲硫杆菌属和.变形菌 纲披毛菌属 的细菌,硝化螺菌纲端螺旋菌属的细菌少量存在。 刘新春等【删应用.方法,对不同温度下接种的套活性污泥系统中的微 生物群落结构的动态变化进行了追踪,研究结果表明,由于丁艺和操作条件相同, 系统的微生物群落结构的相似性随着运行时间的增加而增加。 掣】利用.技术分析了含硫化氢废水活性污泥处理系统的微生物 结构与动力学变化。 .. .限制性片段长度多态性 限制性片段长度多态性法采用限制性内切酶识别双链分子中特异 的短列,在特定的位点将切开,来自不同个体基因组的含同源序列的酶切片段具 有不同的长度。通过常规的电泳分离,不同长度的片段停留在不同的位置,即形成了 限制性片段长度多态性指纹图谱【拍】。 戴志敏,尹华群等人【】对中国云南东川黄铜矿废水中微生物群落结构进行研究,‘ 扩增及其序列分析,在三个样地中,共挑 利用限制性片段长度多态性和 选了个克隆子,经限制性酶切分析后聚为个可操作分类单元。一个 代表各个样地中出现的同一种酶切图谱。有个被测序分析,结果在基因 数据库中比对分析,其系统发育表明它们聚类为六大类: 丫.变形菌,酸杆菌纲,梭菌 纲,放线菌纲,硝化螺菌纲,.变形茵。其中,.变形菌为最大的种群,在三个样地 ,. .中分别占%,%,%的比例。广东工业大学硕士学位论文 肖升木【用的方法研究了六个酸性矿水样品中的细菌和古菌的分布情 况。在六个酸性矿水样品中共检测到种细菌。通过对细菌基因序列的系 统发育树分析,这种细菌可以分为大类:即硝化螺菌纲,厚壁菌纲,放线菌纲, .变形菌纲,一变形菌纲和一变形菌纲。同时发现在四个生物浸出液样品中,硝化螺菌 纲端螺旋菌属.厚壁菌纲硫化杆菌属和.变形菌纲嗜酸硫杆菌属的细菌为主要存在的 细菌;?在两个酸性矿坑水样品中丫.变形菌纲嗜酸硫杆菌属和.变形菌纲纲的细菌占大 多数。 .. 末端限制性片段长度多样性 末端限制性片段长度多样性首先由等【】于年用于微生物多态 性研究中,现已经成功应用于各种微生物群落的分析比较、研究微生物群落多样性及 结构特征等多方面。其技术原理是以样品的总为模板进行扩增,并在一个 引物的’末端用荧光物质标记,常用荧光物质有,,等。经扩增 产物用限制性内切酶进行切割并电泳,因为不同长度的末端限制性片段代表 不同的细 菌,通过检测这些末端标记的片段就可以反应微生物群落组成情况。 谭贵良采用 分子方法对广东云浮硫铁矿极端酸性矿山废水 .?.中微生物群落组成、结构及多样性进行了系统研究。末端限制性片段长 度多态性分析表明,取自不同季节和空间的七个样品在大小和数量上存在明 显 差异。 .,.,.”】采用末端限制性片段长度多态性和 基因库分析法国的尾矿富含铁到/砷到 / 硫酸盐到 /的酸性废水.到.中微生物的多样性。结果表 明,该序列披毛菌属麻鸭,嗜中性的氧化铁细菌占大多数。 .. 荧光原位杂交荧光原位杂交 ,技术结合了分子生物学 的精确性和显微镜的可视性,可进行微生物的空间分布分析和特征性微生物 的鉴定与 定量分析。等‘于年首次介绍应用荧光标记探针检测单个微生物,此后这 项技术被广泛应用于微生物生态学研究中。第一章绪论 技术的原理是双链变性后和带有互补序列的同源单链退火配对形成双 链结构,退火复性形成的可以是双链或/异质双链分子,带有荧光标记 的探针与固定在玻片或纤维膜上的组织或细胞中特定的核苷酸序列进行杂 交,探测其 中所有的同源核酸序列,结果可直接在共聚焦激光扫描显微镜或荧光显微镜下观察, 无需单独分离或。 谢学辉‘研究了个酸性矿水样品中微生物群落组成情况,实验过程中主要采用 了不依赖于培养技术的可用于环境样品的 克隆文库方法一限制性酶切片段 长度多态性分析方法,传统的分离纯化方法,扫描电镜观察方法以及荧光 原位杂交方法等等。系统发育分析结果显示个酸性矿水样品中的细菌主要是 大类:变形菌纲丫.变形菌,.变形菌,.变形菌,.变形菌,硝化螺菌纲端螺旋菌, 厚壁菌纲和拟杆菌纲。 ., .矧采用 和.微管蛋白基因的系统发育和 荧光基因特异性探针来描述在加利福尼亚州里士满铁矿山废水溶液中的真核多 样性和分布,该废水为酸性.到.,温度至度,富含金属/, 锌. 和微管蛋白基因序列组成的 /,砷. /,铜. /。真菌 两个不同的系统发育与座囊菌纲和散囊菌纲相关,获得了与座囊菌纲密切相关的三个 真菌菌株。 .. 基因芯片 基因芯片技术于年首次在杂志上被提出【。该技术是 将成百上千的被可探测物质标记的基因探针按规律固定在某种载体上,然后将样品与 之杂交,再根据杂交信号的强度和分布情况分析样品中的基因组成,最后分析样品中 的微生物群落结构,可以在很短的时间内检测大量的样品。‘等【】介绍了基因芯 片技术在微生物生态学中的应用。 陈棋炯【】利用基因芯片技术对微生物群落的多样性进行了研究。构建并评估了适 用于微生物群落结构解析的群落基因组芯片,优化了芯片杂交检测的技术方法,探索 了它们在环境微生物群落分析上的应用。 广东工业大学硕士学位论文 .本课题主要研究内容、思路和创新之处 ..主要研究内容及思路 本课题的研究主要包括三个方面的内容:一是厌氧.好氧反应器处理选矿废水的挂 膜研究;二是反应器处理选矿废水的试验研究;三是使用分子生物学技术对选矿 废水中微生物群落结构进行分析。 本课题以模拟选矿废水进行研究,采用厌氧.好氧反应器和序批式生物反应器 两种工艺处理选矿废水,通过对两个反应器中活性污泥的培养驯化,分析在 驯化过程对和浮选药剂浓度的去除效果及反应器运行期间废水中活性污泥生物 相的演化情况,最终驯化出能够有效降解浮选药剂的微生物。另外,结合 分子生物学手段对反应器处理效果稳定后的微生物群落结构进行分析。 ..创新之处 从所查阅文献来看,到目前为止,国内外采用生物法处理选矿废水的研究很少, 在工程上尚未见到。另外,对选矿废水生化处理系统中的微生物菌群结构的研究在国 内外没有报道。本课题可以拓宽废水净化技术路线,并为选矿废水生物净化措施及废 水中优势菌群生理生化特性研究提供理论基础支持。 第二章试验材料与方法 第二章试验材料与方法 .试验装置与工艺流程 ..厌氧一好氧反应器装置 储水箱 图反应器装置示意图 ?. 厌氧.好氧反应器的试验装置及工艺流程如图.所示。所有反应器用有机玻璃加 × 工而成,其中,配水箱的尺寸为 ,有效容积为:好氧反应器 和厌氧反应器形状和尺寸均一样,均为圆柱体,直径,高,有效容积为, 。 内置两根悬挂式的组合填料;储水箱的尺寸为 反应器的工作过程如下:所模拟的选矿废水由配水箱通过蠕动泵控制好流量进入 厌氧反应器的底部,由厌氧反应器上部出水进入好氧反应器底部,再由好氧反应器的 上部出水流入储水箱,最终出水通过回流泵回流到配水箱。填料上的生物膜在曝气头 提供氧气的条件下,以进水中的有机物作为营养物质,生物膜不断更新使污水得到净广东工业大学硕士学位论文 化。试验过程中,反应器的温度与环境温度保持一致,始终维持在.一,进水流 量为/,水力停留时间为。 .. 反应器装置 图反应器装置不恿图. 反应器的试验装置及工艺流程如图.所示。反应器用有机玻璃加工而成, 其尺寸为?,有效容积为。由一个曝气池组成,间歇式操作‘, 运行模式为周期式,每个周期由进水、反应、沉淀、出水和闲置个基本过程 组成。 反应器的工作过程如下: 反应器运行周期为每天个周期。每个周期,其中 进水,曝气,静置沉淀.,排水;每周期排水。当一个周期完成 之后重新向反应器中加入模拟的选矿废水,进行下一轮的试验。试验过程中,反应器 的温度与环境温度保持一致,始终维持在。 .试验用水与接种污泥 ..试验用水 厌氧.好氧反应器启动试验用水为在自来水中加入一定浓度的葡萄糖、氯化铵、磷 酸二氢钾,同时投加少量硫酸镁、氯化钙、硫酸亚铁等。待生物膜基本形成后则采用 人工模拟选矿废水,该废水与南京某铅锌硫化矿浮选废水的成分基本相符,主要污染 第二章试验材料与方法 物为苯胺黑药、乙硫氮和丁基黄药。 反应器试验用水采用人工模拟选矿废水,包括两部分,营养液葡萄糖、氯 化铵、磷酸二氢钾等和有机浮选药剂苯胺黑药、乙硫氮和丁基黄药。所模拟的选 矿废水与南京某铅锌硫化矿浮选废水的成分基本相符,主要污染物为苯胺黑药、乙硫 氮和丁基黄药。其中营养液成分为 /、. /、 . /、./、./和./。模拟 选矿废水水质为苯胺黑药 /、乙硫氮 /、丁基黄药. /和 、、? /。配水采用自来水。 ..接种污泥 接种污泥取自广州市某废水处理厂生物处理二沉池。污泥外观呈黄褐色,挥发性 悬浮物为./,悬浮物为./,/.,污泥含水率为 .%,污泥沉降比为%。 .填料的选择 填料是微生物栖息的场所,是工艺的核心。影响微生物膜在载体表面附着、生长 的因素很多,包括悬浮微生物浓度、液相、液相离子强度、悬浮微生物的活性、载 体表面结构与性质、水力剪切作用和接触时间等。 本课题在厌氧.好氧反应器处理选矿废水的试验中,反应器中所采用的填料为组合 填料:直径,间距。其材质特性见表.: 表.组合填料材质特性 垒垒:三:塑坠翌璺旦里巳垒曼垒垫坐堂皇巫盟里垒璺翌壁垒翌里 材质 比重 伸长率% 耐酸碱性 失重率 糍 . ... 合成纤维 无变化 《 .分析检测项目及测定方法 .. 浓度的测定 本试验采用快速密闭催化消解法测定‘浓度,所使用的仪器为?一?型消解 广东工业大学硕士学位论文 装置。 ... 消解、测试试剂配制 重铬酸钾标准溶液/./ 称取经度烘干小时的基准或优级纯重铬酸钾.,用少量水溶解,移入 容量瓶中,稀释至标线,摇匀。供标定硫酸亚铁铵标准溶液用。 试亚铁灵指示剂 称取.邻菲罗邻啉?和.硫酸亚铁?溶于水 中,稀释至,贮于棕色瓶内。 硫酸亚铁铵标准溶液 称取.分析纯硫酸亚铁铵溶于水中,边搅拌边缓慢加入浓硫酸,冷却后 移入容量瓶中,加水稀释至标线,摇匀。临用前,用重铬酸钾标准溶液标定。 另外称取.,.硫酸亚铁铵加入硫酸的量相同按上述方法分别配成 ./,./的硫酸亚铁铵溶液。 标定方法:准确吸取.标定:./的硫酸亚铁铵溶液时,取. 重铬酸钾标准溶液于锥形瓶中,加水稀释至左右,缓慢加入的浓硫 酸,混匀。冷却后,加入~滴试亚铁灵指示剂用硫酸亚铁铵溶液滴定,溶液的颜 色 由黄色经蓝绿色至红褐色即为终点。 嗍 ?. 一. 式中: ??硫酸亚铁铵标准溶液的浓度/ .一硫酸亚铁铵标准滴定溶液的用量 消化液: . 称取.重铬酸钾,.硫酸铝钾,.钼酸铵,溶解于水中,加入 浓硫酸,冷却后,转移至容量瓶中,用水稀释至标线。该溶液重铬酸钾 浓度为.// 。用于测定浓度在~/的水样含 /以上需稀释的水样。 消化液: 称取.重铬酸钾硫酸铝钾,钼酸铵,硫酸的用量同消化液按上述方法配 制,重铬酸钾浓度为./。用于测定浓度在~/的水样。 第二章试验材料与方法 消化液 称取.重铬酸钾硫酸铝钾,钼酸铵,硫酸的用量同消化液按上述方法配 制,重铬酸钾浓度为./。用于测定浓度在/以下的水样。 催化剂: 称取.硫酸银溶解于的浓硫酸中,摇匀。 掩蔽剂: 称取.硫酸汞溶解于%的硫酸中。氯离子含量不高的可适当减少硫 酸汞的用量。 % 取蒸馏水,缓慢加入浓硫酸,冷却后定溶至。 ...实验步骤 将装置电源打开并设定好、度,待进入平衡状态。 准确吸取均匀水样.每批水样在测试的同时需做二个空白置于消解 管中,准确加入.掩蔽剂不含氯离子的水样改加%硫酸.,.消 。 ‘ 化液,.催化剂,摇匀。 旋紧密封盖不含氯离子的小学校和不含低沸点有机物的水样测试时,可用 开管测试,方法一样依次将消解管插入已到达度的装置恒温体孔中,按“? 键启动闹钟,此时水样开始进行定时、定温催化消解工作。 当闹钟定时结束发出呜叫信号时,整个消解过程完毕。待冷却后,将消解管 按顺序从消解孔中取出,用滴定法测出值。 滴定: 将样液转移至锥形瓶中,用蒸馏水分三次冲洗消解管, 冲洗液并入锥形瓶中,加入滴试亚铁灵指示剂,用硫酸亚铁铵标准溶液回滴, 溶 液的颜色由黄色经蓝绿色至红褐色即为终点,记录硫酸亚铁铵标准溶液的用 量,计算 出值。 计算:/:???××?×一 ‖ 式中: 广空白消耗硫酸亚铁铵标准溶液用量 ??水样消耗硫酸亚铁铵标准溶液用量 ??水样体积广东工业大学硕士学位论文 ??硫酸亚铁铵标准溶液浓度/ ??氧/?摩尔质量/ ..苯胺黑药浓度的测定‘ ...苯胺黑药的紫外扫描谱图 精黼蜮 ’’, .嘞 .铷 .鼬 .咖 图.苯胺黑药的紫外吸收谱图 .苯胺黑药/的紫外扫描谱图如图?所示。苯胺黑药有二个吸收峰,分 别为和,选最大吸收峰作为测定苯胺黑药质量浓度的特征吸收波 长。 ...苯胺黑药的标准工作曲线 配制不同质量浓度的苯胺黑药溶液,测其吸光度,作苯胺黑药的质量浓度与 吸光 度的工作标准曲线见图。得到苯胺黑药浓度与吸光度之间的线性关系: .. 其中,??苯胺黑药浓度,/ 吸光度 该曲线的相关系数.,苯胺黑药浓度与吸光度的线性关系显著。 当溶液质量浓度较高/时,工作曲线弯曲,须将溶液稀释一定倍数后测 定。 第二章试验材料与方法 . . ? 是? . 苯胺黑药? 图 下苯胺黑药的紫外分光光度法标准曲线 ...乙硫氮浓度的测定 ...乙硫氮的紫外扫描谱图 ? . 乙硫氮/的紫外扫描谱图如图.所示。乙硫氮有二个吸收峰,分别为 和,选最大吸收峰作为测定乙硫氮质量浓度的特征吸收波长。 煺描蜮 ”穴声冬 . 图.乙硫氮的紫外吸收谱图.?广东工业大学硕士学位论文 ...乙硫氮的标准工作曲线 配制不同质量浓度的乙硫氮溶液,测其吸光度,作乙硫氮的质量浓度与吸光 度的 工作标准曲线见图。得到乙硫氮浓度与吸光度之间的线性关系: .一. 其中,??乙硫氮浓度,/ 吸光度 该曲线的相关系数.,乙硫氮浓度与吸光度的线性关系显著。 当溶液质量浓度较高/时,工作曲线弯曲,须将溶液稀释一定倍数后测 定。 . . 们. ? 《. . 乙硫氮? . 图 下乙硫氮的紫外分光光度法标准曲线 . ..丁基黄药浓度的测定石】 ...丁基黄药的紫外扫描谱图 丁基黄药的紫外扫描谱图如图所示。丁基黄药在?之间 有两个吸收峰。选最大吸收峰作为测定丁基黄药质量浓度的特征吸收波长。 第二章试验材料与方法 谴长“ 图.丁基黄药的紫外吸收谱图. ...丁基黄药的标准工作曲线 配制不同质量浓度的丁基黄药溶液,测其吸光度,作丁基黄药的质量浓度与 吸光 度的工作标准曲线见图.。得到丁基黄药浓度与吸光度之间的线性关系: ..‘ ‘ 其中,??丁基黄药浓度,/ ??吸光度 该曲线的相关系数.,丁基黄药浓度与吸光度的线性关系显著。 当溶液质量浓度较高/时,工作曲线弯曲,须将溶液稀释一定倍数后测定。 . . ? 薯. . 黄药? 图. 下丁基黄药紫外吸收分光光度法的标准工作曲线咖 广东工业大学硕士学位论文 ..生物相观察 活性污泥和生物膜是生物法处理废水的主体,污泥中微生物的生长、繁殖、代谢 活动以及微生物之间的演替情况往往直接反映了处理状况。因此,除了利用物理、化 学的手段来测定活性污泥的性质,还可借助于显微镜观察微生物的状况来判断废水处 理的运行状况。本试验中通过对活性污泥和生物膜中的生物相进行观察以此来判断填 料的挂膜和污水水质情况。 用灭菌镊子从厌氧一好氧反应器中的填料上刮取少量新鲜生物膜,从反应器底 部的排泥口排出少量活性污泥于烧杯,用蒸馏水稀释一定倍数制成菌液,用 胶头滴管 取滴菌液,放在干燥、洁净的载玻片上,盖上盖玻片,在显微镜下观察【】,并拍照。第三章厌氧.好氧反应器的挂膜研究 第三章厌氧一好氧反应器的挂膜研究 .反应器的启动 本试验好氧反应器采用接种挂膜法【.,接种污泥量为反应器有效容积的%, 接种污泥和废水混合后加入好氧反应器内;而厌氧反应器采用好氧预挂膜启动法】。 废水约为/,同时补充尿素、磷酸二氢钾,使进水的.: 质量比,闷曝。在天前只加入葡萄糖、氯化铵、磷酸二氢钾、微量元素各种 成分的具体浓度见表?,从第天开始加入苯胺黑药、乙硫氮和丁基黄药,药剂浓 度逐渐增加,直到接近南京某铅锌硫化矿浮选废水的浓度,葡萄糖、氯化铵、磷酸二 氢钾等营养液逐渐减少,使废水浓度保持在~/左右。继续驯化, 驯化运行稳定期各种成分的具体浓度见表.。 表 反应器启动时的营养配比 成分 . . . . . 含量 表驯化运行稳定期的营养配比 .. /成分 丁基黄药 乙硫氮 苯胺黑药 . 含量 .污染物的去除效果 .. 的去除效果 反应器启动过程中进水、出水浓度及去除率随时间的变化关系分别见 图.、图.。 广东工业大学硕士学位论文 一进水厌氧反应器出水一好氧反应器出水 一挂膜期间 驯化期间 ,、 . ??’??吨 ? .??.??? ’ 一 ’ ?’? ? 一.?尸?、/ 、、广???吖。、’? 一 一詹~ 磐 广、?、人~ 厶 口 、/ 一~目。 /\目日目日 会图 . 总去除富 一挂膜期间 ,.、 装 \一/ 槲 ’ 篮 代 一格 。曩 。。 \/~彳~卅。 天数 网.,’盆后内晏垦对的毒险塞 .由图.可知,启动期间进水为/,平均为/;厌氧反应 器出水最大达到/,最小值为 /,平均为/;好氧反应器出 水最大达到/,最小值为 /,平均为 /。在挂膜初期, 主要来源于葡萄糖、氯化铵、磷酸二氢钾等营养物质,反应器出水的比较平 缓, 天开始进入驯化期,好氧反应器出水的有上升的趋势。其原因可能是由于选 矿药剂毒性大,适应营养液的微生物在短时间内对选矿药剂的吸收能力较差,导致出水第三章厌氧.妤氧反应器的挂膜研究 升高,随着反应器的运行,微生物适应选矿废水的能力增强,生物膜生长较快,去 除效果较好。系统启动后,厌氧反应器对的去除效果趋于稳定,其出水 稳定在/:好氧反应器对的去除效果也趋于稳定,其出水稳定在 /。 由图.可知,好氧反应器对的去除贡献最大。虽然驯化前期微生物在短时 间内吸收选矿药剂的能力差,去除率有下降趋势,但是随着驯化时间的增加,去 除效果好,启动后的第天,对的去除率最终稳定在%左右。厌氧反应器对 的去除效果不明显,平均去除率仅为%,其原因可能是由于填料表面附着的生 物膜在毒性较大的选矿废水中很难富集,容易脱落,其吸附性能和降解性能均较差, 在水流流动作用下会被冲刷出反应器,造成厌氧反应器出水水质恶化。随着驯化时间 的增加,微生物对废水的适应性增强,去除率缓慢增长,最终达到相对稳定。 从总体上看,系统对的去除主要集中在好氧反应器,厌氧反应器虽也有一定 的去除效果,但去除率远远低于好氧反应器。其作用可将大分子的有机物降解为小分 子有机物,小分子有机物经过好氧反应器能有效被去除掉,出水水质较好。 ..三种药剂的降解效果 试验期间反应器进水、出水中苯胺黑药、乙硫氮和丁基黄药的降解情况分别 见图 .、图.、图.。 进水?卜厌氧反应器出水好氧反应器出水 ?? 詈 越 饕 嬖 将 天数 图.进、出水苯胺黑药浓度的变化 .? 广东工业大学硕士学位论文 进水斗厌氧反应器出水好氧反应器出水 一? 邑 冀 腻 蟋 天数 图进、出水乙硫氮浓度的变化 % .进水?卜厌氧反应器出水好氧反应器出水 一.面邑越《糯槭榭卜 天数 图.迸、出水丁基黄药浓度的变化. 由图.、图、图.可知,试验期间苯胺黑药浓度范围为/~ /,乙硫氮为. /~/,丁基黄药为. / ./。虽然选矿药剂较难降解,但在本试验条件下,由于葡萄糖 等易降解有机物的存在,促进了苯胺黑药、乙硫氮和丁基黄药降解,推测产生了共代 谢作用。反应器启动后,苯胺黑药的降解率从刚启动时的.%逐渐上升到%, 出水浓度为/,降解效果趋于稳定;乙硫氮的降解率逐渐上升到%,出水浓度 为./;丁基黄药的降解率从%逐渐上升到%,出水浓度约为/。这说明 适应此三种药剂的微生物己驯化成功。第三章厌氧?好氧反应器的挂膜研究 .生物相观察 生物膜是生物膜法处理工艺的主体,生物膜的形态、结构组成及膜上微生物的生 长、繁殖、代谢活动以及微生物之间的演替情况往往直接反映了系统的处理状况。因 此,在工艺运行过程中,还可借助显微镜观察生物膜及膜上的微生物的生长状况来判 断废水处理工艺的运行情况,以便及早发现异常状况,及时采取适当对策,保 证稳定 运行,提高废水处理效果。 由图和图.可知,填料上很少物膜生长,仅有少量丝状菌开始繁 殖。运行初期前,反应器的废水处理能力较低,生物膜呈淡黄色,结构松散。从图 和图.可见,随挂膜过程的进行,好氧反应器中填料表面的微生物相 发生了较大变化,生物膜厚度增大。填料内表面的淡黄色生物膜变为灰褐色,镜检发 现,出现暗红色的藻类、游仆虫、侠盗虫和线虫、轮虫、钟虫等后生动物。从图 可知,挂膜后期,填料上挂满了大量生物膜。图.可知,反应器运行至 时,生物膜由大量丝状菌组成。镜检发现盖果虫、吸管虫、半眉虫,这些生物的出现 标志着反应器的稳定运行。原生动物和细菌之间存在相互依存的关系。有资料显示【】, 活性污泥系统中的原生动物有纤毛虫种,鞭毛虫约种,肉足虫约种,但由 于选矿废水中含有苯胺黑药、乙硫氮和丁基黄药等有毒物质,从而导致生物膜上的微 生物多样性减少,致使处理效果变差,出水水质下降。通过对生物膜的观察和生物膜 上的功能微生物的计数结果分析,可了解反应器的运行状况,从而及时控制、调整其 运行条件。 挂膜前期