免疫捕获PCR快速检测阳性血培养瓶中的金黄色葡萄球菌

免疫捕获PCR快速阳性血培养瓶中的金黄色葡萄球菌 免疫捕获PCR快速检测阳性血培养瓶中的 金黄色葡萄球菌 浙江l临床医学2007年7月第9卷第7期 ? 检测诊断? ? 991? 免疫捕获PER快速检测阳性血培养瓶中的金黄色葡萄球菌 周义正李向阳杨锦红 金黄色葡萄球菌(S.aLireus)是引发社区感染和院内感染 的重要致病菌,其所致感染常以急性,化脓性为特征.以其 引发菌血症而致的脓毒血症最为严重.作者采用免疫捕获 PCR法(ImmunocapturedPCR,iePCR)检测S.allreus,即应用抗 体包被微量PCR管免疫捕获阳性血培养瓶中的S.allreus,再 用PCR法快速检测ssa基因和mecA基因,以期建立一种快 速准确地检测阳性血培养瓶中S.allreus的方法. 1材料与方法 1.1材料本实验所用的标准菌株均购自卫生部临床检验 中心,其它非标准菌株是本实验室保存的临床菌株,均分离 自患者的血培养标本并得到Vitek一32全自动细菌鉴定仪的 鉴定.引物:(1)$sa基因:ssa—F:5'一TCGGTACAC— GATATI?II?AC一3',ssa—R:5'一ACTCTCGTAT— GACCAGCITC一3'[J].(2)mecA基因:mecA—F:5'一GCTA— GAGTAGCACI?GAATTAGGC一3'meeA—R:5'一 GATFGAAAGGATCTGTACGGT,3'. 1.2方法(1)抗体包被微量PCR管:人IgC以0.1mol/L的 NazC03缓冲液(pH=9.6)稀释至20ITll,取500加至0.6 ITll的PCR管中37?孵育3h,再放置4?过夜,然后倒掉包被 液,加入50oul10%/1~牛血清在37%孵育1h,最后以PBST洗 3次,包被好的PeR管置4?冰箱备用2J.(2)免疫捕获和 模板DNA制备:以无菌方式抽取阳性血培养瓶中的带血球 菌液置无菌试管以2,000r/5min离心,取50o上层菌液加 入包被有人IgC的PCR管中在37?孵育30min,然后倒掉菌 液以PBsT洗涤6次,每次2min,最后在吸水纸上扣干残液, 以上完成免疫捕获,接着在捕获完后的PCR管中加入10o 双蒸水并在PCR仪上以99.9?裂解lOmin,然后参照《精编 分子生物学实验指南》上的醋酸钠一异丙醇法3J沉淀DNA 并用70%乙醇洗涤,待自然干燥后加入10双蒸水即得到 PeR反应所用的模板DNA.(3)PeR扩增反应体系和参数: 反应体系包括10XBuffer5,2.5mmol/LdNTP4,Taq酶 1U,20pmol/L正反向引物各1,25mmol/LMgcl'3,模板 DNA1C,最后补ddlt20至50.ssa基因和meeA基因的 PeR扩增参数如下:先94?预变性5min,再按94?,30s一 53?,30s_一72?,lmin,共35个循环;最后72?,lOmin.目的 基因片段大小分别为180bp和210bp.(4)最低检测限检测: 先将在绵羊血琼脂平板上生长24h的S.allreus(菌株 ATCC43300)纯菌落用无菌蒸馏水调置成1MeFarland的菌液, 然后以无菌操作方式将调好的lml菌液加入血培养瓶中,再 以无菌操作方式将5ml正常人无菌血加入同一血培养瓶中, 最后将血培养瓶放入BacT/Alert全自动血培养仪直至阳性 作者单位:325027温州医学院附属第二医院检验科 报警,接着以无菌操作方式从阳性血培养瓶中抽取5ml置无 菌试管中2,000r/5min离心,再取上层菌液3ml作原始菌液 并以新血培养瓶中的无菌培养液10倍系列稀释观察iePCR ,重复试验3次,原始菌液 的最低检测限,每个稀释度做5管 和各稀释菌液均以琼脂倾注法作活菌记数.(5)特异性试 验:按照与最低检测限检测中相同的方法用1中1—20号 菌株制作模拟标本,分别用iePCR法检测ssa基因和meeA基 因以鉴定S.allrellS和NRSA,重复试验3次.(6)临床标本检 测:以本实验室2006年7至8月收到的血培养标本中的106 例阳性报警瓶为检测对象,分别采用传统方法和iePCR法进 行检测S.allreus和NRSA. 2结果 以菌株ATCC43300为试验菌株的最低检测限检测显 示,iePCR法检测阳性血培养瓶中S.allrellS的ssa基因和 meeA基因的检测限均在4.3XlO4efu/ml左右.iePCR法在 10例由S.allrellS模拟的阳性标本中检测到ssa基因,其中有 6例还检测到meeA基因;其它10例非S.allrellS模拟的阳性 标本中均未检测到ssa基因和meeA基因.传统方法在106 例阳性报警瓶中检测到9例S.allrellS,其中3例S.allrellS的 苯唑西林NIC?4~g,/ml;iePCR法检测到的S.aureus与传统 方法的结果相同,但在1例苯唑西林NIC仅为2/ITll的S. allrellS中也检测到meeA基因.若以传统方法为金标准, iePCR法检测阳性血培养瓶中S.allrellS的灵敏度和特异度均 达100%.此外,用传统方法检测阳性报警瓶中S.allrellS的 时间约为48—72h,而免疫捕获PCR法的检测时间仅为5h 左右. 3讨论 免疫捕获PeR法是一种快速检测病原菌的方法,其根 据特异性抗体与与病原菌菌体特异性结合的免疫学原理, 将特异性抗体包被于磁珠或PER管壁上,富集或捕获菌悬 液和标本中的病原菌,再进行PeR反应检测目的病原菌. iePCR的检测灵敏度取决于抗体的捕获效率和PCR扩 增效率等因素.抗体的亲和力及纯化程度直接影响包被后 的捕获效率,在本实验中由于采用IgC的Fab段能与S.al1. reus表面的SPA蛋白非特异结合的原理来捕获S.allrellS,故 其捕获效率不高,这直接导致本实验中iePCR的检测灵敏度 仅为lO4efu/ml,这远低于牛建军等4J运用iePCR检测E.eoli O157:H7的最低检测限10efu/ml,但由于在阳性血培养瓶中 的菌液浓度已达108efu/ml,因此灵敏度并不影响iePCR在 检测阳性血培养瓶中S.allrellS的应用.在本实验中对iePCR 检测S.al/l~lls的特异度的保证依靠两个因素:一是I捕获 S.allrellS,二是采用ssa基因来鉴定S.allrellS.ssa基因是Mar— 1采用大规模的基因比对在S.allrellS中发现的一种 tineau等… 特异基因,其较过去用来鉴定S.allreus的fem基因和nile基 ? 992? 因具有更高的种特异性和基因的保守性,因此更适合用来 鉴定S.aureus.另外,在本实验中还采用检测mecA基因来 判断MRSA,这是目前公认的检测MRSA的最可靠方法,它 能避免传统表型法筛查MRSA因S.atll-etls的异质性表达而 造成的漏检.但是,本组采用的icPCR也存在一些不足,首 先是灵敏度还有待提高,其次是不能检测临床Ft益增多的 凝固酶阴性葡萄球菌引起的菌血症,其实这两点都与包被 用的抗体有关,在接下来的研究中作者将致力于开发一种 针对葡萄球菌属共有菌体抗原的单克隆抗体. 参考文献 1MartlneauF,PicardFJ,RoyPH,cta1.Species—specificandubiquitous一 浙江临床医学2007年7月第9卷第7期 DNA—basedassaysforrapididentificationofStaphylococcusaureus.J ainMicrobiol,1998,36:618,623. 2黄留玉,PCR最新技术原理,方法及应用.北京:化学工业出版社, 2oo5.181,187. 3AusubelFM,KingstonRE,SeidmanJG,eta1.精编分子生物学实验指 南.马学军,舒跃龙,颜子颖,等编译.北京:科学出版社,2005.46 , 47. 4牛建军,黄健炜,李莉,等.免疫捕获PCR法快速检测大肠埃希 O157:H7的研究.中国人兽共患病杂志,2004,20(11):896,897, 5I.uoW,WangS,PengX.Identificationofshigatoxin—producingbacteria byanewimmuno—capturetoxingenePCR.FEMSMicmbiolLett,2OO2, 2】6:39,42. (上接990页) 持续时间长,不良反应少_3J.舒芬太尼的持续输注后半衰期 (context—sensitivehalftime)比阿芬太尼更短,其血浆浓度降 至产生自主呼吸和苏醒的时间一般只要30rain_】.4J.虽然舒 芬太尼与瑞芬太尼比较恢复时间长,后者停止输注10rain左 右可恢复自主呼吸,但瑞芬太尼血药浓度的快速下降,导致 术后镇痛作用短暂,常使苏醒期患者出现与疼痛有关的躁 动,并需给其它镇痛药,可能影响患者的意识和呼吸5J.作 者认为,在非短小手术,只要合理掌握舒芬太尼的用量和停 药时间,不会导致苏醒延迟.本文选择舒芬太尼作为丙泊 酚TCITIVA的配伍用药,达到了麻醉满意,恢复快而平稳的 效果. 当然丙泊酚也有抑制心肌和血管平滑肌的作用,Cleays 等认为异丙酚引起血压下降的主要原因是外周阻力的下 降,其程度与使用剂量和注射速度有关,通过调整注射速度 和剂量可以缓解6J.本文观察运用TCI技术和复合舒芬太 尼,能很好地控制交感一'肾上腺反应,减少用量,从而降低 对循环的抑制.在整个手术麻醉过程中,A组的血流动力学 能保持基本稳定的水平.尤其在麻醉复苏阶段,A组的血流 动力学平稳,苏醒和拔管时间均短于B组,而B组的SBP, DBP,HR明显升高,患者躁动,疼痛等不良反应比例比A组 高,提示异氟醚静吸复合麻醉虽然也能很好地完成手术麻 醉,但在血流动力学方面不如丙泊酚TCI复合舒芬太尼|I1一 VA稳定,并且前者的苏醒质量不如后者高. 参考文献 1庄心良,曾因明,陈伯銮,编.现代麻醉学.第3版,北京:人民卫生 出版社.2003.962—977. 2Roth—sigkeitA,BrechmannJ,DibbeltL,eta1.Persistentendocrineslress responseinpatientsundergoingcardiacsurgery.JEndocrinolInvest,1998, 21:12,19. 3SharerSL,VarvelJR.Pharmacokineties,pharmacodynamics,andrational0一 pj0idselection.Anesthesiology,1991,74:53,63. 4HughesMA,JacobsJR,GlassPSA.Context—sensitivehalf—timeinmulti— c0I珥皿n?lentpharmacokineticmodelsforintravenousanesthesia.Anesthesi— ology,1992,76:334,341. 5耿志宇,宋琳琳,许幸,等.异丙酚复合芬太尼或瑞芬太尼靶控麻 醉与静吸复合麻醉的比较.中华麻醉学杂志,2004,24:14,17. 6CleaysMA,GeptsE,C~qluF.Haemodynamicchangesduringanaesthesia inducedandmaintainedwithpropofo1.BrJAnaesth,1998,60:3,12. 《浙江临床医学》传播,交流先进的医学科学技术和实践 经验;中西医结合,面向临床,面向基层o 《浙江临床医学》是广大医务人员的良朋益友!