小儿病毒感染与微卫星DNA的关系

小儿病毒感染与微卫星DNA的关系 小儿病毒感染与微卫星DNA的关系 中国实验诊断学2O05年2月第9卷第1期 文章编号:100"/一4287(2005)01—0075—03 小儿病毒感染与微卫星'DNA的关系 孙利炜,刘愉,焦立新,郑丽芬,李栋,赵艳玲,李永富 (长春市儿童医院,吉林长春130061) 一 75一 方法取经咽拭子病毒分离证摘要:目的探讨/bJD病毒感染与微卫星DNA的关系. 实为呼吸道合胞病毒或腺 病毒感染的患儿血提取DNA,用聚合酶连反应对基因座D5S818进行扩增,聚丙烯 成象 酰胺凝胶电泳分离DNA片段, 系统分析D5S818基因片段长度多态性;并分析D5S818基因片段长度多态性与病毒感染临床表现的相关性.结果 发现病毒感染后D5S818基因座等位基因频率与正常对照组有明显差异,平均AGAT重复数,观察组较对照组略高, AGAT重复数<12和?12两组相比较,观察组明显高于对照组.病毒感染组D5S818基因杂合度明显低于对照组.结 论病毒感染可能使DNA微卫星发生改变. 关键词:4~JD;病毒感染;微卫星;DNA 中图分类号:RSll文献标识码:A TheRde~lceofChildrenV~SthVirusInfectionandDNAM'cr0teIliteSUNLi-u~ei,ldUYu,J IAOLi-xin,eta1.(Change.hun ChildrenHospitalJi1_in,c^a,硼130061,;) Absl:ObjectiveDiscusstherelevan~ofvirusinfectioninchildrenandDNAmicrosatellite.M ethodsDNAisextorted frompefiphe~bloodofchildreninfectedbyrespirato~syncyfialvirusoradenovirusbythroat swabvirusisolation.TheDNAisgil1. edwithD5S818byPCR,anwithphotographicsystemafterpolyacryhmidedelelectrophores isgdelectropho,~.Discuss D5S818genefragmentpolymorphismandtherelevanceofcIiIllCsituationofvirusinfection .ResultsItisfoundthatafterthe virusinfection,thereisasignificantdiffemncebetweentheinfectedgroupandthe~ntrolgrou pinD5S818genotypehequeney.The averagerepetitioncopynumberofAGATofobservegroupisalittlebitIligI埘 thanthatofthecontrol乎Dup,,AGATcopynumb~< 12and? 12ofo~rvegroupismuchhish~thanthatofthecontrolgroup.Theobservegroupheter~ygosit yissignificantlowerthan thataftheoonlr'astgroup.ConclusionVirusinfectionmaycl嘴 therepetitionnumberoftheDNAmicrosatellite. Keywords:children;virusinfection;microsatellite;DNA 病毒感染目前已远远超过了其他微生物的感 染,有40多型别的病毒可以感染人类.病毒感染可 对机体造成严重危害,有些可致畸致残,甚至危及生 命.在/],JD最常见的呼吸道感染中有90%以上为 病毒感染. 微卫星DNA(nficrosatelliteDNA)又称短串联重 复序列(shorttandemrepeat,sm)通常由2—6bp的 核心序列串联重复而成,广泛存在于人类基因编码 区与非编码区uJ.STR的功能目前尚不肯定,它们 定位和连接于几个重要的基因位置,不但是与人类 疾病相关的标记,而且直接与病因学相关.病毒感 染尤其是反复病毒感染,常使病毒基因整合于宿主 基因内,使宿主的正常生理功能或遗传性状发生改 变.微卫星作为重要的遗传标记系统被广泛应用于 疾病筛选.但STR与病毒感染的关系,目前国内外 未见报道.我们分析了79例病毒感染(呼吸道合胞 病毒59例,腺病毒20例)患儿D5S818基因片段长 度多态性,现报道如下. (Ch/nJ脚,2O06,9:75) 1对象与方法 1.1研究对象观察组79例鼻咽分泌物病毒分离 阳性的上呼吸道感染或肺炎患儿,其中男46例,女 33例,年龄5l2月龄,4l例,l236月龄l8例,> 36月龄20例,中位年龄20月龄.对照组为20例未 发生病毒性感染的健康新生儿.所有对象均为无关 联的汉族个体. 1.2毒株与试剂呼吸道合胞病毒(RSV),腺病毒 (Ad)由中国疾病预防与控制中心病毒所许文波教 授惠赠.TagDNA聚合酶购自华美生物公司. 1.3D5S818基因座与引物D5S818基因座位于人 染色体Sq2131,重复序列为AGAT,等位基因片段 大小为135—171bp,引物序列为5'.GGGTGA,I1'II 'I?Cr?TTGrr-3'和5'.TGATI?CAAI?ATAG CCACA一3'[21,由北京赛百盛公司合成. 1.4病毒分离无菌采取上呼吸道感染或肺炎患 儿鼻咽分泌物,接种于Hela细胞,培养3—7天中和 试验确定为病毒感染. 76—— 1.5PCR扩增反应体系为25,吉有10roa~l/L Trls-HC1,pH8.3,50nanol/LKCI,1.5mmol/LragCl~, 200~trnoltLdNTP~,.1pmn~ol引物,TaqDNA聚合酶2 1.1,模板DNA30ng.热循环参数:94~C30s,58?50 B,72?30s,28个循环. 1.6PCR产物检测和等位基因确定采用非变形 聚丙烯酰胺凝胶电泳进行,胶的浓度为8%,胶联度 5%.从每管25产物中吸取5产物用于等位基 因序列梯的制备,在2o产物中加人4上样缓冲 液,混匀上样,以100bp(序列)和~X174/Haell/作分 子量,恒压1130V电泳3小时.EB染色,紫外 灯下观察井拍照.自动成像系统观察并分析等位基 因数和片段大小. 1.7等位基因序列梯的制备取不同等位基因的 pCR产物各5充分混匀,同上进行电泳,可见不同 大小的扩增片段即等位基因的序列梯. 1.8短串联重复序列碱基数的计算按公式碱基 数等于扩增片段长度减去引物长度加5'和3'端侧 翼碱基数和的差与重复单位碱基数的商.D5S818 基因座重复单位碱基数为4.引物长度加5'和3'端 侧翼碱基数和为111. 1.9统计学处理记录每个样品的基因型,计算基 因频率,碱基数和杂合度,对基因分布和短串联重复 序列碱基数进行检验. 2结果 2.1病毒感染患儿微卫星?s818基因型79例 Rsv感染患儿共有13t13,12/15,12/13,10t14,9t13,I1/ 14,14/I6,13113,13/14,15/16,共l0种基因型,见图. 固1病毒醅染息儿微卫星I15S818基因型 注:1.8为诳度梯,2,3,445,6,9,10,11,12,13分别为13113,12/15, 12113,1讲】4,9113,11114,14116,13Jl3,13114,15116,7为阴性对Jlll 2.2病毒感染患儿微卫星D5S818等位基因文献 报道D5S818基因座常见等位基因为6,7,8,9,10, 1】,12,13,14,15.本研究观察组有9,10,11,12,13, t4,l5,I6共8个等位基因,对照组有8.9,10,11,12, l3,l4共7个等位基因,见表1. 表1Rsv酿染患儿s81s等位基臣顿率(例数1 =35.,(o.005. 2.3徽卫星1Y3S818基因座杂合度RSV感染组为 O.加.对照组为0.81. 2.4微卫星D5S818AGAT重复数微卫星 D5S818平均AGAT重复数观察组与对照组比较略 高,微卫星短串联重复序列碱基数的中位值观察组 为l3,对照组为l2. 2.5微卫星I)5S818重复序列碱基数与呼吸道合胞 病毒感染临床表现的关系观察了59例呼吸道合 胞病毒感染患儿的临床表现,发现临床表现重,病程 长患儿微卫星D5S818重复序列碱基数相对多. 3讨论 一 般认为,微卫星的成因是由复制滑脱(zepliea. tionslippage)或DNA滑动链与互补链碱基错配导致 一 个或几个重复单位插人或缺失产生J. 病毒作为一种严格的细胞内寄生物,其复制过 程必须依赖于宿主细胞的能量代谢机制和生物合成 途径.病毒与宿主相互作用是病毒感染致病以及免 疫的生物学基础,病毒感染宿主后通过多种信号传 导途径可引起病毒与宿主细胞基因表达的变化,病 毒基因组单克隆或多克隆位点整合于机体细胞基因 组,由此细胞基因组发生改变,引起一系列变化. 本文对呼吸道合胞病毒和腺病毒感染患儿STR 改变进行研究,发现病毒感染后D5s818基因座等位 基因频率与正常对照组有明显差异.微卫星 D5S8l8平均AGAT重复数观察组与对照组比较略 高,AGAT重复数(12和?l2两组相比较,观察组明 显高于对照组.病毒感染组STR杂合度明显低于 对照组.亦发现79例呼吸道台胞病毒燎染患儿中, 2O05年2月第9卷第1 临床表现重,病程长者,其微卫星D5S818重复序列 碱基数相对多.这可能是病毒感染后,发生了基因 突变或某个碱基丢失,使短串联重复序列发生了改 变. 目前,国内外有关微卫星的研究多为肿瘤和遗 传病.微卫星序列的改变加之其他因素的作用,可 能使发生肿瘤的危险性增加并且研究发现基因的杂 .有研究认为慢 合度降低在肿瘤患者中比例较高[3】 性炎症可造成DNA和DNA复制模板损伤,使DNA 的复制发生错误,导致微卫星发生突变,这类突变的 发生因为是重复序列数量的增多或减少,结果产生 不同长度的DNA[4].病毒感染与微卫星短串联重 复序列的关系及其临床意义,还应进一步扩大样本 数目及做更深入的研究. 一 77一 作者简介:孙利伟,女,45岁,学士学位,主任医师,科主任. 主要从事小儿内科. 参考文献: [1]EdardsA,CiviteUoA,HammondHA,et81.DNAtypingandgenetic mappingtIltrimerleandtetmmefietsndel/lIepe出[J].AmhumGenet, 199l.49(4):746. [2]侯一平,吴谨,李英碧,等.中国汉族群体五个SIR基因座遗传 多态性研究[J].中华医学遗传学杂志,1999,16(4):228. [3]李昱.微卫星DNA不稳定性及其在星形细胞肿瘤中的意义 [J].国外医学?生理,病理科学与临床分册,2001,21(5):341. [4]Um~r.A,Kunke1.T.A.DNA-replicatlonfidelity,mismatchr印airand genomeinstabilityinc?ee~[J].Bi~hemEurop,1996,238(2) 297. [5]BrentnallT,Miero~ttelliteinstab/lity一conceptsintumorigenesis [J].AmJPathol,1995;l47(3):561. (收稿日期:2004一O1—13) EDTA—K2抗凝剂导致血小板假性减少1例报道 窦心灵,何贵山,朱建敏,陈亚萍 (1.酒泉市人民医院检验科,甘肃酒泉735000;2.酒泉市中心血站) 由于乙二胺四乙酸二钾(EDTA.K2)具有对红, 白细胞形态影响极小,并可抑制血小板的聚集等优 点,国际血液学标准化委员会(ICSH)1993年建议, 将EDTA.K2作为血细胞计数的抗凝剂….但我们 在血常规检验中发现1例由EDTA.K2抗凝剂引起 血小板假性减少的典型病例,报道如下. 患者,女,38岁,以心悸原因待查住我院心肾内 科.入院查体:患者无明显出血倾向,全身皮肤未见 出血点,无鼻出血,牙龈出血,血尿及肝,肾疾病等. 实验室检查结果:WBC5.3×lL,,RBC3.78× lO也L,,Hb122gL,,PLT6×lL,,肝,肾功能及 凝血象基本正常.临床医生怀疑血小板计数结果的 准确性,复查.我们连续3天按要求抽取ED. rA.K2抗凝血在SysmexK-4500血液分析仪上进行血 小板计数,PLT结果分别为6×lL,,10×lL 和12×lL,;然后末梢采血在SysmexCISF-820血 球计数仪上复查PLT,结果分别为116×lL,,121 ×l()9L和128×l()9L一.改用109mmolL枸橼酸 钠与血液按1-4比例抗凝处理后,在SysmexK-4500 血液分析仪上进行血小板计数,结果为123×l L一.并分别用EDTA-K2抗凝血,枸橼酸钠抗凝血 和末梢血制作血片,瑞氏染色后油镜下观察发现, EIY~~一K2抗凝血片中有大量血小板聚集,而枸橼酸钠 抗凝血片的末梢血片中血小板散在分布,无聚集现 象.l5天后随访复查,分别采取EDTA.K2抗凝血,枸 橼酸钠抗凝血和末梢血进行血小板计数,PLT结果分 另U为17×lO9L一,157×lO9L一和152×lO9L一. 讨论由于EDTA.K2抗凝剂具有保持红细胞, 白细胞,血小板体积和形态不发生改变的优点,因此 ICSH推荐将其作为血细胞计数的抗凝剂,已在世界 各地广泛应用.但因其偶尔可诱导血小板发生聚 集,大量的血小板聚集在一起,超过了仪器设定的血 小板计数阈值范围,从而引起EDTA依赖性血小板 假性减少(EDTA.dependentpseudothrombocytopenia, PTCP).EDTA.K2诱导血小板聚集的原因可能与血 小板表面存在某种隐匿性抗原有关.由于EDTA.K2 可导致血小板活化,使血小板形态发生改变,导致血 小板膜表面某种隐匿性抗原表位构象的改变,这些 活化的血小板与存在于血浆中的自身抗体结合后, 激活了细胞膜中的某些能活化血小板纤维蛋白原受 体的活性物质,促使血小板与纤维蛋白原聚集成团. EDTA依赖性血小板假性减少多出现在实体瘤,髓 系或淋巴系增值性疾病,自身免疫性疾病,心脏疾 病,干燥综合征,脓毒血症,肝硬化以及一些不明原 因疾病的患者. (收稿日期:2004—07—19)