实验性脊髓缺血性损伤后神经元病变的神经丝免疫组织化学研究

实验性脊髓缺血性损伤后神经元病变的神经丝免疫组织化学研究 实验性脊髓缺血性损伤后神经元病变的 神经丝免疫组织化学研究 1 2李长有林国宏 : 观察实验性兔腰髓缺血 40和再灌流 4的脊髓运动神经元胞体和轴突的病理学改变。 目的 m in h 摘要 () 方法: 用免疫组织化学方法观察神经丝 , 抗体特异标记神经元胞体和轴突, 并对其结 neu ro f ilam en t sN F 果进行图像分析。结果: 缺血 40, 脊髓前角运动神经元胞体和轴突内神经丝反应异常增强, 胞体内神 m in 经丝分布紊乱聚集。再灌流 4, 脊髓前角运动神经元胞体和轴突内神经丝反应阳性, 胞体内神经丝散h 乱、稀疏、崩溃和溶解, 轴突肿胀、扩大、消失。图像分析了脊髓前角运动神经元胞体内神经丝的面积、灰度和脊髓前索内轴突的数量, 其结果具有明显的统计学意义。结论: 神经丝免疫组织化学方法能更清楚 地显示脊髓运动神经元胞体和轴突的病理学改变, 脊髓损伤后细胞骨架紊乱在神经元的病理发病机制 中起重要作用。 关键词 神经丝 免疫组织化学 脊髓 缺血 兔 The n eurof ilam en t imm un oh istochem ica l study of pa tho log ica l chan ge s of n euron s on exper im en ta l is- ƒƒƒ,chem ic sp ina l cord in juryL I Chan gyou L IN Guohon gCh in e se Journa l of Sp in e an d Sp ina l Cord () 1998, 8 6: 323, 325 : A bstrac t O bjec t iveT h e p a tho lo g ica l ch ange s o f ce ll bo d ie s and axo n s o f m o to rneu ro n s w e re inve st i2 404. : ga ted in rabb it s lum ba r sp ina l co rd af te r m in o f isch em ia and h o f rep e rfu sio nM e thodN eu ro f ilam en t () N F an t ibo dy w a s adop ted to labe l ce ll bo d ie s and axo n s sp ec if ica lly and w e re o b se rved w ith th e im 2 . . : m uno h isto ch em ica l m e tho dT h e re su lt s w e re ana ly sed by th e im age p a t te rn ana ly sisRe sultT h e exce s2 sive m isaccum u la t io n o f N F w a s o b se rved in th e ce ll bo d ie s and axo n s o f m o to rneu ro n s in th e ven t ra l 40ho rn af te r m in o f isch em ia and th e d ist r ibu t io n o f N F in th e ce ll bo d ie s w a s d istu rbed and accum u la2 . t iveT h e N F imm uno h isto ch em ica l reac t io n co u ld be show n in th e ce ll bo d ie s and axo n s o f m o to rneuo rn s 4, , af te r h o f rep e rfu sio nand th e d ist r ibu t io n o f N F in th e ce ll bo d ie s w a s d ive rgen tra re and d isin teg ra2 , . , t iveth e axo n s w e re sw o llen and van ishT h e a rea sg rey leve ls o f N F in th e ce ll bo d ie s and th e num be r s o f axo n s in th e an te r io r fun icu lu s w e re m ea su red and th e sta t ist ica l ana ly sis show ed sign if ican t d iffe r- . : enceCon c lus ionT h e p a tho lo g ica l ch ange s o f ce ll bo d ie s and axo n s o f m o to neu ro n s w e re dem o n st ra ted , c lea r ly by N F imm uno h isto ch em ica l reac t io nand th e d iso rde r o f cy tom a t r ix p layed an im po r tan t ro le in th e p a tho gene sis o f neu ro n ’s ce ll bo dy and axo n s. ’, 1, , A uthor s addre ss D ep a r tm en t o f O r thop aed ic Su rge ryst H o sp ita lC h ina M ed ica l U n ive r sity , , 110001Sh enyangL iao n ing Key words N eu ro f ilam en t Imm uno h isto ch em y Sp ina l co rd Isch em ia R abb it (免疫组织化学方法在实验性脊髓损伤评价方面的报道较少。 本实验应用神经丝 2 n eu ro f i ) 抗体对实验性脊髓缺血损伤进行 , lam en tN F 1 中国医科大学第一临床学院骨科 110001 沈阳市了评价。 2 中国医科大学病理教研室 收稿日期: 1997212230 1 材料与方法, 胞浆均匀, 深染,体呈网斑状均匀排列于核周 111 实验动物前索轴突分布均匀。 缺血 40组: 前角运动神经元肿胀, 圆 m in 健康雄性日本大耳白兔 23 只, 体重 211,形, 胞核偏位, 核仁尚清楚, 尼氏体呈细尘状颗 310, 平均 2158?0140。全部动物均在同一 k g k g粒, 浅染, 松散, 排列紊乱或位于细胞周边部。灰 实验室按相同饲养方法由专人饲养。 室内空气 质内可见大片出血。 前索轴突分布较散乱。 新鲜, 温度保持在 20?左右。 实验动物手术和 再灌流 4组: 前角运动神经元固缩、变小, h 〔1〕呈三角形。 胞核结构大多萎缩消失, 尼氏体溶 监测详见另文。 解、消失, 胞浆呈空泡状改变。 前索轴突分布明 112 免疫组织化学染色〔1〕()显紊乱, 数量明显减少详见另文。 缺血前、缺血 40、再灌流 4, 分别在活 m inh 体状态下, 取同一伤段脊髓行病理学检查。标本 212 神经丝免疫组织化学改变固定于 10% 中性福尔马林液中。 标本常规制 样, 、尼氏染色供一般病理学研究。神经丝免 免去第一抗体的标本都呈阴性反应。 H EN F 疫组织化学方法如下: 石蜡切片脱蜡和水化, 缺血前组: 前角运动神经元轮廓清楚, 多极 ( ) 0形13% 和甲醇 1 ?9室温下孵育 15,, 细胞核轮廓清晰可见。染色呈丝网状均 H 2O 2 m in N F ()以阻断内源性过氧化物酶的活性。3% 正常羊血 匀分布于胞浆中 图 1, 插, 。前索轴突分布均 ()清室温下孵育 10, 减少非特异性背景。应用匀, 轴突染色均匀一致图 2, 插, 。m in N F () 鼠抗人抗体 , 70+ 200室温缺血 40组: 前角运动神经元肿胀, 胞M ax im KD KD N F m in 下孵育 60进行抗原抗体特异结合。生物素m in 核轮廓尚清楚, 呈强阳性不均匀分布于胞 N F ( )() 质中标 记 的 羊 抗 鼠室 温 下 孵 育 , 神经丝排列紊乱聚集 图 3, 插, 。 前索 IgG M ax im ()轴突散乱分布, 染色强阳性 图 4, 插, 。 10。 加链霉素抗生物素蛋白2过氧化酶室温 N F m in 下孵育 10。 新鲜溶液显色, 显微镜下 再灌流 4组: 前角运动神经元固缩、变小,m inDBA h 观察 3, 5, 中性树胶封固。 每步之间均用大致呈三角形。胞核结构大多萎缩消失。染 m in N F ( 色阳性, 神经丝紊乱、稀疏、溶解、消失 图 5, 插 冲洗 3 次, 每次 3, 5。 阳性呈黄色, 阴PB S m in )。 前索轴突分布明显紊乱, 轴突肿胀、扩大、 , 性对照片用 代替第一抗体。PB S ()消失, 轴突内染色阳性 图 6, 插, 。 113 图像分析处理N F 应用日本2型图像分析系统, 在 20213 图像分析结果L u zex F 倍物镜下随机测定缺血前、缺血 40、再灌流缺血 40组脊髓前角运动细胞平均 m inm in N F ( 灰度 注: 灰度表示图像各部分颜色的深浅程 4各组脊髓前角 30 个有核细胞神经丝的平均 h ) 面积和平均灰度, 同时测定各切片脊髓前索内 度, 切片底色越浅, 灰度值越高。明显低于缺血 () 前组 < 0101, 再灌流 4组平均灰度低于缺 轴突数量。h P () 114 统计学处理 所有测定值以平均值?血前组 < 0105, 且与缺血 40组比较 P m in P < 0101。 结果见附表。差表示, 统计 学意义通过10 5缺血 40组脊髓前角运动细胞平均M ic ro so f t E x ce l fo r W in dow s m in N F )(105。 再 0电子软件中的 检查和 检查进行评价, 面积与缺血前组没有明显差异 > F t P 值< 0105 为具有显著性差异。灌流 4组平均面积较缺血前和缺血 40组 P h m in () 明显减少 P < 0101 缺血 40组脊髓前索轴突数量低于缺 2 结果m in () 211 组织病理学改变血前组 < 0105, 再灌流 4组轴突数量明显 P h 缺血前组: 前角运动神经元轮廓清楚, 多极 减少, 与缺血前组和缺血 40组比较 0105 P P P 3 讨论, 膜性结构受损, 进一步增加了过氧化水平增高2+ 从线粒体的释放及细胞外的内流, 从而激C a脊髓损伤的基础研究方法很多, 但免疫组 () 活了由钙激活的中性蛋白酶 。CA N P CA N P织化学方法应用于实验性脊髓损伤的研究很 在神经丝蛋白的代谢中起重要作用, 可将髓鞘 少。 本实验采用单克隆抗体特异地显示神 N F 蛋白分解成小泡状结构, 并可将 分解成小N F 经元胞体和轴突的细胞骨架结构。 结果显示缺 片断, 导致 降解, 细胞骨架解体, 形成轴突N F 血 40, 神经元胞质中呈强阳性反应, 神 m in N F 〔5、6〕空泡样变性和溃变。实验

证明

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, 神经 W a lle r 经丝紊乱聚集, 轴突也呈强阳性, 分布不均 N F 生长因子可降低质膜脂质过氧化水平而稳定细 匀,

说明

关于失联党员情况说明岗位说明总经理岗位说明书会计岗位说明书行政主管岗位说明书

了缺血 40神经元胞体和轴突有明 m in 胞膜和膜性细胞器, 稳定细胞内游离钙浓度, 减显的免疫组织化学方面病理学损伤。再灌流 4h 〔7〕轻的受损程度。 N F 脊髓损伤后病理生理神经元损伤进一步加重, 反应阳性, 神经丝N F 机制非常复杂, 各种 紊乱、稀疏、崩溃、溶解, 轴突肿胀、扩大、消失。〔8〕说明再灌流 4神经元胞体和轴突损伤进一步 h 原因均可引起神经元胞体和轴突病变。 本实 加重。上述结果用图像分析, 经统计学比较而证 验说明了细胞骨架紊乱在脊髓损伤后神经元的 ()实。这与作者用脊髓血流 、超微结构、自 SCB F 病理发病机制中起重要作用。〔1〕由基观察到的缺血后再灌注损伤结果一致。 本实验证实神经丝免疫组织化学方法较一般病 4 参考文献理组织学方法能更清楚地显示脊髓神经元胞体 李长有, 王星铎, 金明熙, 等. 应用激光多普勒血流仪监测 1 和轴突病变。 兔急性脊髓缺血损伤后腰髓血流动力学变化及病理学观 在细胞骨架结构中, 是一神经元特异 N F 察的研究. 中华骨科杂志, 1997, 5: 299. , , , . L iem R K Yen SH So lom o n GE e t a lIn te rm ed ia te f ila2 中间丝, 由神经丝蛋白构成, 对于维持细胞的特 2 . , 1978, 79: 637.m en t s in ne rvo u s t issue sJ C e ll B io l 定形状及多种细胞生理功能具有重要意义。 它 . D ah l DImm uno h isto ch em ica l d iffe rence s be tw een neu ro 2 3 广泛分布于神经元的胞体和突起内, 这种特异 , . ,f ilam en t s in p e r ila ryadend r ite s and axo nE x t C e ll R e s 性组织学分布是胚胎发育过程中获得并一直维 1983, 149: 397. 持下来的。 神经丝由三种主要多肽类亚单位 . : B u ld ley GBF ree rad ica l m ed ia ted rep e rfu sio n in ju rya se2 4 〔2〕() 70, 160, 200组 成, 本 抗 体 能 与. , 1987, 55: 66.KD KD KD lec t ive rev iewB r J C ance r . : , Sch laep fe r WWN eu ro f ilam en t sst ruc tu rem e tabo lo s2 70及 200亚单位起反应, 特异性标记脊 5 KD KD . ,m and im p lica t io n s in d isea seJ N eu rop a tho l E xp N eu ro l 〔3〕髓运动神经元和神经突起。 1987, 46: 117. , . Sch laep fe r WW M icko SC h em ica l and st ruc tu ra l ch ange s 缺血时, 组织血供减少, 减少, 膜泵功 A T P 6 . o f neu ro f ilam en t s in t ran sec ted ra t sc ia t ic ne rveJ C e ll B i2 能失灵。 细胞不能维持通过细胞膜适宜的离子 , 1987, 78: 369.o l 2+ 梯度, 进入细胞内激活依赖性蛋白水解酶,C aP e rea2Po lo JR , Fo rem an PJ , J ack so n GR , e t a l. N e rve 7 . ,g row th fac to r and neu ro na l ce ll dea thM o l N eu ro b io l 通过黄嘌呤氧化酶系统在缺血再灌组织中产生 1990, 4: 57. 〔4〕大量自由基。 脊髓神经元胞体和轴突内脂质 . : Po v lisho ck J TT raum a t ica lly induce s axo na l in ju ryp a tho 2 8 . ,gene sid and p a tho b io lo g ica l im p lica t io n sB ra in P a tho l 1992, 2: 1.