_葡聚糖对小鼠单核巨噬细胞系RAW264_7的免疫刺激作用

_葡聚糖对小鼠单核巨噬细胞系RAW264_7的免疫刺激作用 【论著 】( ) 文章编号 : 1005 2376X 2009 10 20902 202 β2葡聚糖对小鼠单核巨噬细胞系 RAW 264. 7的免疫刺激作用 俞晓丽 ,郭兰芳 ,陈璐 ,闻平 ()212002 镇江市第一人民医院 检验科 ,江苏 镇江 β【摘要 】 目的 研究 2葡聚糖的应用对 B a lb / c小鼠巨噬细胞株 RAW 264. 7的刺激作用 。方法 将不同浓度 ( μ)β0～150 g /m l的 2葡聚 糖 不 B a lb / c 小 鼠 来 源 的 巨 噬 细 胞 株 RAW 264. 7 作 用 1 ～7 d 后 , 以 四 甲 基 偶 氮 唑 蓝 ()μβM TT法检测细胞的增殖情况幵绘制细胞生长曲线 。结果 2葡聚糖在 50 ～75 g /m l的浓度范围内能够明显地 β刺激细胞发生增殖 。结 论 适当剂量的 2葡聚糖作用足够时间 , RAW 264. 7 细胞系可 以 发 生 显 著 的 生 长 促 进 效应 。 β 【关键词 】 2葡聚糖 ;巨噬细胞 ;免疫刺激 【中图分类号 】Q539 【文献标识码 】A Imm un o st im u la tory effec t of be ta 21, 3 2D 2g lucan on m ur in e m a cropha ge ce ll l in e RAW 264. 7 an d its s ign if ican ce YU X iao2li, GUO L an2fang, CH EN L u, W EN P ing () D epa rtm en t of L aba rtory M edcine, the F irst People′s H ospita l of Z hen jiang, Z hen jiang 212002, C h ina βTo study the imm uno stim u la to ry effec t of21, 3 2D 2glucan on m u rine m ac rop hage ce ll line 【A b stra c t】 O b jec t ive βRAW 264. 7 and its sign ificance. M e thod Funga l2glucan p a rtic le s we re re so lved in sod ium hyd roxide and added to the ( μ) ce lls a t the concen tra tion s ind ica ted be low 0 to 150 g /m l. A fte r incuba tion fo r 5 days, M TT a ssay wa s p e rfo rm ed and βμthe grow th cu rve wa s comp le ted. Re su lt 2glucan a t mode ra te concen tra tion s 50 to 75 g /m l cau sed app a ren t p ro life ra2 βtion of the m u rine m ac rop hage ce ll line RAW 264. 7. C on c lu s ion W ith an app rop ria te do se of21 , 32D 2glucan and enough d ispo sa l tim e, the grow th of RAW 264. 7 cou ld be p romo ted sign ifican tly and tend to inc rea se. β 【Key word s】 2glucan; M ac rop hage; Imm uno stim u la to ry β; M TT为美液使用 。用时用培养液按一定比例稀释 2葡聚糖是组成高等植物 ,酵母菌和真菌细胞壁 β 的结构大分子之一 。近年来研究表明 2葡聚糖可以 国 Sigm a公司产品 。 [ 1 ] 产生多种不同的效应 ,其中包括抑制肿瘤发生 , NO 1. 2 方法 [ 2 , 3 ]的产生 以及刺激射线防护效应下巨噬细胞的释 1. 2. 1 实验分组 取对数生长期的 RAW 264. 7 细 [ 4 , 6 ] β放 。正是由于 2葡聚糖在免疫反应中表现出的 胞 ,胰酶消化后计数 ,用培养液调整细胞密度为 1 × [ 7 ] 4 μ诸多有利效应导致其成为目前研究的热点 。最近 10CFU /m l,以每孔 200 l接种于 96孔培养板 ,置于[ 8 ] β发现它是一种强大的免疫调节剂 。不同来源的 2 37 ?、5 % CO 的培养箱中培养 , 待 12 h 细胞 贴壁 2 [ 9 ] β葡聚糖 , 在 化 学 组 成 和 结 构 上 都 存 在 一 定 差 异 。 后 ,加入 2葡聚糖溶液 。实验组的终浓度为 10、25、 μ单核 2巨噬细胞是机体重要的免疫细胞 ,具有抗感染 、 50、75、100和 150 g /m l 6 个药物浓度的药液 ,对照 组加入等体积溶剂的培养液 ,每组 3 个复孔 ,实验重 抗肿瘤和免疫调节等重要作用 。 1 材料与方法复 3次 。分别于加药后的 1～7 d测定各孔的吸光度 () μ 值 A 值 。测定前每孔加 5 m g /m l的 M TT 20 l,继 1. 1 材料 () 1. 1. 1 细 胞 株B a lb / c 小 鼠 来 源 的 巨 噬 细 胞 株续孵育 4 h,弃上清液 ,加入二甲基亚砜 DM SO 150 μRAW 264. 7购自中国科学院上海细胞库 。该细胞在l /孔 ,振荡至结晶完全溶解 , 用酶联免 疫 检测 仪在 37 ?、5 % CO及饱和湿度条件下 ,培养于含10 %胎490 nm 波长下测定 A值 。用各组的平均 A 值计算 2 490 (牛血清的 R PM I 1640培养液中 。细胞生长抑制率 。生长抑制率 = 对照组 A 值 - 实验组 A ) 值 /对照组 A 值 ×100 % 。 βSigm a公司产1. 1. 2 药物不试剂 2葡聚糖为美国 1. 3 统计学处理 检测结果以 x ?s表示 ,采用 SPSS μ品 ,配制成 5 g /m l的溶液 ,置 4 ?冰箱保存 ,作为母 10. 0软件包中的直线相关分析相关检测指标间的相 关性 ,组间比较采用 A nova检验和 Bonfe rron i检验 。 【收稿日期 】2009 203 223 2 结果( ) ( ) 【作者简介 】俞晓丽 1975 2, 女 , 主管技师 ; 闻平 1966 2, 男 , 通讯作 β2. 1 2葡聚糖对单核巨噬细胞系 RAW 264. 7 增殖 者 ,主任技师 ,硕士生导师 , 从事临床微生物检验 , Em ail: β的影响 2葡聚糖作用于 RAW 264. 7 细胞株 7 d后 , zjwenp @ 163. com ( ) ,见图 1 , 随着药物作用时间的延测得细胞生长曲线 有显著性 。随着作用时间的延长 72 ～120 h , 100 μ长 ,各组浓度下细胞的增殖速度有明显差异 。从图中 g /m l剂量组细胞的增殖速度明显加快 。药物浓度 μμ可以看出在 24 ～48 h, 10 g /m l剂量组可以明显促 加大 ,细胞增殖开始受到抑制 。 150 g /m l剂量组的 细胞增殖速度明显低于相同作用时间的空白对照组 。进细胞增殖 ,不相同作用时间的空白对照组比较差异 β2葡聚糖对巨噬细胞增殖率 表 1 ( )巨噬细胞增殖率 % β(μ)2葡聚糖 g /m l 1 d 2 d 3 d 4 d 5 d 6 d 7 d 12. 5 0. 06 0. 33 3. 22 3. 44 3. 67 3. 33 0. 12 25 0. 09 0. 75 3. 90 4. 02 4. 23 3. 32 0. 58 50 0. 43 2. 22 11. 25 12. 8 10. 94 11. 92 10. 54 100 0. 42 3. 10 9. 36 13. 02 16. 01 12. 17 3. 12 200 0. 31 2. 20 6. 75 5. 22 3. 87 - 6. 21 - 11. 32 400 - 0. 19 - 1. 38 - 5. 65 - 8. 62 - 21. 04 - 45. 22 - 78. 94 ) ( ) (注 :增殖率为 ER % = A 给药组 - A 对照组 /A 对照组 ×100 % 验使用 B a lb / c小鼠来源的巨噬细胞株 RAW 264. 7 细 β胞系作为研究对象 ,观察 21 , 3 2D 2葡聚糖对其增殖的 影响幵绘制了细胞生长曲线 。 β本研究结果表明 ,21 , 3 2D 2葡聚糖浓度在 ?100 μg /m l时 , 对 RAW 264. 7 细胞系具有促进增殖 的作 用 。不相同作用时间的空白对照组比较差异有显著 μ性 。而丏随着作用时间的延长 , 100 g /m l浓度组细 β胞生长速度明显加快 。该细胞系在适当浓度的 21 , 3 2D 2葡聚糖刺激作用下 ,是否产生了某些可以促进细 β胞生长的物质 ,以及 21 , 3 2D 2葡聚糖信号作用后的细 胞内信号转导机制 ,都有待于我们继续研究 。 β图 1 2葡聚糖对单核巨噬细胞系 RAW 264. 7 增殖的影响 3 讨论 【参考文献 】 β21 , 3 2D 2葡聚糖广泛存在于各类真菌的细胞壁 β[ 1 ] CARROW D J. 21 , 3 2Glucan a s a p rim a ry imm uneactiva to r [ J ]. ( ) Town send L ett, 1996 , 8 1 : 86 291. 中 ,占真菌胞壁成分的 50 %以上 。由于其广泛存在 β[ 2 ]BROWN G D , GORDON S. Funga l2Glucan s and m amm a lian imm un i2 于真菌的细胞壁中 ,当真菌进入血液戒深部组织后 ,( ) ty[ J ]. Imm un ity, 2003 , 19 1 : 311 2315. β经吞噬细胞的吞噬 、消化等处理后 , 21 , 3 2D 2葡聚糖 [ 3 ]NA KA GAWA Y, OHNO N , MURA I T. Supp re ssion by ac tivated hum an 可从胞壁中释放出来 ,自然脱落进入血循环 ,从而使 monocyte s and from T ce lls in the p re sence of monocyte s[ J ]. J Infec t () 血液戒其他体液 如尿液 、脑脊液 、腹水 、胸水等 中 ( ) D is, 2003 , 187 2 : 710 2713. β21 , 3 2D 2葡聚糖含量增高 ,机体免疫系统可以将其迅 [ 4 ]NAM EDA S, SA ITO M , M IURA N N , e t al. Effec t of n itric oxide on be2 ta2glucan / indo2m e thacin2induced sep tic shock [ J ]. Bo il Pha rm B u ll, 速清除 。而巨噬细胞作为机体免疫系统与职吞噬细 ( ) 2005 , 28 6 : 1245 21258. 胞之一 ,成为机体抗入侵微生物的第一道防线 。它通 [ 5 ] HA SH MIO TO T, OHNO N , AADCH I Y, e t a l. Enhanced p roduc tion of 过免疫球蛋白受体和补体受体识别幵吞噬受调理素βinduc ib le n itric oxide syn tha se by2glucan s in m ice [ J ]. FEM S Imm u2 作用的微生物 ;对于未经调理作用的微生物 ,则通过 ( ) no l M ed M ic rob ia l, 1997 , 19 1 : 131 2135. [ 10 ] ( ) 一组胚系编码的蛋白 - 模式识别受体 PRR s,迅 [ 6 ]W E I D , W LIL IAM S D , BROWD ER W. A c tiva tion O f Ap 21 and SP1 co rre late s w ith wound facto r gene exp re ssion in glucan2trea ted hum an 速识别表达于微生物表面的称作病原相关微生物模 ( ) fib rob la sts[ J ]. In t Imm unop ha rm aco l, 2002 , 2 5 : 1163 21172. ( )式 PAM P s的保守微生物分子 , 如主要存在于革兰 [ 7 ]D ELA TTE S J , EVAN S J , H EBRA A , e t a l. Effec tivene ss of be ta2glucan 阴性菌的脂多糖 、革兰阳性菌的磷脂酸以及真菌的葡 co llagen fo r trea tm en t of p a rtia l2th ickness bu rn s in ch ild ren [ J ]. J Ped2 [ 11 ] 聚糖等 。研究发现 , 巨噬细胞表面的多种受体都( ) ia tr Su rg, 2001 , 36 1 : 113 2118. β 可以识别真菌细胞壁主要成分 2葡聚糖 ,其中 D ec2()[ 8 ]D LIU Z IO N R , W ILL IAM S D L. P ro tec tive effec t 下转第 909 页 [ 12 ] β tin21是识别 2葡聚糖的主要受体 。基于此 ,本实 [ 1 ]刘清华 ,孔庆兖 ,柳红. 壳寡糖对 S180 肉瘤细胞凋亜 、细胞周期以 弱 ,所以肝癌细胞出现凋亜 。 及凋亜相关蛋白 B c l22、B ax 的影响 [ J ]. 徐州医学院学报 , 2006 , 26 Ca sp a se是执行细胞调亜的主要酶类 ,绝大部分 ( ) 4 : 290 2293. [ 4 ] 细胞凋亜依赖于 Ca sp a se 的存在 。其中 Ca sp a se23 [ 2 ] KRO EM ER G, GALLU ZZ I L , BR ENN ER C. M itochondfia l m em b rane 是 Ca sp a se家族中属于凋亜效应亚类的 Ca sp a se蛋白 ( ) p e rm e2ab iliza tion in ce ll death [ J ]. Physio l R ev, 2007 , 87 1 : 99 2163. [ 5 ] 酶 ,是 细 胞 凋 亜 过 程 中 最 重 要 的 终 末 执 行 酶 。 [ 3 ] TESTA U , R ICC ION I R. D e regu la tion of apop to sis in acu te m ye lo id [ 6 ]( ) leukem ia [ J ]. H aem a to logica, 2007 , 92 1 : 81 294. KRAJEW SKA 等 发现正常肝细胞 Ca sp a se23 呈中至 [ 7 ] [ 4 ]袁长青 ,丁振华. Ca sp a se的结构不功能 [ J ]. 国外医学分子生物学 高强度表达 , FUJ IKAWA 等 检测出 Ca sp a se23 在肝 ( ) 分册 , 2002 , 24 3 : 146 2151.癌细胞中表达明显降低 ,可见 Ca sp a se23 在肝癌细胞 [ 5 ]张翠娟 , 周庚寅 , 喻芳 , 等. 5 2脱氧杂氮胞苷对 H ep G2 肝癌细胞恶 凋亜中起到一定作用 。本实验研究发现 ,壳寡糖作用 性表型及 ca sp a se23 和 bcl22 表达的影响 [ J ]. 临床不实验病理学杂 于 SMMC27721 肝 癌 细 胞 后 , Ca sp a se23 表 达 明 显 增 ( ) 志 2005 , 21 1 : 103 2106. [ 6 ] KRAJEW SKA M , WAN G H G. KRAJEW SK I S, e t a1. Imm unoh isto2 高 ,由此推测 ,壳寡糖能够通过上调 Ca sp a se23来促进 ( chem ica l ana lysis of in vivo p a ttern s of exp re ssion of CPP32 ca sp a se2 肝癌细胞凋亜 。) ( ) 3 , a cell dea th p ro tea se [ J ]. Cance r R e s, 1997 , 57 8 : 1605 21613. [ 8 ] 资料显示 ,壳寡糖的抗肿瘤机制是多方面的 : [ 7 ] FUJ IKAWA K, SH IRA K I K, SU G IMO TO K, et a1. R educed exp re ssion [ 9 ]FEN G等 发现壳寡糖可以活化巨噬细胞 ,刺激其产 of ICE / ca sp a se l and CPP32 / easp a se3 in hum an hep atoce llu la r ea rc ino2 [ 10 ] 生一些细胞因子来杀伤肿瘤细胞 ; 曹秀明等 认为 ( ) m a [ J ]. A n ticance r R e s, 2000 , 20 3B : 1927 21932. [ 8 ]许青松 ,白雪芳 ,杜昱光. 壳寡糖及其衍生物抗肿瘤作用的研究进 壳寡糖很可能是通过调节荷瘤小鼠免疫力实现抗肿 [ 11 ] ( ) 展 [ J ]. 食品不药品 , 2008 , 5 10 : 60 262.瘤作用的 ;许青松等 提出壳寡糖通过上调促凋亜 [ 9 ] FEN G J , ZHAO L , YU Q. R ecep to r2m ed iated stim u la to ry effec t of o li2 蛋白 B ax的表达来抑制人肝癌细胞 SMMC27721 的增 goch ito san in m ac rop hage s[ J ]. B iochem B iop hys R e s Comm un, 2004 , [ 12 ]殖 ; HAV ISH 等 的研究表明 ,壳寡糖是肿瘤血管生 ( ) 317 2 : 414 2420. 成的有效抑制剂 。笔者通过实验发现壳寡糖能上调 [ 10 ]曹秀明 ,徐海娇 ,尚明 ,等. 壳寡糖抗肿瘤和免疫调节作用的实验 () ( ) 研究 [ J ]. 哈尔滨商业大学学报 自然科学版 , 2006 , 22 4 : 8 210. 促凋亜蛋白 Ca sp a se23的表达和抑制抗凋亜蛋白 B c l2 [ 11 ]许青松 ,魏鹏 ,窦江丽 ,等. 壳寡糖抑制肝癌细胞 SMMC27721 的增 2的表达 ,这很可能也是壳寡糖抑制肝癌细胞 SMMC 2殖及其机制探 [ J ]. 天然产物研究不开发 , 2009 , 21: 152 2154. 7721 增殖幵促进其凋亜的机制之一 , 进一步为壳寡 [ 12 ] HAR ISH K V , THARANA THAN R N. D epo lym e rized p roduc ts of ch i2 糖抗肿瘤提供实验学依据 。 to san a s po ten t inh ib ito rs of tumo r2induced angiogene sis [ J ]. B ioch im ( ) B iop hys A cta, 2005 , 1722 1 : 22 229. 【参考文献 】 () 2216. A nnu R ev Imm uno l, 2002 , 20: 197 上接第 903 页 of glucan aga in st system ic stap hylococcu s au reu s sep tice2 ( ) [ 11 ]BROWN G D. D ec tin21: a signa lling non2TLR p a tte rn2recogn ition re2 m ia in no rm al and leukem ic m ice [ J ]. Infec t Imm une, 1987 , 20 2 : ( ) cep to r[ J ]. 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