姬松茸菌体多糖对环磷酰胺诱发损伤的拮抗作用

姬松茸菌体多糖对环磷酰胺诱发损伤的拮抗作用 姬松茸菌体多糖对环磷酰胺诱发损伤的拮 抗作用 TheAntagonisticEffectsof MyceliumPolysaccharides AgaricusBlazeionDamagedby CyclophosphamideToxicity SUNYi-yangt,LIYang-xia,GAOQian1,ZHAORun,PANYin-jie fJ.ScienceCollegeofAnhuiUniversity,Hefei230039,Anhui, China;2.Edible脚Institute,ShanghaiAcademyofAgricultural ScieneezKeyLaboratoryforEdibleFungusGenetics&Breeding MinistryofAgriculture,Shanghai201106,China) ?壹?壹囊壹 ??? 姬松茸菌体多糖 对环磷酰胺诱发 损伤的拮抗作用 孙亦阳l/李杨霞l/高茜I/ 赵润l/潘迎捷 (1.安徽大学生命科学学院,安徽合肥 230039;2.上海农科院食用菌研究所农业部食 用菌遗传育种重点开放实验室,上海201106) 【摘要】背景与目的:研究姬松茸菌丝体多糖 (Agaricusblazeimyceliumpolysaccharides,Ab-Mp)对环磷酰胺所造成染色体损伤的 抑 制作用及机制.材料与:运用热水浸提法提取姬松茸菌丝体多糖,每天以 10ms/ks和20ms/ks2个剂量对雄性小鼠进行灌胃, 连续15d.于第14d各组小鼠腹腔注射环磷酰胺,24h后重复注射1次.运用流式细 胞术(Flowcytometricmethod,FcM)研究Ab-Mp 对受损肝细胞的细胞周期比例的影响;观察骨髓细胞染色体畸变率,骨髓细胞嗜多 染红细胞的微核率.检测肝细胞匀浆液中MDA和 SOD含量.结果:Ab-Mp影响受损肝细胞各细胞周期所占的比例与阳性对照组比 较,Ab-Mp可以降低肝细胞匀浆液中MDA含量 (P<0.01),并提高SOD活性(P<0.01).Ab-Mp可以降低骨髓细胞的染色体畸变 率和嗜多染红细胞微核率(P<0.01).结论:Ab-Mp 可以明显提高机体抗氧化能力,拮抗环磷酰胺诱发的损伤. 【关键词】姬松茸;细胞周期;染色体畸变;微核测试;拮抗作用;抗氧化 中圈分类号:RI51.1文献标识码:A文章编号:1004—616X(2006)03—0201—04 [~CTIBACKGROUND&AIM:Tostudytheantagonisticeffectsofthemyceliumpolysaccharidesfromagal'icus blazei(Ab-Mp)onthechromosomedal~eofmiceinducedbycyclophosphamide(CP).M11口uALANDMETHOI~:A polysaccharidewasisolatedfrommyceliumofAgaricusblazeibyhotwaterextraction.Ab-Mpweregivenattwolevels, 10ms/kgand20mg/kgtomalemicefor15daysbygavage,andthenthemicereceivedCP40ms/ksbyperitoneal injectiontwice,thelivercellcycleschangeswerecheckedbyFCM.Thechl~mosomeaberration(CA)ratesfromthe boneInan'owcell,themicmnucleusratesfromthePCE(MNPCE)weretested.Inaddition,SODandMDAlevelsof theliversweremeasured.砌 uL1:ThecellcyclesofinjuredlivercellswerechaI]IgedbyAb-Mp.TheMDAlevelin liversoftheAb-MptreatedgroupswereobviouslylowerthanthatoftheCPuntreatedgroup(P<0.01).SODactivities inliverintheAb-Mpgroupsweresignificantlyincreased(P<0.01)andtheirCAratesandtheMNPCErateswere lower(P<0.O1).CONCLUSION:ThemyceliumpolysaccharidesfromAgaricusblazeicouldimprovetheantioxidant capacityv/vo,andhaveanantagonisticeffectOilthedanlageinducedbycyclophosphamidei nmice. f腰ywosoMAgaricusblazei:cellcycle;chromosomeaberration;micronucleustest;antagonisti c~ffect; anti-oxidation 姬松茸(Agaricusblazeimuril1)又名梁金菇,巴西蘑 菇,层菌纲伞菌目蘑菇科,其抗肿瘤效果被认为优于目前 所知的其他蕈茵'】o姬松茸子实体多糖可以恢复7-射线 照射小鼠的造血功能,具有对小鼠急性肝损伤的保护作 用引,促进白细胞对病毒和异常细胞吞噬功能H】o而姬松茸 深层培养的菌丝体多糖(Agaricusblazeimycelium 收稿日期:2O05—06—2o;修订日期:2005—10—20 娥 ~ 徽 (1973m 资 师,博士研究生,研究IIII1I111973作者简介 :),女,安徽省合肥市人,讲师,博士研究生,研究''''' 方向:食用菌药理学.E—mail:sunyiyangO001@tom..C^?c嘲aE婚.啊重^1oa|S?唧^a瑚豳s. O,日m ?奎?变囊奎 ??? polysaccharides,AJ)-M_p)和滤液中胞外多糖均含较高抗肿瘤 活性的有效成分lop—I)-葡聚糖是主要的有效成分lo 环磷酰胺等化疗药物存在一定的副作用,寻找其安 全的,有效的化疗保护剂已成为研究热点.本实验通过 流式细胞术,研究了菌体多糖对环磷酰胺损伤的小鼠肝 细胞的细胞周期的影响.通过研究多糖对骨髓细胞染色 体损伤的恢复作用,以及检测肝细胞匀浆液中丙二醛 (MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)含量,初步探讨了抑制 突变的机制,以期寻找一种有效降低化疗药物环磷酰胺 造成机体损伤的方法. 1材料与方法 1.1材料 1.1.1姬松茸一3购自福建省三明市真菌研究 所. 100m1):玉米淀粉 深层液体培养培养基组成为( 3嘴,酵母膏0.3nag,KH~PO,0.1nag,MgSO4?7H0.1 nag,CaC12.HzO0.1nag,维生素Bl10n.pn=6,250ml 三角瓶装瓶量50ml,接种量10%,温度25oC,150r/min 71o 摇床培养7d【 1.1.2姬松茸菌体多糖 培养液过滤后,收集菌丝体,蒸馏水冲洗3遍.菌丝 体称湿重,以1:100的比例添加蒸馏水,100oC浸提 3h.经旋转蒸发浓缩至原体积1/5,加入95%乙醇4? 静置8h,3000r/min,离心10min,收集沉淀物.分别用 乙醚,丙酮洗涤,蛋白酶与Sevag试剂联合脱蛋白,H: 40?氧化脱色.真空干燥得到姬松茸菌体多糖 (Ab-Mp).用生理盐水配制成10,20mg/ml溶液备用. Ab-Mp的测定苯酚一硫酸法晦,以葡萄糖做 标准曲线(r=0.9975,P<0.01),测定粗多糖含糖量. 1.1.3动物 昆明小鼠,雄性,体重(25?2)g,由安徽医科大学实 验动物饲养中心提供.8周龄,饲养环境温度 (25?1)?,光照时间12h/d,自由进食进水. 1.1.4试剂与仪器 环磷酰胺(上海华联制药公司),RNA酶(上海生 工),碘化吡啶PI由Sigma生产,蛋白酶(0.4U/mg,上 海生工),MDA,SOD试剂盒(南京建成公司);7230G可 见分光光度计(上海分析仪器厂),PCS-910双波段扫描 仪(岛津,日本),流式细胞仪(FACSCalibur.Becton Dickinson,美国),ZHWY-2102C型摇床(上海智诚分析仪 器制造有限公司). 1.2方法 1.2.1灌胃与环磷酰胺处理 IIIIIIIIII CUEMC口腔媚.1皿盯oaE龃&MUr^a脚. ll 2l0l2II 随机分成低糖和高糖组, 小鼠经过3d适应期后, 每组30只,分别设为Ab-Mp-1和Ab-Mp-2组,每天以10, 20mg/kg灌胃,连续15d.另设空白组30只,用生理盐 水替代多糖灌胃.于第14d,各组小鼠用浓度为40 mg/kg的环磷酰胺对小鼠腹腔注射,24h后重复注射一 次. 1.2.2小鼠肝细胞的分离 环磷酰胺处理12h后,将小鼠断颈处死,剪下肝组 织,放在培养皿中,生理盐水冲洗2次,眼科剪剪碎,加 预冷的PBS于5ml匀浆管轻轻匀浆2min,自然沉降2 min.倒出上清液,尼龙网过滤,收集单细胞悬液.0.4% 苔盼蓝染色2,3min,镜检活细胞比例大于95%,细胞 浓度为8×10个/ml. 1.2.3细胞周期的检测 将单细胞悬液离心取沉淀,加70%乙醇固定24h 以上.离心去固定液,加PBS洗2遍.加0.2%RNA酶, 5ttg/mlPI染色30min.488nnl激发波长下检测各细 胞周期所占比例.WinMDI29软件分析数据. 1.2.4骨髓细胞染色体畸变率的观察 于环磷酰胺处理完后22h,腹腔注射40mg/kg的秋 水仙素,2h后处死小鼠.剪下股骨,用PBS冲出骨髓细 胞,0.075mol/LKC1于37?低渗处理2h.1000r/min 离心10min,弃去上清液,取浓细胞,甲醇固定两次,共10 min.空气干燥法制片.0.3%Giemsa染液(pn6.8),染色 10min.双盲法镜检,选择染色体分散良好,收缩适中的 中期分裂多染红细胞1000个,按下列公计算染色体畸 变率. 染色体畸变率=染色体畸变细胞数/分析染色体细胞数. 1.2.5嗜多染红细胞染色体微核率的观察 . 方法同参考文献【9】 1.2.6SOD,MDA含量的检测 肝细胞的分离见1.2.3,以2000r/min离心15 min,取上清液,实验方法参照试剂盒所附说明. 1.2.7统计学方法 采用SPSS11.0软件,进行t检验. 2结果 2.1姬松茸多糖的检测 苯酚一硫酸法测定Ab-Mp的平均含糖量为 31.7%.经过福林一酚试剂反应和茚三酮反应检测为阳 性,初步证明多糖中含有蛋白质;在进一步的分离过程 中加入蛋白酶来水解蛋白质,透析除去蛋白酶.在 200,300nnl波长范围内扫描多糖提取液,发现280nrrI 处仍有吸收峰,260nnl处则无峰出现.说明该多糖为蛋 OMay. 白结合多糖,即蛋白聚糖. 2.2Ab-Mp对受损肝细胞的细胞周期影响 环磷酰胺除对G.期(静止期)细胞作用比较弱外, 对增殖周期中各期细胞均有破坏作用.细胞周期的不同 阶段对环磷酰胺的敏感性也不同,一般认为,G2/M> G0/G1>S期m】.AB-Mp使正常细胞从损伤后的G2,期 阻滞中部分进人G.期.G.细胞含有较多DNA修复酶, 使细胞得以充分修复辐射所致DNA损伤,提高了细胞 的增殖活性.加快肝细胞从Go/G.期进入S期,而S期 细胞DNA对药物最不敏感,可以发挥保护DNA免受药 物损伤的作用(1). 裹1A对肝细胞的细胞周期影响 Table1EffectofA帅ORthecellcydeofhepatocytes 9P??———————_i— CP68.964-2.4521.744-2.599.304-O.9l Ab-Mp-I69.12~1.7822.394-2.108.494-2.24" 丛地Z!:主2:l:丝:丝主!:生!:?:主!: Gi:gap1pIlase,s:synthesisphase,G2:gap2phase,M:mitosisa: P<0.05.comparingwithCPcon~olgroup;A:P<0.Ol,c0Il呻gwithCP con~olgroup ?童?童囊童 ??? 2.3AB-Mp对受损骨髓细胞染色体畸变率 (CA),嗜多染红细胞微核率(硼PcE)的影响 染色体畸变是染色体结构发生改变,即环磷酰胺导 致染色体或染色单体发生断裂,且断裂位点不发生复 原.Ab-Mp组小鼠的骨髓细胞染色体畸变率明显低于 cP对照组,从染色体水平上反映了Ab-Mp对环磷酰胺 造成的染色体损伤具有拮抗作用(表2). 微核测试是一种哺乳动物体内试验,在染色体突 变时,在间期细胞核形成中表现出的一种损伤形式. 表2显示,环磷酰胺引起了微核率的显着提高,AlyMp 组的微核率与阳性对照组比较差异有统计学意义 (P<0.01).说明Ab-Mp可以降低环磷酰胺造成的染 色体损伤,即Ab-Mp具有显着的保护染色体,预防突 变的功效. 2.4AB-Mp对肝细胞匀浆液的抗氧化性影响 表3显示,Ab-Mp可以明显增强受损的小鼠肝细胞 SOD活性,降低MDA含量,其浓度与SOD活性呈现相关 性.SOD的作用是还原过氧化物,其活性增强可使脂质 过氧化物损伤降低.Ab-Mp增强了内源性氧自由基清除 裹2Al?Mp对骨?细胞染色体畸变和P【冕微核率的影响 Table2EffectofAb-MpORCAratesfromthehoneill~rrowcellandthemicronndeusratesfro mthePCE(MNPCE) CP103 AbMp-I103 l97 144 l9.7 l4.矿 l3.3^ lo. 1o. 3l 24 3l 24*22.6 38.7 IR:Inhabitationrates;IR;(Ab-MpgroupCArateCPcon~olgroupCArate)/CPcon~olgroup CArate;IR.:(Ab-MpgroupMNPCErate-~conUol groupMNPCErate)/CPcon~olgroupMNPCErate;A:P<0.0l,c0哪)aredwithCPgroup. 系统的功能,降低体内MDA含量.这与我们以往的研 究"结论相似,即姬松茸菌体多糖可以提高机体的总 抗氧化能力. 裹3AI对肝细胞的MDA含E~SOD活性的影响 Table3EffectofAbMpORMDA~onteatandSODa~vityof hepatocytes A:P<0.0l,c0哪)aredwithCPgroup 3讨论 环磷酰胺是临床上最常用的肿瘤化疗烷化剂,通过 与DNA交叉联结,而直接破坏DNA,可致染色体畸变, 突变而影响分裂,引起细胞的坏死,凋亡.在肝微粒体 P450酶系的代谢下可产生有毒的活性产物,如丙烯醛 (Acrolein,AC),磷酰胺芥(Phosophoramidemustard. ◎ PM).这些中间产物可与蛋白质,核酸,脂质等分子结 合,导致重要功能酶活性改变,使细胞内外环境的稳态 受破坏,即造成氧化性肝损伤".1引.环磷酰胺还迅速升 高了超氧自由基的浓度,高水平氧自由基与细胞凋亡的 发生有密切关系. 人们期望寻找到安全,有效的化疗保护剂.由于姬 松茸的抗肿瘤效果优于目前所知的其他蕈菌,利用其抗 肿瘤活性和突变保护剂活性,可以作为化疗患者正常细 胞的突变保护剂;也可以与常规化疗药物配伍,加大疗 效,保护正常细胞免受药物损伤. Ab-Mp降低遗传损伤的原因,可能在于:Ab-Mp能 够增加肝脏的解毒能力.姬松茸多糖对小鼠急性肝损 伤具有保护作用,减轻cP引起的氧化性肝损伤,降低 AC,PM的诱变作用【3】.Ab-Mp通过改变肝细胞的细胞周 期来降低cP的致突变损伤,即减少对cP敏感的细胞 周期G2/M期所占的比例,增加不敏感的s期所占的比 IIIIIIIIII CUmC日旧港.?^?C?口西?M【胜C螂? …2I.I3f O ?变?变寞变 ??一 例.Ab-Mp降低了骨髓细胞染色体的畸变率和嗜多染红 细胞染色体微核率(MNPCE),恢复受损机体的造血功 能[2,12】.经机体吸收和代谢后,Ab-Mp能提高抗氧化酶活 性,发挥清除自由基的功能,降低了脂质过氧化损伤,从 而减轻活性氧自由基对免疫系统和DNA的损伤.研究 表明,姬松茸多糖能增殖免疫细胞,提高自然杀伤细胞 NK的活性[1,从而及时清除变异的或凋亡的细胞,达 到抗突变的功效.至于Ab-Mp对抑癌基因的表达的影 响,有待于我们进一步研究. Ab-Mp对环磷酰胺诱发的损伤具有拮抗作用.该结 论与Luiz等n发现姬松茸多糖的抗突变作用的结论相 吻合.姬松茸的抗癌效果在覃菌中最好,素有"癌症患者 最后的食品"的美誉.研究Ab-Mp的抗突变功能,揭示其 抗癌机理具有重要意义.开发姬松茸多糖作为天然的保 健品,药品无疑是一个新的研究方向. (致谢:中国科技大学生命科学学院实验中心提供的技术与 仪器支持) 参考文献 [1】MizunoT,inagaldR.KanaoT.eta1.Anti-tumoractivityand 8onlepropertiesofwater-insolublehetero-glycansfrom "Himematsutake",thefruitingbodyofagaricusnblazeiMurill [J】.agricBioChem,1990,54(11):2889—2896. [2】席亚明,席亚荣,孙延庆,等,梁金菇多糖对辐射损伤小鼠造 血功能的影响【J】.中华放射医学与防护杂志,2002. 22(4):291—292. [31段县平,马吉飞,郑东虎.姬松茸多糖对小鼠急性肝损伤的 保护作用及其毒性的研究….动物科学与动物医学,2003. 20(11):21—22. 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