蛋白质含量的测定

蛋白质含量的测定 [目的] 掌握双缩脲法测定蛋白质浓度的原理和曲线的绘制。 [原理] 双缩脲(NH2CONHCONH2)在碱性溶液中与硫酸铜反应生成紫红色化合物，称为双缩脲 反应，蛋白质分子中含有许多肽键(-CONH-)在碱性溶液中也能与Cu2+反应产生紫红色化合物。在一定范围内，其颜色的深浅与蛋白质浓度成正比。因此，可以利用比色法测定蛋白质浓度。 双缩脲法是测定蛋白质浓度的常用方法之一。操作简便、迅速、受蛋白质种类性质的影响较小，但 灵敏度较差，而且特异性不高。除-CONH-有此反应外，-CONH2、-CH2NH2、-CS-NH2等基团也有此反 应。 [操作] (一) 绘制标准曲线 (二) 未知样品蛋白质浓度的测定 1(取12支试管 6支分别加入0，0.4，0.8，1.2，1.6，2.0毫升的标准 6支分别加入1毫升不同稀释浓度的待测液(两两相同)。 2(分别加水补足到2毫升。 3(分别加入4毫升双缩脲试剂在室温/37?下放置30分钟。 4(在540毫微米波长下分光光度计比色、读数，记录各管A值。 ( [计算] (一) 在座标纸上以光密度为纵座标，以蛋白质浓度为横座标绘制标准曲线。 (二) 从标准曲线中查出待测血清样本的蛋白质浓度(g,L)，并求出人血清样本的蛋白质 浓度。 (三) 再从标准管中选择一管与测定管光密度相接近者，求出人血清样本的蛋白质浓度(g,L)。 [器材] 中试管7支，l毫升刻度吸管3支，10毫升刻度吸管1支，水浴箱，721型分光光度计、坐标纸。 [试剂] (—) 6N NaOH:称取240g氢氧化钠溶于1000ml水中。 (二) 双缩脲试剂:称取CuS04?5H2O 3(0克，酒石酸钾9(0 克和碘化钾5(0克，分别溶解后混 匀，加6N NaOH l00ml，最后加水至1000ml，贮于棕色瓶中，避光，可长期保存。如有暗红色沉淀出现， 即不能使用。 (三) 0.9,NaCl。 (四) 蛋白质标准液(10mg,m1)，称取干燥的牛血清蛋白100(0mg，以少量生理盐水溶解后倒入l0ml容量瓶中，淋洗称量瓶数次，一并倒入容量瓶中，最后加生理盐水至刻度线，或用凯氏定氮法测定血清蛋 白质含量，然后稀释成l0mg,m1作为蛋白质标准液。 (五) 待测血清样本:将人血清或动物血清用生理盐水稀释10倍后再测定。