体外诊断试剂生产及质量控制技术指导原则-生物芯片部分

体外诊断试剂生产及质量控制技术指导原则-生物芯片部分 6 —— 本指导原则所定义的生物芯片诊断试剂是指将多个生物探针 （包括DNA片段，寡核苷酸、抗原、抗体，组织，细胞等）按预先 的排列方式固定在特制的基质（包括玻璃片，尼龙膜，硝酸纤 维素膜等）上，用特定的方法提取生物靶分子并进行标记，然后与 固定在基质上的生物探针特异性的结合，再用相应的设备（如 激光扫描仪、CCD检测仪等）和分析方法（包括软件）进行检测、 记录、分析，实现对生物靶分子的定性或定量检测的试剂。 根据芯片制作的主要原料和方法，生物芯片可分为核酸芯片、 蛋白芯片、细胞芯片、组织芯片、芯片实验室等。本指导原则是针 对核酸和蛋白为检测靶分子生物芯片的生产及质量控制技术指导原 则，其它类型靶分子检测的芯片诊断试剂可参考本指导原则。国家 食品药品监督管理部门将依据科学技术发展的需要，适时组织修订。 （一）生物芯片诊断试剂生产用各种原料，辅料等应制定相应的 质量指标，并应符合有关法规的要求。 （二）生物芯片诊断试剂的生产企业应具备相应的专业技术人 员、仪器设备以及适宜的生产环境，获得《医疗器械生产许可证》； 同时，应按照《体外诊断试剂生产（试行）》的要求建立相 应的质量管理体系，形成文件和记录，加以实施并保持有效运行；还 应通过《体外诊断试剂生产企业质量管理体系考核评定（试行）》 的考核。 （三）生物芯片诊断试剂的研制应当按照科学、的原则组织 研发，各反应条件的选择和确定应符合基本的科学原理。 （四）生物芯片诊断试剂生产过程中所用的物料及工艺，应充 分考虑可能涉及的安全性方面的事宜。 （五）生产和质量控制的总体目标：保证试剂使用安全、质量 稳定、工艺可控、检测有效。 （一）核酸检测芯片 核酸芯片检测时，从生物样本中提取的核酸可用荧光标记、金 标记和酶标记。检测方法包括光谱学方法和化学显色。下面为荧光 标记芯片技术指导原则，采用金标记和酶联显色等的生物芯片诊断 试剂可参照核酸芯片和蛋白芯片相关部分。 1、主要生物原料 核酸检测芯片的主要生物原料包括模板DNA、dNTPs、引物、探 针、标记物等。主要生物原料若为企业自己生产，其工艺必须相对 稳定，企业应按照工艺要求对这类生物原料进行质量检验，以保证 其达到规定的质量标准；若购买，其供应商要求相对固定，不能随 意变更供应商，同时，供应商应提供相应的质量保证证明和相应的 质量检验报告，达到生产规定的质量标准。如果主要原料（包括工 艺）或其供应商有变更，应依据国家相关法规的要求进行变更申请。 （1）模板DNA 重组DNA：经测序验证，关键位置没有错误。1×TE溶解，浓度为1μg/μl以上，-20?保存。 （2）dNTPs（dATP/dUTP/dGTP/dCTP/dTTP） HPLC纯，PCR级，无DNase、RNase污染。-20?以下保存。 （3）引物 序列确证；进行PCR扩增后，克隆测序鉴定验证，建立引物标 准品。生产中的引物原材料为冻干粉，PAGE纯或HPLC纯。用标准DNA模板扩增，电泳检测，谱带单一，大小正确，与对照引物比较，产 物量一致。符合视为合格引物。-20?以下保存。 （4）探针（用于阵列制备） 重组DNA, 冻干粉（或1×TE溶解液）：每种90μg以上，酶切鉴定分析图谱。 PCR产物，冻干粉（或1×TE溶解液）：每种90μg以上，PCR电泳鉴定图谱。 合成寡核苷酸：PAGE纯或HPLC纯，每种90μg以上，提供该产品 的PAGE电泳分析图谱或HPLC分析图谱。 探针序列的正确性：应用克隆鉴定的标准进行DNA杂交鉴定或测序鉴定。 纯度和浓度检测：采用电泳方法，电泳图谱没有杂带，目的条 带的强度与已知浓度的标准DNA条带进行参比计算其强度。纯度较 高的DNA，可用紫外分光光度计进行定量。检验合格后入库，避光、 -20?以下保存。 （5）标记物 含有激发光波长和发射光波长介于280,680nm的所有荧光分子，HPLC纯。 （6）Taq DNA聚合酶 SDS-PAGE 检测，纯度＞95%，具有DNA聚合酶活性，无核酸内切酶活性；具热稳定性，94?保温1小时后仍保持50％活性。-20? 保存。 （7）UNG（尿嘧啶糖基化酶） 具尿嘧啶糖基化酶活性，无核酸外切酶及核酸内切酶活性。1U 3UNG 37?处理3分钟后，10拷贝以下含U模板被降解后，不能产生扩增产物。-20?保存。 （8）RT 酶 具有逆转录活性。-20?保存。 （9）RT-PCR酶 具逆转录酶活性和DNA聚合酶活性，无核酸内切酶活性，具热 稳定性，94? 1小时后仍保持50%活性。-20?保存。 （10）缓冲液 各类酶制品所需的反应缓冲液由厂家随酶制品提供。-20?保存。 2、主要生物辅料 主要生物辅料包括酶类（蛋白酶、核酸酶等）、核酸提取试剂、 鱼精DNA、封闭用蛋白、杂交液等，企业应建立相应的质量标准。 主要生物辅料若为企业自己生产（配制），其工艺必须相对稳定， 并按照工艺要求对这类生物原料进行质量检验，以保证其达到规定 的质量标准；若购买，其供应商要求相对固定，不能随意变更供应 商，同时，供应商应提供相应的质量保证证明和相应的质量检验报 告，达到生产规定的质量标准。 3、主要化学原辅料 参照《中国生物制品主要原辅材料质控标准（2000年版）》分析纯级别进行检验。主要的检测指标包括：溶液外观、一般盐类检 测、溶液pH值、溶解情况、干燥失重、炽灼残渣等。 主要化学原材料的供应商要求相对固定，不得随意发生变更。化 学原材料在购入时，原材料的生产商必须提供该批次化学原材料的质 量保证材料和质量检验报告，其质量标准应达到生产所需的质量标 准。 4、其他物料 （1）载玻片 外观：明亮处用肉眼观察无缺刻，无划伤等。规格按设计要求。 激光扫描仪扫描（波长为芯片检测波长）：包被层基本均匀。 （2）试管、吸头、试剂瓶等 一次性使用，由生产厂家提供质量保证，达到设计要求。 （3）其他： 包括试剂瓶标签、铝箔袋、衬垫、可密封塑料袋、说明书、干燥 剂和包装外盒等，应参照国家食品药品监督管理局颁布的《体外诊断 试剂说明书编写指导原则》和《医疗器械说明书、标签和包装标识管 理规定》建立相应质量控制标准，如数量、规格等。 （二）蛋白检测芯片 1．主要生物原料 与生产的产品质量最密切相关的生物原料包括各种活性抗原、重 组抗原、单克隆杭体、多克隆抗体以及多肽类生物原科。这类原料可 用于点膜、标记相关酶、纳米金、光学基团及中和反应用抗原或抗体 等。使用前应按照工艺要求对这类生物原料进行质量检验，以保证其 达到规定的质量标准。主要生物原料若为企业自己生产，其工艺必须 相对稳定；若购买，其供应商要求相对固定，不能随意变更供应商， 如果主要原料（包括工艺）或其供应商有变更，应依据国家相关法规 的要求变更申请。 主要生物原料的常规检验项目一般包括： ? 外观 肉眼观察，大部分生物原料为澄清透明的液体，不含异物、浑浊 或摇不散的沉淀或颗粒；或者为白色粉末，不含有其他颜色的杂质； 特殊生物原料应具备相应外观标准。 ? 纯度和分子量 主要经SDS-PAGE 电泳后，利用电泳扫描仪进行分析，也可用其 他适宜的方法，如高效液相法等。根据所检测生物原料的分子量选择 适宜丙烯酸胺凝胶浓度进行电泳。一般情况下，每个电泳道加样量为 5μg，同时用已知分子量的蛋白标准品作参照，采用合适的电泳电流， 电压和电泳时间；电泳后的凝胶可用考马斯亮蓝染色或银染法染色。 染色后的凝胶用电泳扫描仪分析原料的纯度和分子量，纯度应达到相 应的质量标准，分子量大小应在正确的条带位置。 ? 蛋白浓度 蛋白浓度可通过Lowry法、280nm 光吸收法、双缩脲方法等进行 检测。 ? 效价 效价的测定一般根据蛋白含量测定结果，通过倍比稀释法进行。 效价应达到规定的要求。 ? 功能性实验 功能性实验是指生物原料用于试剂盒实际生产中的情况，一般考 查使用该原料的试剂的灵敏度、特异性和稳定性等，并比较其与上批 次原料的相关性。 2．主要生物辅料 生物辅料指的是在生产过程中作为蛋白保护剂用途的一类生物 原料，主要包括小牛血清、山羊血清、牛血清白蛋白和酪蛋白等。这 些生物原料均应按照《中国生物制品主要原辅材料质控标准（2000 年版）》所规定的质量标准要求进行检验，达到相应的质量标准后方 可应用于生产。 建议作以下检验： ? 牛血清或羊血清 外观：为浅黄色澄清稍粘稠的液体，无溶血或异物 无菌试验：将血清直接放37度培养7天，放在明亮处观察，不得 出现混浊。 总蛋白含量：用双缩脲方法来测定，标准为不小于32mg/ml。 球蛋白含量：取待测血清1ml，加入0.85%的NaCl溶液。 加入饱和硫酸铵1ml，置4?，2小时，8000rpm离心10分钟，弃上清。沉淀溶于0.85%NaCl溶液，至1ml，用Lowry方法测定蛋白含量，不 能大于2mg/ml。 ? 牛血清白蛋白： 外观：应为浅黄色冻干粉末无吸潮，无结块，无肉眼可见的其它 杂质颗粒。 溶解性：将牛血清白蛋白配成10%溶液，溶解时间在18-26度时应不大于15分钟。1%水溶液的ｐＨ值应为6.5,7.1。 总蛋白含量：用双缩脲方法来测定，质量标准为大于等于95％。 总蛋白中的BSA含量：采用硝酸纤维素膜电泳法，其标准为?95%。 BSA的净含量：总蛋白含量乘总蛋白中的BSA含量，其标准为?90%。 ? 酪蛋白： 酸度应符合生产所需的质量标准。 ? 标记用酶 应在产品的质量标准中明示所使用的标记用酶的名称（如辣根过 氧化物酶、碱性磷酸酶等），同时应根据不同生产厂家的检验方法和 /OD）应大于3.0。 质量标准进行检验，酶的纯度RZ值（OD403nm280nm 对于小牛血清或山羊血清、牛血清白蛋白以及酪蛋白等，还应进 行功能性实验，即以其为原料配制一定浓度的稀释液作为样品，进行 测定，均不得出现非特异性反应。 生物辅料的供应商同样要求相对固定，不得随意变更供应商。 3．化学原辅料 参照《中国生物制品主要原辅材料质控标准（2000年版）》分析纯级别进行检验。主要的检测指标包括：溶液外观、一般盐类、溶液 pH值、溶解情况、干燥失重、炽灼残渣等。 主要化学原材料的供应商要求相对固定，不得随意发生变更。化 学原材料在购入时，原材料的生产商必须提供该批次化学原材料的质 量保证材料和质量检验报告，其质量标准应达到生产所需的质量标 准。 4．其他物料 ? 基质 以硝酸纤维素膜为例：孔径符合设计要求（0.45μm、0.22μm等）、均一性（厚度及毛细迁移速度?20％）、尺寸（与标识吻合） ? 瓶子和干燥剂 由生产厂家提供质量保证，达到规定要求。 ? 其他：说明书、包装外盒等 应参照国家食品药品监督管理局颁布的《体外诊断试剂说明书编 写指导原则》和《医疗器械说明书、标签和包装标识管理规定》建立 相应质量控制标准，如数量、规格等。 生物芯片主要包括DNA芯片、蛋白芯片、组织芯片、细胞芯片 以及芯片实验室等。生物芯片诊断试剂产品基本可分成二个部分， 一部分是芯片，另一部分检测用工作液。如果有配套的检测仪器， 还需对仪器及处理软件的应用加以说明。 （一）芯片的生产 芯片生产的基本过程包括探针的获取方法，纯化，点样，固定。 1．探针获取 不同的芯片，主要是探针不同，生物芯片的探针主要包括以下几 类，其它探针可参考制定相应的技术及质量标准。 （1）DNA探针的获取 探针的形式有PCR产物、克隆DNA、人工合成DNA片段等；要求有生产程序和质量指标及检测方法，要进行纯化，有固定的纯化程序。 （2）抗原的生产 抗原的获得方法包括细胞培养、从生物材料中分离提取、基因工 程表达以及合成肽等。基因工程表达产物又分为纯抗原蛋白、融合蛋 白等。 （3）抗体 抗体分单克隆抗体和多克隆抗体。抗体制备包括细胞培养，动物 腹水，基因工程表达等方式。 （4）细胞和组织 包括细胞或组织类型，固定方法。组织材料还包括固定，包埋， 切片等。 （5）芯片实验室，包括各种管道泵的制作等。 2．阵列的排列设计 阵列的排列包括依次排列、随机排列、对角线排列等，设计时需 考虑重复次数等。 3．点阵的制作 使用仪器的要确定型号，程序；手工制作的也应有标准操作程序。 4．固定：包括固定方式，固定的条件等。 应对芯片生产的过程进行相应的质量控制，如点样和固定过程的 监控、点样均一性检验等。 （二）工作液配制 1．芯片生产所需试剂，包括细胞培养基，探针制备试剂，阵列 制作和固定试剂等。 2．样品处理试剂，芯片检测靶分子分为核酸和蛋白质。检测核 酸的样品处理试剂包括临床取样，DNA提取或RNA提取试剂，逆转录试剂，PCR扩增试剂，核酸标记试剂等；检测蛋白的处理试剂包括取 样试剂，蛋白稀释液以及特殊试剂等。 3．反应液：检测核酸时的反应液包括预杂交液，杂交液，洗脱 液等；检测蛋白时，包括封闭液，抗原/抗体反应液，洗脱液，显色 液，显色终止液等。 （三）数据判读 1．判断标准及依据，包括Cut off值的确定依据。 2．数据判读方式：人工还是软件判读。 3．如果是软件判读，应提供软件判断的科学依据（包括生物学 原理、数据获取原理和判断实验是否成立的依据）以及实验测试的原 始报告（或数据），并需要说明： ? 软件的来源：购买或自己编制，是否获得注册等。 ? 软件的用途：包括对数据的分析、存储、解读、含义等。 ? 软件的使用：基本的使用程序。 （一）抽样 检验人员按批号抽取检验需要数量的半成品，作好标记，待检。 （二）半成品检验 利用上一批检验合格的试剂盒的相应组分，对本批生产出的各种 试剂盒组分分别进行检验，检验结果达到产品的质量标准。 半成品检验，一般使用国家标准品（参考品）或经国家标准品（参 考品）标化后的质控品。若某类试剂没有国家标准品（参考品），则 使用企业参考品，但该企业参考品的质量标准不能低于国家药品监督 管理部门已经批准的同类试剂的质量标准。 检测所抽样的半成品的试剂盒性能，包括阴阳性参考品的符合 率、灵敏度（最低检出量）、精密性等，均应达到相应质量标准的要 求，对精密性，一般情况下CV不得高于15％。对定量检测试剂，同时应分析其线性相关系数和校准品检测结果的准确性。 企业应该对每一批试剂的半成品进行稳定性研究。稳定性试验可 在在特定温度或特定条件下完成（对蛋白芯片，应完成37?热稳定性试验），试验结果应符合产品的质量标准。 产品包装完成后，质检人员根据试剂的批号、实际包装量、抽样 申请单的要求进行抽样，同时填写抽样数量和抽样日期，并且由抽样 人签名。抽样数量应包括检验用数量和留样数量。质检人员同时应检 查相关原始记录。 每一批生物芯片类诊断试剂报批批量应至少为3000人份。 （1）成品检验 一般使用国家标准品（参考品）对成品进行检验，并达到质控品 的质量要求。若该诊断试剂没有国家标准品（参考品），则使用企业 参考品，但其质量标准不能低于国家药品监督管理部门已经批准的同 类试剂的质量标准。 （2）稳定性试验 每批试剂批放行前，应完成稳定性试验，并达到相应的质量标准。 稳定性试验可在在特定温度或特定条件下完成（对蛋白芯片，应完成 37?热稳定性试验）。