嗅鞘细胞条件培养液对骨髓基质干细胞的诱导分化作用研究

嗅鞘细胞条件培养液对骨髓基质干细胞的诱导分化作用研究 嗅鞘细胞条件培养液对骨髓基质干细胞的 诱导分化作用研究 第14卷第24期 2006年12月 中国矫形外科杂志 OrthopedicJournalofChina Vo1.14.No.24 Dec.2006 嗅鞘细胞条件培养液对骨髓基质干细胞 的诱导分化作用研究? 冯林杰,罗卓荆,王晓,沈学锋,孟浩,王亮,史晓娟 (1.第四军医大学西京医院全军骨科研究所,西安710032;2.第四军医大学神经生物学教研室,西安) 摘要:[目的]探讨大鼠嗅神经鞘细胞条件培养液对同种大鼠骨髓基质干细胞的诱导分化作用.[方法]通过 差速贴壁法获得较高纯度的嗅鞘细胞,在接种培养后的9,12d,收集并制备嗅鞘细胞条件培养液,与纯化培养第3 代的骨髓基质干细胞共培养,观察其诱导分化后的形态学变化,免疫荧光染色鉴定诱导分化结果.[结果]发现大鼠 嗅鞘细胞条件培养液对同种大鼠骨髓基质干细胞有明显的诱导分化作用,在72h时荧光显微镜下观察并计算MAP一2 和GFAP阳性细胞的比率分别为55%,23%.[结论]大鼠嗅鞘细胞条件培养液有明显的诱导同种大鼠骨髓基质干细 胞向神经样细胞分化的作用. 关键词:骨髓基质干细胞;嗅鞘细胞;共培养;分化 中图分类号R687文献标志码A文章编号:1005—8478(2006)24—1894—02 StudyofthedifferentiationofBMSCsinducedbytheOECsconditionedmedium?FE? GLin-jie,LUOZhuo-jing, WANGXiao— ren,eta1.InstituteofOrthopedics,XijingHo~ital,theFourthMilitaryMedicalUniversity,Xian710032,China Abstract:[Objective]Toexplorethedifferentiationofbonemarrowstlomalcells(BMSCs)inducedbyOECsconditionedme— dium.[Method]ThepurifiedOECswereacquiredbyselecliveculturemediumandcultivatedinthepolylysinecoatedplate.After 9, 12daysculture.OECsconditionedmediumwasobtainedby2000r/minconfigurationandthenCO—cultivatedwithpurifiedBM— SCswhichwere3thgeneration.ThedifferentiationofBMSCswereobservedunderinveaedmicroscopeandwereidentifiedbyiinnlu— mofluorescencemethod.1ResultITheOECsconditionedmediumhadobviouslyeffectsonBMSCsdifferentiation.BMSCsdifferentia. tionintoneuron— likecellsratioWas55%anddifferentiationintoastroctescellsratioWas23%.『Conclusion]Theconditionedmedi. aiRwhichcomesfromOECsculturesupernatanthasobviouslyeffectsonBMSCsdifferentiationintoneuron.1ikecells. Keywords:bonemarrowstlomalcells;olfactoryensheathingcells;CO.culture:differentiation 长期以来,脊髓损伤后的修复治疗,一直是人类面临的 巨大挑战.近年来采用细胞移植治疗脊髓损伤,为脊髓损伤 后的救治提供了一种新的方法.骨髓基质干细胞(bonemar. 1owstromalceils,BMSCs)因其容易获取和可实现自身移植, 而成为了脊髓损伤治疗的种子细胞,然而其移植前的诱导分 化问题也一直是研究和治疗过程中臻待解决的问题.存在于 嗅球内的嗅鞘细胞(olfactoryensheathingcells.OECs)可以 分泌多种营养因子,并且可以维持并促进损伤神经轴突的再 生.在本实验中,采用嗅鞘细胞条件培养液13与骨髓基质干 细胞共培养,观察骨髓基质干细胞的分化情况,为脊髓损伤 的救治提供必要的理论依据. ?基金项目:国家863课题项目(2002AA216101) 作者简介:冯林杰(1980一),男,河北人,硕士在读,研究方向:脊柱 脊髓损伤修复,(电话)029—82502120(电子信箱)flj403@fm— mu.edu.ca 通讯作者:罗卓荆,教授,博士生导师 1894 1材料和方法 1.1材料 雄性SD大鼠,230g,由第四军医大学实验动物中心提 供;DMEM/F12,胎牛血清(FCS),驴血清,Ara—C,多聚 甲醛均购自Gibco公司;一抗为小鼠抗MAP一2,兔抗GFAP, 二抗为驴抗小鼠FITC,驴抗兔DexasRed,Hoechst33342,多 聚赖氨酸,胰蛋白酶,胰蛋白酶终止剂均购自Sigma公司. LEICA倒置相差显微镜,荧光显微镜OLYMPUSBXS1型. 1.2方法 1.2.1BMSCs原代培养 断颈处死SD大鼠,无菌条件下,完整取出双侧股骨胫 骨,剪开干骺端,暴露出骨髓腔,用5ml注射器,分别吸取 2ml培养液冲洗骨髓腔2—3次,将所获的冲洗液经过70目 滤网过滤,然后加入相同体积的0.84%NHC1溶液].850 r/min离心10min后弃去上清,培养液(DW12+15%FCS) 稀释后制成单细胞悬液,分别接种在2个25am培养瓶内, 第14卷第24期 2006年12月 中国矫形外科杂志 OrthopedicJournalofChina Vo1.14.No.24 Dec.2006 于37?,5%CO,,饱和湿度的培养箱中培养,72h后换液除 去未贴壁细胞,以后每周换液3次,当细胞融合达80%时, 用0.25%胰蛋白酶消化传代培养. 1.2.2OECs培养纯化 参照文献[3]的方法,分离培养并纯化嗅鞘细胞. 1.2.3OECs条件培养液的制备及BMSCs分组处理 待纯化后的OECs生长至70%融合时,一般选择在9, 12d时,弃去旧培养液,以新鲜培养液(DF12+15% FCS)清洗2次,然后再加入新鲜培养液,24h时后,吸取 培养上清.2000r/min,离心20min,收集上清,即为嗅神经 鞘细胞条件培养液.将纯化培养第3代的骨髓基质干细胞 按l0,10/cm接种于24孔培养板.按以下分组:A组为 条件培养组,B组为空白对照组(DF12+15%FCS). 1.2.4诱导后细胞形态学观察 分别在培养48,72h在倒置相差显微镜下观察BMSCs胞 体和轴突的形态学变化. 1.2.5免疫组织化学双标记染色 培养72h后,分别吸去24孔板中A,B组中的培养 液,0.0lmoL/LPBS清洗3次,4%多聚甲醛固定30rain, 0.olmoL/LPBS清洗3min×3次,20%驴血清封闭,20min 后吸取余液,0.0lmoL/LPBS清洗1次,分别在A,B组中各 随机选择3个孔,在每一个孔内分别加入一抗MAP一2(1: 1000)和GFAP(1:1000),置入4?冰箱内过夜.次13, 0.0lmoL/LPBS清洗3次后,分别加入荧光二抗驴抗小鼠 FITC(1:400),驴抗兔DexasRed(1:800),室温下反应2 h,PBS清洗后加入10mg/LHoechst33342作用10min,用于 标记细胞核,清洗3次后甘油封片荧光显微镜下观察. 2结果 2.1BMSCs原代培养 BMSCs接种后48h开始贴壁伸展生长,细胞形态不一, 大多数呈梭形,可见细胞团落形成,初次换液后,细胞迅速 增殖生长,当细胞生长达到80%融合时,传代接种培养,通 过传代换液除去未贴壁细胞来纯化BMSCs.当传至第3代 时,BMSCs形态较一致,呈梭形生长,折光性较强(图1). 2.2OECs培养纯化 原代培养的OECs经过Nash差时贴壁和阿糖胞苷纯化培 养后,倒置相差显微镜下可见细胞生长状态良好,大多数细 胞为双极,呈梭形,细胞核多呈椭圆形位于中央,胞体透光 性好,轴突细长(图2). 2.3诱导后细胞形态学观察 BMSCs细胞经嗅神经鞘细胞条件培养液诱导后,随着诱 导时间的延长,倒置相差光学显微镜下观察,部分细胞开始 出现胞体略缩小,呈不规则形状,轴突数量增加,呈神经细 胞样,轴突细长,偶可见到轴突出芽过程,个别细胞轴突长 度甚至为胞体的数倍(图3). 2.4免疫组织化学双标记染色结果 由免疫组织化学双标记染色的细胞(图4)中,右侧A, B,C分别为不同荧光激发下下所采集到的MAP.2.GFAP和 Hoechst的图像,左侧D是A,B,c合成后的图像,在D中 分别可见到MAP.2,GFAP染色阳性细胞,随机选择5个视 野计算的MAP.2阳性细胞和GFAP阳性细胞的比率分别为 55%,23%. 3讨论 BMSCs是一种存在于骨髓基质造血微环境中的干细胞, 它具有较强的增值特性和较弱的免疫原性',在临床治疗过 程中,可以实现自身移植治疗且不涉及伦理道德问题,因此 BMSCs成为了细胞移植治疗脊髓损伤的理想细胞.但是BM— SCs直接移植来治疗脊髓损伤,其效果报道并不一致:目 前还没有找到BMSCs向神经样细胞诱导分化的稳定有效的方 法.当前研究发现嗅球是高等哺乳动物中枢神经系统中可以 保持再生的功能部位之一,研究表明采用OECs移植来治疗 脊髓损伤,可以部分的实现损伤轴突的再生.,一般考虑这 种作用是OECs通过分泌促进轴突再生的各种营养因子实现 的,这些因子主要包括脑源性神经营养因子(BDNF),神 经营养素一3和神经营养素-4/5(NT一3,NT-4/5)以及细胞 黏附因子(CAM)等.在实验中采用OECs的条件培养液与 BMSCs共培养,通过OECs所含的上述营养因子来诱导BM— SCs向神经样细胞分化,结果,在倒置显微镜下连续观察, 可以清楚地看到单个BMSCs细胞的轴突萌出和生长,与未诱 导的梭形细胞形成鲜明对比,免疫组织化学双标记染色,可 见MAP一2和GFAP均出现阳性结果:因此本实验为BMSCs向 神经样细胞诱导提供了一种新的方法,也为BMSCs诱导成为 神经样细胞后移植治疗脊髓损伤,提供了必要的理论依据: OECs条件培养液诱导BMSCs向神经样细胞分化是一个比较 复杂的过程,其具体的作用机制还需要进一步研究. (本文附图见加页4) 参考文献: [1]YaZhouW,JinHongM,HaoY,eta1.Differentiation—indu(ingand protectiveeffectsofadultratolfactmyensheathingcellconditionedn(e. diumonPC12cells[J].NeurosciLett,2003,346(1—2):9—12. [2]DanielP.DanaM,LynB.BoneH(alT()Wtrans1)lantsprmidetissue protectionanddirectionalguidam'efi)raxonsarielcontusi(espinal cordinjmyinrats[J].ExpNeuro,2004.190(1):17—31. [3]丁坦,罗卓荆,武肖娜.大鼠嗅鞘细胞无血清清液诱导脊髓神经干 细胞分化的研究[j].中国矫形外科杂志,2006,14(4):288—290. [4]AymanA,TakeshiK,KazumasaE,eta1.Morphologicaldifferentiation ofbonen(arrowstromalrPllsi『lloneuron—like('ellsaftercu.euhurewith hippocampalsliceJ].BrainRes,2004,1029(1):114—119. [5]曹谊林,刘伟,崔磊,等.组织工程学论与实践M]北京:科学 技术出版社,2004:12. [6]Lopez—ValesR,ForesJ,VerduE.eta1.Acuteauddelayedtrans— plantationofolfactmTensheathingcellspromotepartialrecovm)after completetransectionofthespinalcordJ].Neurobiolog)ofDisease. 2006,21(1):57—86. [7]RonaldD,GuidoCK,MarijkeL,eta1.Neuriteoutgrowthpromoting effectsofenrichedandmixedOEC/CN~,cultures[J:.NeurosciLett, 2006,397(1—2):20—24. (收稿:2o06-07.15) 1895 第J4卷第24期 2006年l2月 中国矫外科杂占VoIl4.No.24 目1单纯臀上动辟断拴塞同删断端臀下动脉髂腰动脉囤2髂疆动脉断裂 栓塞删腰动脉上动辟旋髂瀑动脉目3骶侧动脉断裂棘栓端外桂塞 对删骶91,侧动脉与骶正中动脉目4臀下动脉 塞臀上动脉阴部内动脉股动脉升支 加甄4 目1培养第3代的骨瞌基质干细胞,长榷形生*(10ox)bar=200 目2原代纯化培养第的嗅鞘胞呈极桎(200X)bar=t00m 固3经诱导5的雠^s.s轴赛细长 染色阳性细胞左下角的箭头所示为GFAP 染色性胞c200×)b00m