山莨菪碱、旋覆花素、苦碟子对过度训练致急性心肌损伤大鼠的影响

山莨菪碱、旋覆花素、苦碟子对过度训练致急性心肌损伤大鼠的影响 山莨菪碱、旋覆花素、苦碟子对过度训练致 急性心肌损伤大鼠的影响 主竖堂盘查至旦塑!鲞箜塑in』neesiol,January2007,Vo127,No.1 山莨菪碱,旋覆花素,苦碟子对过度训练 致急性心肌损伤大鼠的影响 容俊芳温进坤韩梅吴广礼黄旭东 【摘要】目的探讨山莨菪碱,旋覆花素,苦碟子对过度训练致急性心肌损伤大鼠的影响.方法 雄性Wistar大鼠8O只,体重200,220g,随机分为5组:正常对照组(C组,n=8),力竭对照组(E组, n:24),山莨菪碱组(A组,n:16),旋覆花素组(IB组,n:16),苦碟子组(Is组,n=l6).采用游泳致 力竭建立过度训练动物模型.A组于力竭前即刻腹腔注射山莨菪碱10ms/kg,IB组于力竭前24h和 力竭前即刻1:3腔灌人旋覆花素25ml/kg,IS组于力竭前即刻腹腔注射苦碟子20ml/kg.取标本大 鼠血清磷酸肌酸激酶(CK)及其同工酶(CK—MB)的活性,光镜观察心肌组织形态学,采用流式细胞术及 TUNEL法检测大鼠心肌细胞凋亡,并计算心肌细胞凋亡率.结果与C组比较,E组,A组,IB组和Is 组血清CK及CK—MB升高,心肌细胞凋亡率升高(P<0.05);与E组比较,A组,IB组及Is组大鼠血清 CK及CK—MB及心肌细胞凋亡率均降低(P<0.05).光镜下,E组的心肌细胞核深染,有固缩现象;而 A组,IB组及Is组的心肌心肌组织学变化均未见异常.结论山莨菪碱,旋覆花素,苦碟子预先给药 通过抑制心肌细胞的凋亡,可减轻过度训练致大鼠的心肌损伤. 【关键词】山莨菪碱;旋覆花;苦碟子;运动过度;心肌;细胞凋亡 Effectsof~amine,inulabritannicaandixerissonchifoliahanceontheovertraining.induced myocardialmJm'yinratsRONGJun-fang,WENfin-kun,HANMei,eta1.DepartmentofBiochemistryand MolecularBiology,HebeiMedical,/nity,Shijiazhuang050082,China 【Abstract】 ObjectiveToevaluatethee~ctsofanisodamine,inulabritannicaandixerissonchifolia hanceonthemyocardialinjuryinducedbyovertraininginrats.Me~odsEightymaleWistarratsweighing200— 220gwereusedinthisstudy.Overtrainingwasinducedbyexhaustingswimming.Exhaustionwasdefinedas:(1) theanimalsanktothebottom>10sduringswimming;(2)uncoordinatedswimmingand(3)theanimallost escape/rightingreflexwhenplacedonthetable.Theanimalswererandomlydividedinto5groups:groupCcontrol (/1:8);groupEexhaustion(n:24);groupAanisodamine(n:16);groupIBinulabritannica(n:16)and groupISixerissonchifoliahance(n=16).IngroupAandISanisodamine10mg'kgandixerissonchifolia hance20ml'kgwerevenintraperitoneallyimmediatelybeforeexhaustingswimmingrespectively.IngroupIB inulabritannica25ml'kg, wasgivenorally24handimmediatelybeforeswimming.Theanimalswerekilled immediately(T1)andat6hand24hafterexhaustionseparately.Theheartsandbloodwereobtainedfor determinationof(1)serumCKandCK-BMactivity;(2)apoptosisincardiomyocytes(TUNEL)andpercentageof apoptoticcardiomyocytes(flowc~ometry)and(3)microscopicexaminationofmyocardium.ResultsTheserum CKandCK— MBactivitiesandthepercentageofapoptoticcardiomyocytesweresignificantlyincreasedingroupE, A,IBandISascomparedwithgroupC(controlgroup)andweresignificantlyloweringroupA,IBandISthanin groupE.Microscopicexaminationshowedthatthenucleiofthecardiomyocyteswerecondensedanddeeplystained ingroupEwhiletheywerefairlynormalingroupA,IBandIS.ConclusionPretreatmentwit}lanisodamine, inulabritannicaandixerissonchifoliacanattenuateapoptosisincardiomyocytesinexhaustedanimalsandagainst myocardialinjuryinducedbyexhaustion. 【Keywords】 Anisodamine;InCajaponica;Ixerissonchifolia;Hyperkinesis;Myocardium; Apoptosis 作者单位:050082石家庄市,河北医科大学基础医学院生物化学和分子生物学研 究室[容俊芳(现在河北省人 民医院),温进坤,韩梅];白求恩国际和平医院肾脏病科(吴广礼,黄旭东) 79 ? 重症医学? 80主盎醛堂盘查生旦箜!鲞筮塑JAnesthesiol,Juary2007,Vol27,N..1 过度训练是由于运动训练负荷过大,超过了机 体的承受能力,导致多脏器功能紊乱的病理状态. 过度训练可引起心肌浊肿,线粒体肿胀,内质网扩 张,润盘损害,导致心肌损伤?j,目前临床尚缺乏有 效的防治方法.山莨菪碱对过度训练大鼠急性肾损 伤有明显预防作用",旋覆花素,苦碟子与山莨菪 碱同样,也具有活血化淤,改善循环的效应,有关其 对过度训练致心肌损伤的作用,有待进一步研究. 本研究拟探讨山莨菪碱,旋覆花素,苦碟子对过度训 练致大鼠心肌损伤的影响,为临床研究提供参考. 材料和方法 实验动物及分组雄性Wistar大鼠80只,体重 200,220g,由河北医科大学实验动物中心提供,动 物生产许可证号为:SCXK(冀)2003.1.003.随机分 为5组:正常对照组(C组,n=8),力竭对照组(E 组,n=24),山莨菪碱组(A组,n=16),旋覆花素组 (IB组,n=16),苦碟子组(Is组,n=16).C组未进 行力竭运动;A组于力竭前即刻腹腔注射山莨菪碱 (批号:0409202,杭州民生药业集团有限公司) 10mg/kg~进行力竭运动;IB组于力竭前24h和力 竭前即刻口腔灌入旋覆花素(河北医科大学药学院 药理研究室提供)25ml/kg后进行力竭运动;IS组于 力竭前即刻腹腔注射苦碟子(批号:20025~9,沈阳 双鼎制药有限公司)20ml/kg后进行力竭运动.根 据力竭后恢复时间,E组分别于力竭后即刻,6,24h, A组,IB组及IS组于力竭后6,24h取标本,各组大 鼠用乙醚麻醉,纵行剖开胸腹腔,先于下腔静脉取 血,摘取心脏,纵行剖开,一半置于4%多聚甲醛中 固定,另一半置于一80?冻存待用. 过度训练动物模型的制备按参考文献[7]的 方法,自制150cm×60cm×80cm玻璃钢游泳池. 采用大鼠游泳致力竭建立过度训练模型(安静环境 下,单次力竭不加负重,水深70cm,水温28,32oC). 力竭标准:?沉入水底超过10S;?游泳动作明显不 协调;?捞出后没有逃避反应,且放在平面上无法完 成翻正反射. 观察项目及方法应用7170全自动生化 仪(Hitachi公司,日本)检测各组大鼠血清磷酸肌酸 激酶(CK)及其同工酶(CK.MB)的变化;应用AHB.2. HL光学显微镜9(Olympus公司,日本)观察各组大 鼠心肌组织结构的改变;采用TUNEL法(试剂盒由 德国Boehfinger公司提供)检测各组大鼠心肌细胞 凋亡;应用CMIAS病理图像分析仪(北航图象中心 研制)测量凋亡细胞的平均光密度并计算心肌细胞 凋亡率.将固定的心肌组织放在120目不锈钢网 上,下置一平皿,用眼科剪刀将组织剪碎,用眼科镊 子轻揉组织并用生理盐水冲洗,至组织揉完为止. 将平皿中的混悬液用300目尼龙网过滤去除细胞团 块,收集细胞悬液,以500,800r/min离心沉淀2 min,取0.1ml,加入10%鸡血细胞作为内参标准,与 样品同步染色,加入碘化丙啶(PI)50ug/ml(Sigma公 司,美国)1ml,在4~C冰箱染色30min,以500目铜网 过滤,制成单细胞悬液,用Epics.XL?型流式细胞 仪(BeckmanCoulter公司,美国)进行流式荧光数据 分析,用MuticycleAV分析软件对DNA细胞周期拟 合分析得出细胞凋亡率. 统计学处理用SPSS12.0软件包进行统计学 分析,计量资料以均数?标准差(牙?S)表示,组间 比较采用单因素方差分析,P<0.05为差异有统计 学意义. 结果 血清CK及CK.MB的比较与c组比较,E组 力竭后即刻,力竭后6h血清CK及CK.MB水平升 高,力竭后24h恢复,A组,IB组及Is组力竭后6h 上述指标均升高;与E组比较,A组,IB组及IS组 力竭后6h上述指标均降低(P<0.05),见表1. 表1各组不同时点血清CK及CK—MB活性的比较 (n=8,牙?s) 指标组别力竭前即刻力竭后即刻力竭后6h力竭后24h CK(U/L)C组 E组 A组 IB组 IS组 552?2281269?174 598?204 700?184 624?135 256?44 309?172 248?76 289?180 CK-MB(U/L)C组369?42一一一 E组一607?2061446?274399?90 A组一一622?126398?166 IB组一一699?138404?141 IS组一一630?236376?107 与C组比较,P<O.05P<O.Ol与E组比较,P< O.O5 心肌组织形态学的比较E组力竭后即刻仅见 部分心肌纤维肿胀肥大,偶见心肌间血管及毛细血 管扩张,力竭后6,24h可见部分心肌细胞的细胞核 深染,有固缩现象;A组,IB组及IS组大鼠力竭后6, 24h心肌组织形态学均未见异常. 主醛堂苤查生旦笙鲞箜塑tnJAnesthesiol,Januart2007,Vol27,No.1 图1光镜下C组心肌细胞凋亡情况(TUNEL染色,×4OO) 图2光镜下E组力竭后即刻心肌细胞凋亡情况 (TUNEL染色,×4oo) 图3光镜FE组力竭后6h心肌细胞凋亡情况 (TUNEL染色,×4oo) TUNEL法原位检测心肌细胞凋亡的比较C组 心肌组织未见明显的凋亡细胞;E组力竭后即刻心 肌组织凋亡细胞数增多,力竭后6h心肌细胞凋亡 数增多更加明显,力竭后24h心肌组织凋亡细胞数 略有减少;A组,IB组及IS组力竭后6,24h心肌组 8l 图4光镜下E组力竭后24h心肌细胞凋亡情况 (TUNEL染色,×4OO) 图5光镜下A组心肌细胞凋亡情况(TUNEL染色,×4O0) 图6光镜FIB组心肌细胞凋亡情况(TUNEL染色,×4oo) 织凋亡细胞数与E组比较明显减少,见图1,7. TUNEL法原位检测心肌细胞凋亡率的变化 与C组比较,E组力竭后即刻,6,24h心肌细胞凋亡 率均升高,A组,IB组及Is组力竭后6,24h心肌细 胞凋亡率升高(P<0.05);与E组比较,A组,IB组 及Is组力竭后6,24h心肌细胞凋亡率降低(P< 82主堡醛堂盘查!生旦星!鲞蔓塑inthesiol,January2007,Vol27,No.1 图7光镜FIS组心肌细胞凋亡情况(TUNEL染色,×400) 0.05),见表2. 流式细胞术检测心肌细胞凋亡率的比较与c 组比较,E组力竭后即刻,6,24h心肌细胞凋亡率均 升高,A组,IB组及IS组力竭后6,24h心肌细胞凋 亡率升高(P<0.05);与E组比较,A组,IB组力竭 后6,24h及IS组力竭后6h心肌细胞凋亡率降低 (P<0.05),见表2. 表2各组不同时点心肌细胞凋亡率的比较(n=8,牙?s) 与C组比较,P<0.05与E组比较,P<0.05与IS组 比较.P<0.05 讨论 血清CK及其同工酶(CK.MB)活性是诊断心肌 损伤的特异性指标,因此本研究采用以上指标检测 大鼠游泳致力竭时心肌损伤的情况. 从定性和定量两个方面检测心肌细胞凋亡,有 助于保证检测结果的特异性和敏感性.因此本研究 采用2种不同方法检测了力竭后大鼠心肌细胞凋亡 的变化.TUNEL法是利用凋亡细胞在核酸内切酶 的作用下,DNA断裂产生粘性末端的原理,用外源 修饰化的核苷酸对这些断裂的DNA3末端用原位 切口平移法或原位末端标记法进行标记,再用免疫 学的方法对凋亡细胞进行定量,定位测定,进一步应 用图像分析仪进行定量分析证实本研究结果.流式 细胞术是根据凋亡时细胞核的特征性,用染色体荧 光染料对经固定的凋亡细胞进行染色,利用凋亡细 胞DNA可染性降低的特性,通过流式细胞分析结合 凋亡细胞DNA倍体分析软件,即可得出凋亡细胞发 生率.本研究在原位检测心肌细胞凋亡的基础 上,采用流式细胞术对力竭后大鼠心肌组织细胞凋 亡进行了定量检测,其结果与TUNEL法一致.本研 究结果提示,大鼠力竭引起的心肌损伤与心肌细胞 凋亡有关.由于心肌血供丰富,力竭恢复期随着缺 血的改善,心肌细胞凋亡数减少,心肌损伤逐渐恢 复.研究表明,过度训练大鼠心肌细胞中Bc1.2蛋白 表达下降,Fas蛋白表达增强,心肌组织和血清SOD 活性下降,MDA水平增加,这可能是过度训练致 大鼠心肌细胞凋亡的机制之一,提示心肌细胞凋亡 在过度训练致心肌损伤中发挥重要作用,与本研究 结果一致. 山莨菪碱,旋覆花素,苦碟子具有活血化瘀,改 善循环功效,本研究根据文献[6,l0,11]及预实验的 剂量和给药途径观察了上述3种药物对过度训练致 大鼠心肌损伤的影响. 山莨菪碱是从茄科类植物山莨菪中提取的一种 生物碱,是一种M胆碱受体的拮抗剂,临床上常用 于改善微循环和抗休克.本研究结果表明,山莨菪 碱可降低力竭后大鼠血清CK及CK.MB活性,减少 力竭后心肌细胞凋亡.说明山茛菪碱对过度训练致 心肌损伤有明显的预防作用,其机制为:降低血浆粘 度及红细胞聚集程度,从而改善了心肌的血液灌 流n;山莨菪碱可直接增加心肌细胞对缺氧的耐受 性,对缺氧心肌细胞的膜电位有稳定作用;通过 增加内源性SOD活性,抑制氧自由基释放,减轻心 肌超微结构损伤[1;提高血液中前列环素的浓度, 提高前列环素与血栓素比值,有助于心肌组织血流 的恢复…. 旋覆花属植物中主要的化学成分为萜类化合 物,黄酮类化合物及有机酸类化合物等.研究表明, 旋覆花素的有效成分二氢棉菊素可阻止NF.xB的核 易位,抑制NF.B活性,在抗炎信号转导途径中发挥 重要作用n.本研究结果表明旋覆花素可通过减 少心肌组织细胞的凋亡,减轻了过度训练大鼠心肌 组织的损伤,其机制有待进一步研究. ?盎壁堂盘查生旦整!鲞整!塑!sio1,January2007,V.127,N..1 苦碟子注射液是提取苦碟子全草有效成分精制 而成的中药注射剂,经生药学及分子药理学实验证 明其主要成分为腺苷,黄酮,有机酸,香豆素内脂,氨 基酸类物质.本研究结果表明过度训练大鼠预先应 用苦碟子注射液,减少了力竭后6h及24h心肌细 胞凋亡,减轻了心肌损伤,产生一定的预防心肌损伤 的作用.其作用机制可能与清除氧自由基或抑制氧 自由基产生,稳定心肌细胞膜,在一定程度提高了心 肌组织的耐缺氧能力?;通过降低血液粘度,红细 胞聚集指数及血管内皮素水平改善心肌微循环?. 综上所述,山莨菪碱,旋覆花素,苦碟子预先给 药可减轻过度训练致力竭大鼠心肌病理损伤,减少 力竭大鼠心肌细胞凋亡,对过度训练致心肌损伤起 到明显的预防作用. 参考文献 1TomeiLD,UmanskySR.Apoptosisandtheheart.AnnNYAcadSci, 2001,946:160—168. 2KangYJ,LiY,SunY,eta1.Antiapopototiceffectandinhibitionof ischemiareperfusion—inducedmyocardialinjuryinmetallothiontin— overexpressingtransgenicmice.AmJPathol,2003,163:1579-1586. 3袁海平,史仍飞,刘学,等.补充银杏制剂对过度训练大鼠心肌细 胞凋亡的影响.中国运动医学杂志,2004,23:503.506. 4常芸,袁箭峰,祁永梅,等.运动心脏重塑与微损伤发生中的细胞 凋亡现象.中国运动医学杂志,2003,22:344.349. 5金其贯,邓荣华,李宁川I,等.过度训练对大鼠心肌细胞凋亡的影 83 响.中国运动医学杂志,2OOO,19:356.359. 6步斌,张希彬,肖帮良等.过度训练对心肌影响的病理和酶组织 化学研究一心肌损害的特点.成都体育学院,1998,24(4):82. 86. 7吴广礼,温进坤,韩梅等.山莨菪碱对过度训练大鼠急性肾损伤 的保护作用.中国微循环,2006.10:241.244. 8胡庆柳,丁振华.流式细胞术在细胞凋亡研究中的应用.细胞生 物学杂志,1997,19:119.123. 9CarraroV,FranceschiC.Apoptosisofskeletalandcardiacmusclesand physicalexercise.AgingMilano,1997,9(1—2):19—34. 10吴广礼,田牛.三种莨菪药对急性肾衰大鼠血流变性改变的影 响.微循环技术杂志,1997,5:66.68. 11吴广礼,容俊芳,田牛.三种莨菪药对急性肾衰大鼠血栓索及前 列环素代谢的影响.中国微循环杂志,1998,2:31-34. 12刘耀春.山莨菪碱对正常和缺氧心室肌跨膜电位的影响.中国 病理生理杂志,1992,8:572. 13秦卫军,姚秀娟,孙向东,等.山莨菪碱对烫伤大鼠心室肌的保 护作用.中国药理学与毒理学杂志,1996,10:73.74. 14WhanHanJ,ConLeeB,KeeKimY.Ergolidesesquiterpeaelaetone fromInulaBritannica,inhibitsinduciblenitricoxidesynthaseandcyclo- oxygenase-2expressioninRAW264.7maelophagesthroughthe inactivationofNF—KB.BrJPha/-lnacol,2001,133:503.512. 15王彩霞,李彦辉,刘玉兰,等.注射用苦碟子对大鼠急性心肌缺 血的保护作用.河北医科大学,2006,27:40.42. 16卫蓉,张雅丽,齐敏友,等.苦碟子注射液对血淤症动物模型血 液流变学及血管内皮素的影响.贵阳中医学院,2002,24:57. 58. (收稿日期:2006.01.05) (本文编辑:彭云水) 《麻醉与镇痛》中文版征订 ? 肖息? (Anesthesia&Analgesia}是国际麻醉研究学会(IARS)的官方杂志,是国际上享有盛誉的麻醉学专业杂志.《麻醉与镇痛》是 该杂志的中文版,为IARS授权,由中华人民共和国卫生部主管,中国医学科学院中国协和医科大学主办,北京协和医院麻醉 科中国协和医科大学出版社承办,国家新闻出版总署批准正式发行的国家级专业学术刊物(刊号:ISSN1673—3134;CN11-5377/ R,双月刊). 该杂志编委会由两岸三地知名的麻醉学专家共同组成,精选((Anesthesia&Analgesia}中的最新文章,内容涉及当今麻醉与 镇痛专业领域,实用性强,力求紧随国际麻醉学科最新发展动态,为国内广大专业人士提供一个了解世界麻醉学发展的渠道 和窗口. 订阅办法:每本杂志售价1O.00元(人民币),每年6期定价6o.00元(邮费6元).请通过邮局汇款至:北京市东城区东单 北大街69号协和明日大厦810室,联系人:沈家欢,邮编:100005,单位:中国协和医科大学出版社期刊中心,电话:010. 65123928—60913439128204E-mail:bubing2008@yahoo.COB.cn. 请注明姓名,单位及科室,征订数量(本)及联系方式和电话.