2010CB529400-肿瘤干细胞在恶性肿瘤发生发展中的作用及机理研究

2010CB529400-肿瘤干细胞在恶性肿瘤发生发展中的作用及机理研究 项目名称: 肿瘤干细胞在恶性肿瘤发生发展中的作 用及机理研究 首席科学家: 卞修武 中国人民解放军第三军医大学 起止年限: 2010年1月-2014年8月 依托部门: 重庆市科委 一、研究内容 本项目拟开展以下三个部分内容的研究: 第一部分 CSCs在肿瘤发生中的作用及侵袭转移相关分子的筛查 本部分以胶质瘤、肺癌、肝癌等肿瘤为研究对象～重点是研究CSCs产生及其与正常干细胞的生物学行为和遗传学特性的差异～并比较研究高侵袭性CSCs,iCSCs,与低/非侵袭CSCs,non-invasive CSCs, niCSCs,的生物学特性、特征性标志物以及与侵袭和转移相关的预警分子筛查～以动物肿瘤模型进行、以人体样本进行临床验证。具体内容包括: 1. 研究CSCs的新扩增和培养体系～利用正常,成体干,细胞、肿瘤细胞系、人体肿瘤组织、动物肿瘤模型～重点研究CSCs的起源、生物学特性、可塑性及相关分子表达规律～重点探讨iCSCs在肿瘤发生中的作用和机理。 2. 研究CSCs组学特征～筛查CSCs新标志物,基因、蛋白质、miRNA等,,以高发现场病例和大样本胶质瘤临床病例为材料开展临床研究～探讨iCSCs标志物的临床意义。 3. 在课题组既往研究发现的基础上～以CSCs为材料～开展肿瘤相关新基因,CUEDC2,功能、已知基因COX4和XPC新功能方面的研究～探讨CSCs侵袭和生长的调控机理。 第二部分 CSCs与肿瘤微环境相互影响及其在肿瘤演进中的作用和机理 肿瘤演进依赖瘤细胞表型转化、侵袭性、运动、肿瘤微环境、脉管新生和免疫耐受与逃逸等事件～所以本部分拟研究CSCs与肿瘤微环境、脉管生成,血管生成、血管形成、淋巴管生成,和免疫细胞的相互作用及调控分子～研究CSCs尤其是其中iCSCs在肿瘤演进中的作用及其机理。 1. 比较研究iCSCs和niCSCs发生EMT和MET的规律和相关分子变化～探讨iCSCs表型转化在肿瘤演进中的作用及其调控机制。 2. 研究CSCs对内皮祖细胞、血管/淋巴管内皮细胞的影响及其在脉管新生中作用与分子机理～进一步探讨iCSCs在肿瘤微血管构筑表型异质性,T-MAPH,发生中的作用。 3. 获取和鉴定CSCs在不同分化阶段的肿瘤抗原特征～研究iCSCs的免疫原性,研究CSCs与免疫细胞的相互作用～阐明iCSCs参与肿瘤免疫耐受和免疫逃逸形成的分子机理。 4. 利用临床不同分期肿瘤样本～研究上述CSCs与肿瘤微环境事件的临床意义。 第三部分 以iCSCs和脉管新生为靶标的肿瘤治疗新方法研究 本部分将基于上述研究结果～针对iCSCs和脉管新生研究抑制肿瘤侵袭和转移的新策略。 1. 研制出针对iCSCs的人源化单克隆抗体～为建立和纯化iCSCs技术平台以及研发基于iCSCs早诊、早治措施奠定基础。 2. 结合项目组前期有关肿瘤病毒-基因治疗的工作为基础～研究细胞因子诱导杀伤细胞,cytokine-induced killer cells, CIK,介导溶瘤腺病毒靶向iCSCs的治疗效应及其作用机理～为肿瘤治疗提出一条新思路。 3. 人工合成、筛选抑制iCSCs侵袭和脉管新生的小分子化合物～研究对恶性肿瘤发生发展的治疗效应及其机理～为创建针对iCSCs的早期治疗新策略奠定基础。 二、预期目标 ,一,本项目的总体研究目标 针对肿瘤研究领域重大理论问题和社会需求～利用我国肿瘤高发现场和临床病例资源以及本项目组工作基础～以CSCs为切入点～在建立一系列CSCs研究技术平台的基础上～阐明CSCs,尤其是iCSCs,在恶性肿瘤发生发展,以早期侵袭和转移潜能为主,中的作用及其机理这一关键问题～并筛查iCSCs分子标志物和治疗新靶点～为针对CSCs和脉管生成抑制侵袭与转移的肿瘤治疗奠定基础,图1,。通过本研究～加强我国在CSCs和脉管生成研究方面的平台条件和人才团队建设～力争使我国在CSCs生物学和脉管生成研究领域取得重大突破～并促进我国在重大疾病研究领域的合作与国际竞争力～推动我国肿瘤学等相关学科的发展。 图1 本项目的总体研究思路与目标示意图 采用,支气管、肺和脑,干细胞转化模型、,肺,癌前病变、早期,肺,癌、,肺癌,转移和,胶质瘤,复发标本，通过建立和改进CSCs分选及培养技术平台，研究CSCs来源、特性及其在肿瘤发生发展中的作用和机理,通过研究CSCs与微环境、免疫细胞作用和促血管生成作用研究肿瘤演进尤其是侵袭、复发和转移，实现机理认识,通过侵袭和转移潜能标志物和治疗靶标的探寻，确立诊断和治疗新策略，最终实现项目总体目标，满足国家需求。 ,二,五年预期目标 1. 建立和完善CSCs研究相关技术平台:通过研究～建立成体干,前体,细胞异常分化,转化,癌变模型～完善CSCs分选及培养技术平台～并建立CSCs三维扩增培养新体系,建立具有功能性人体免疫系统的小鼠移植瘤模型和CSCs与免疫系统相互作用的体内和体外研究模型,建立靶向CSCs和脉管新生治疗模型。这些研究模型和技术平台将为进一步研究CSCs在脉管生成和肿瘤发生发展中的作用奠定基础、提供材料和方法。 2. 阐明CSCs相关几个肿瘤学关键理论问题:通过研究～阐明CSCs的来源、可塑性和异质性等目前了解比较粗浅的基本肿瘤生物学问题～筛查特异性标记物～从而以崭新的角度阐述肿瘤发生和侵袭转移的分子机制,分别就CSCs与细胞外基质和间充质干细胞相互作用、CSCs表型转化、内皮细胞表型相关性组学特征以及肿瘤微血管构筑表型,T-MAP,异质性的发生机制～阐明肿瘤血管生成发生机制及其在肿瘤发生发展中作用机理,证明CSCs与免疫细胞相互作用及其机制～率先获取和鉴定CSCs在不同分化阶段的肿瘤抗原特征～而且可望证明免疫系统与CSCs相互作用中的免疫编辑在免疫逃逸中的作用机制～丰富肿瘤免疫学理论并开拓分子免疫学研究新领域～拓展肿瘤免疫治疗的思路与途径。 3. 探寻一系列肿瘤诊断和治疗新方法:通过研究～筛选出肿瘤发生、侵袭和转移相关的组织、血清和iCSCs蛋白质标志物及表观遗传学标志～建立诊断新方法并验证应用价值,阐明前期工作中发现的新基因CUEDC2的肿瘤生物学功能和临床意义,探索出针对iCSCs和脉管新生的相对特异性的分子靶标～并建立相应的抑制肿瘤发生、侵袭和转移治疗的新策略、新方法。 4. 形成一批创新性研究成果:在相关领域的国际杂志上发表论文80-100篇～申报获得授权发明专利8~10件。 5. 促进人才建设和学科发展:建立5~6个CSCs与血管生成研究中心～预期培养出教育部“长江学者奖励计划”特聘教授2~3名～国家杰出青年科学基金获得者3~5名～培养博士后30~40名～博士生80~100名～硕士生150~180名。 三、研究 (一)总体思路 学术思路和技术途径 本项目的主要科学假设是:癌前病变和早期肿瘤中CSCs生物学特性尤其是CSCs的侵袭和转移潜能及触发脉管生成作用决定了恶性肿瘤演进、复发和转移～其中iCSCs的分子标志物在早期诊断和早期治疗上具有重要意义。 本项目提出～异质性CSCs群体中高侵袭力的iCSCs具有独特的生物学行为和分子遗传学特征～不仅是肿瘤发生的种子～而且是复发和转移的根源,其作用还涉及分化性瘤细胞的异质性和脉管生成的异质性～三者形成广义上的“肿瘤异质性”,tumor heterogeneity,～导致肿瘤对治疗反应的差异性～即影响疗效与预后～而脉管生成异质性等微环境因素又反过来影响CSCs的生物学特性及其可塑性。 本项目以肿瘤干细胞,CSCs,为主线～围绕“CSCs始动和参与恶性肿瘤侵袭和转移的分子机理及其早期诊治意义”这一关键问题开展研究,总体研究方案和技术路线见图2,。本项目首先在已有工作,分离、纯化和鉴定CSCs技术和体内模型以及血管生成模型,基础上～建立一个相对完善的CSCs研究新技术平台,含技术与模型,～并将该技术平台应用于CSCs的来源和特性、脉管生成机制以及与免疫细胞相互作用的研究中去～从研究结果探索肿瘤诊断和治疗新策略和新方法～为进一步研发具有自主知识产权的诊治方法和产品奠定理论和技术基础。 具体地说～本项目应用我国肺癌,转移率高,高发现场和恶性胶质瘤,侵袭性强、复发率高,临床病例资源～针对CSCs来源未明、详细的生物学特性尚待阐明以及分选、纯化和培养上的技术难题～建立CSCs分离和培养新方法～研究CSCs的来源、生物学特性与可塑性～探寻iCSCs新的分子标志物并研究其临床意义,针对CSCs始动和参与肿瘤发生、侵袭和转移的作用和机制未明～研究CSCs归巢特性、表型转化、细胞迁移、原发瘤与靶器官微环境变化以及治疗抵抗等事件～阐明CSCs生物学行为的相关机制,针对CSCs免疫原性及其与免疫细胞之间相互作用研究相对缺乏～研究CSCs与细胞外基质成分、间充质干细胞、脉管生成和免疫细胞的相互作用及其分子调控～阐明CSCs在脉管生成异质性、侵袭和转移潜能形成中的作用机制～力求获取和鉴定CSCs在不同分化阶段的肿瘤抗原特征～证明免疫系统与CSCs相互作用中的免疫编辑在免疫逃逸中的作用机制, 针对CSCs作为诊治新策略的可行性问题～以上述研究成果为基础～以iCSCs特异性分子为靶标～研究iCSCs检测和抑制iCSCs始动肿瘤发生发展的新方法～为癌症早诊和早治提供新思路和新策略,针对脉管,血管为主,新生的异质性和抗血管生成生成治疗差异性问题～研究相关机制～提高疗效～并形成新理论和指标～为指导肿瘤个体化治疗提供依据。 图2 本项目总体研究方案和技术路线示意图 可行性 ,1,CSCs研究进展和组学技术的进步为我们寻求与CSCs生物学特性密切相关的标记物、研究CSCs在肿瘤发生发展中的作用及其机理奠定了基础。 CSCs的存在和基本特性已被证实～分离、鉴定方法虽然繁琐～但已比较成熟～本项目组在肺组织干细胞、神经干细胞和CSCs研究方面已有良好的工作基础。本项目组已经初步获得CSCs一些新的标志物并以此建立准确获取高纯度CSCs的新技术方法的能力和条件～除建立了CSCs分选、富集、干细胞二维培养技术外～还初步建立了结合了生长因子的胶原蛋白三维支架培养 CSCs新体系。前期研究已经获得的研究结果为本项目的开展和形成突破创造了条件。 ,2,CSCs的基因表达谱和miRNA表达谱已有个别文献报道～本项目业已开展初步研究并获得结果～进一步研究并筛选出CSCs侵袭和转移相关的miRNA和其它遗传特征是可行的～以此为诊治靶点在理论上也是可行的。本项目可望获得iCSCs是肿瘤发生、侵袭和转移的根源,“种子”,的直接证据～寻找出iCSCs获得侵袭和转移潜能的早期标志物以及与CSCs分化阶段相关的时序谱系～并阐明iCSCs参与调控侵袭、转移的具体环节与机制。 ,3,血管生成、淋巴管生成的一些研究进展表明它们是转移的前提条件～有关分子调控和治疗研究是本项目组长期的科研方向。本项目不仅将阐明CSCs生物学特性尤其是可塑性、异质性产生规律～而且还将进一步探明肿瘤细胞异质性和脉管生成异质性的形成机制～为指导肿瘤个体化治疗提供新理论和新指标～可望在此领域获得突破。 ,4,CSCs与免疫细胞的相互作用虽然报道极少～但肿瘤内CSCs和免疫细胞的存在是不争的事实～实现此方面的创新发现更是可能的、可行的。本项目不仅可以获取和鉴定CSCs在不同分化阶段的肿瘤抗原特征～而且可望证明免疫系统与CSCs相互作用中的免疫编辑在免疫逃逸中的作用机制～丰富肿瘤免疫学理论并开拓CSCs相关分子免疫学新领域～并拓展肿瘤免疫治疗的思路与途径。 ,5,项目首席科学家和各课题组长及主要骨干目前的研究方向均与本项目研究内容一致～工作基础良好～相互间有良好的合作关系。项目主要承担单位长期从事胶质瘤和肺癌发生、侵袭、复发和转移机理研究以及临床诊治工作～拥有肺癌高发现场,天津大港油田和四川科学城等,、大量肺癌和胶质瘤临床病例与生物样本库,天津医科大学、第三军医大学、首都医科大学附属北京天坛医院和苏州大学等,～已有多种肿瘤细胞系～因此～在研究材料上有保证。本项目所涉及的系列分子生物学技术均是成熟技术～并已掌握～且各课题承担单位具有先进的实验室和配套设备为支撑。 (二)创新点与特色 1. CSCs是肿瘤研究领域的最新前沿～从标志物筛选、细胞分选到培养技术～从基本生物学特性、启动肿瘤发生、侵袭转移机制到检测和治疗意义～都还存在诸多科学问题亟待解决。本项目基于最新前沿已被广泛接受的研究成果～以CSCs 为切入点～以CSCs侵袭性和促血管生成作用的前期创新发现为基础～围绕CSCs的起源、表型转换、始动脉管生成以及与免疫细胞相互作用等尚未解决的重大理论问题开展研究～从新的角度揭示肿瘤发生发展的分子机理～并针对CSCs开辟早期诊治肿瘤的新途径～在研究思路和研究内容上具有创新性。 2. 近年在肿瘤研究领域已有较多CSCs生物学特性方面的研究～但CSCs促血管生成作用及其机理是本项目组最先发现和报道的～CSCs与肿瘤微血管构筑表型异质性,T-MAPH,的关系也是我们最先观测和研究证明的～本项目组还创建了多种CSCs分离方法,结果已发表在Nature, Cancer Res, Cancer Cell, J Pathol等国际知名期刊,。这些创新性工作基础使得本项目的上述新思路、新内容的实施 +highlow具有特色优势。本项目还基于我们率先获得高侵袭性CD133/CXCR4/Cx43表型iCSCs亚群、发现细胞间隙连接通讯蛋白表达异常,如Cx43低表达,并参与iGSCs侵袭的事实～首次明确提出“侵袭性肿瘤干细胞”,iCSCs,的概念～并以iGSCs为重点研究对象～研究iCSCs在早期肿瘤发生发展中的作用及其机理～研究内容未见报道～可望取得创新性成果。 (三)课题设置 课题1、CSCs启动恶性肿瘤发生的作用及机理研究 预期目标: 本课题重点研究恶性肿瘤发生过程中CSCs的产生和机制～比较CSCs与正常,成体,干细胞的基本生物学特性、可塑性、特异性标志物～探讨CSCs的起源,建立用于快速获取、扩增和分析CSCs的新方法、新技术。 研究内容: 1. 进一步改良CSCs分选的方法～以人体原发性、复发性和,或,转移性肿瘤标本,胶质瘤和肺癌等,及肿瘤细胞系为材料～建立CSCs体外扩增新方法和三维培养体系。 2. 利用体外正常,成体,干细胞诱导恶性转化、癌前病变干细胞以及细胞系移植瘤模型中分离的CSCs～研究其起源、增殖、分化以及在恶性肿瘤发生中的作用。 3. 研究CSCs的分化可塑性及其分子机制,分选获得iCSCs和niCSCs～比较研究 iCSCs、niCSCs与正常,成体,干细胞的生物学特性。 4. 研究肿瘤相关新基因,CUEDC2,功能、已知基因SOX4和XPC新功能在CSCs增殖、分化及在肿瘤发生中的作用及机制。 经费比例:16% 承担单位:南方医科大学、香港大学 课题负责人:姚开泰 学术骨干:林李家宓、刘求真、肖广惠 课题2、CSCs始动肿瘤侵袭及其在复发和转移中的作用与机理研究 预期目标: 本课题重点研究CSCs,尤其是iCSCs,与肿瘤演进中的微环境相互作用～获取CSCs通过EMT、MET表型转化参与侵袭和转移的直接证据～探讨CSCs在肿瘤演进中始动肿瘤侵袭、复发和转移的作用及其机理～为探索以CSCs为靶标的抑制转移新措施提供依据。 研究内容: 1. 观测早期癌、原发灶和转移灶EMT与MET现象以及相关分子表达和分布及其与CSCs的关系～分选获得iCSCs和niCSCs～比较研究二者发生EMT和MET的规律和相关分子变化,探讨iCSCs表型转化在肿瘤演进中的作用及调控机制。 2. 体外试验观测CSCs与骨髓源性间充质干细胞,MSC,的相互作用,观测CSCs归巢特性及其与细胞外基质、微血管niche的关系及其对治疗的反应,研究肿瘤演进、复发、转移中,胶质瘤和肺癌等恶性肿瘤的原发瘤和复发瘤/转移瘤,的CSCs分布、数量、免疫表型与细胞外基质成分、间质细胞,包括间充质干细胞、内皮细胞和内皮祖细胞,的关系～探讨CSCs与微环境相互影响及其在侵袭和转移中的作用和机理。 3. 研究细胞间隙连接通讯异常及其对CSCs肿瘤生长和转移等生物学行为的影响～并利用人体样本进行验证。 经费比例:12.35% 承担单位:北京大学、中国人民解放军第三军医大学 课题负责人:方伟岗 学术骨干:陈志文、郭乔楠、刘泽军、张志谦、周向东 课题3、CSCs在脉管生成中的作用及分子调控研究 预期目标: 通过本课题研究～在进一步证明CSCs在肿瘤血管新生化中的直接,通过转分化为内皮、内皮样或其它血管生成相关细胞或间接,趋化内皮祖细胞、内皮细胞、分泌血管生成因子等,作用的基础上～阐明CSCs在肿瘤脉管生成中的作用、在T-MAP异质性形成的作用、机理和意义～为以CSCs触发的异质性血管为靶标的肿瘤治疗新策略奠定基础。 研究内容: 1. 利用体内、体外诱导分化模型探索CSCs转分化产生内皮,样,细胞或血管生成细胞的可能性与机制,研究CSCs分化不同阶段参与血管拟态,vasculogenic mimicry～VM,的可能性和机制,观测CSCs的内皮细胞表型相关性标志特征。 2. 应用多重标记、三维重建观测CSCs与血管、淋巴管分布和密度的关系～并检测人体肿瘤、动物肿瘤脉管生成调控相关因子的表达与分布～揭示CSCs在肿瘤微血管构筑表型,T-MAP,异质性的关系和临床病理学意义。 3. 观测二维和三维共培养体系中CSCs旁分泌因子分别对微血管和微淋巴管内皮细胞以及骨髓源性内皮祖细胞迁移、趋化、增殖、分化和管型形成能力的影响及机理,研究导向分子Sema3/Nrp/Plexin受体复合物形成对肿瘤淋巴管内皮细胞芽生的调控机制、Sema3抑制肿瘤淋巴管生成的效应机制。 4. 观测T-MAP特征及其对恶性肿瘤侵袭、转移和治疗反应的影响,检测T-MAP相关的蛋白质组表达谱及鉴定主要差异蛋白质。 经费比例:27.30% 承担单位:中国人民解放军第三军医大学、中国科学院遗传与发育生物学研究所 课题负责人:卞修武 学术骨干:鲍仕登、陈冰、黄缄、平轶芳、余时沧 课题4、CSCs与免疫细胞相互作用及机理研究 预期目标: 通过本课题研究～鉴定CSCs表达的CTL可识别抗原～弄清CSCs分化和表型转化过程中的免疫编辑及其在肿瘤免疫逃逸形成中的作用,阐明CSCs不同分化阶段分泌的因子、表达的趋化因子受体在侵袭和转移中的作用～探讨CSCs与免疫细胞相互作用及其机制～从免疫学角度阐明恶性肿瘤侵袭和转移机制～为建立抗转移新策略提供依据。 研究内容: 1. 在建立功能性人体免疫系统的人源化动物模型的基础上～进一步建立人源 化小鼠和免疫缺陷小鼠的荷瘤模型～检测CSCs成瘤情况和分化情况以及不同类型免疫细胞在肿瘤中的浸润情况～检测移植瘤中CSCs的抗原加工呈递相关分子以及IFNγ信号相关分子, 2(研究CSCs中CUDEC2基因的表达及其在肿瘤免疫编辑中的作用与机制～并研究CSCs表面特征性分子和分泌分子与免疫细胞的相互作用。 3. 研究常见化学趋化因子,重点是IL-8～IL-12～CXCL2,及其受体介导肿瘤组织免疫细胞与CSCs相互作用～检测相关下游相关分子。 4. 利用临床不同分期肿瘤样本～研究上述CSCs与免疫细胞关系的临床意义。 经费比例:12.35% 承担单位:中国人民解放军第三军医大学、中国人民解放军军事医学科学院 课题负责人:李爱玲 学术骨干:宫锋、黄君健、吕双红、牟志蓉、朱波 课题5、iCSCs侵袭和转移相关预警分子筛查及诊断意义研究 预期目标: 通过本课题研究～寻找出iCSCs源性侵袭和转移相关标志物和组学特征～建立与肿瘤侵袭和转移相关的组学数据库～筛选出可用于预测肿瘤侵袭和转移潜能的早期分子标志物～构建诊断肿瘤早期转移的生物芯片。 研究内容: 1. 筛选和建立具有不同侵袭潜能,胶质瘤,、不同转移潜能和不同组织器官特异性转移的肿瘤细胞株与转移模型,肺癌,～参照课题一内容～研究iCSCs亚群生物学特性～筛选鉴定侵袭、转移相关差异表达蛋白、信号传导调节途径～探寻出iCSCs亚群生物标志物谱。 2.分析具有不同转移特性肺癌的组织和血清蛋白组学的差异～进一步筛选鉴定与肿瘤发生发展和转移相关的特定蛋白～与iCSCs组学特征比较～并进行临床病例验证、随访。 3. iCSCs源性侵袭和转移相关miRNA和表观遗传学改变及其早期诊断意义:研究iCSCs亚群miRNA谱、基因组甲基化模式等表观遗传学特征～建立规范化的肿瘤诊治队列和样本采集～进行动物模型和人体材料的验证。 4. 研究和开发早期诊断和预测肿瘤转移的生物芯片:根据以上结果～建立 与恶性肿瘤侵袭和转移相关的组学数据库～构建诊断肿瘤早期转移的生物芯片～临床验证生物芯片的应用价值,早期肺癌、肺癌转移、肺癌高危人群、正常人群各500例,。 经费比例:15% 承担单位:首都医科大学、天津医科大学 课题负责人:周清华 学术骨干:陈军、孙保存、应国光、于士柱、钟殿胜 课题6、iCSCs和脉管生成为靶标的肿瘤治疗新方法研究 预期目标: 通过本部分研究～探讨能否和如何针对CSCs及其相关的脉管异质性进行肿瘤治疗～以及其中侵袭和转移潜能的变化～为靶向iCSCs治疗策略奠定基础,研究细胞因子诱导杀伤细胞,CIK,介导溶瘤腺病毒靶向CSCs的治疗效应及其作用机制; 研究开发出几种肿瘤治疗新物质新方法～为进一步应用于临床奠定基础。 研究内容: 1. 制备10~20种针对CSCs重要信号分子或表面标志的特异人源化单克隆抗体～并试用于和组织CSCs分布的检测以及CSCs筛选与鉴定。 2. 人工合成几种具有自主知识产权和应用前景的小分子化合物抑制iCSCs和脉管新生。 3. 选择上述抗体中抑制信号转导通路或抑制iCSCs侵袭的抗体以及小分子化合物～进行体内和体外抗iCSCs及其移植瘤实验～并开发出具有阻断关键信号通路的拮抗剂～观测疗效及其与iCSCs的关系～测定个体化差异。 4. 构建出既能感染CIK细胞又能感染iCSCs的融瘤腺病毒载体～研究它们感染CIK细胞的作用机理～提出病毒装载及释放模型～评估CIK细胞装载溶瘤腺病毒基因治疗载体后对肿瘤细胞的杀伤效果并研究其作用机制。 5. 以逆转微血管构筑表型异质性为观察重点～研究抗脉管生成疗效与异质性的关系及其个体化策略。 经费比例:17% 承担单位:中国人民解放军第三军医大学、首都医科大学 课题负责人:钱程 学术骨干:陈剑鸿、李晓武、阎晓初、张玉琪、张玉祥 各课题间相互关系 项目各课题以CSCs为主线～紧紧围绕“CSCs在恶性肿瘤发生发展中的作用及其机理”这一核心问题设置上述课题。首先研究CSCs启动恶性肿瘤发生的作用及机理CSCs基本生物学特性和可能的起源～同时建立、改进分离和培养方法学～并探寻出新的标志物,课题一,～做为整个项目的基础研究部分。在此基础上～研究CSCs与微环境尤其是与基质和间充质干细胞的相互作用、表型转换,EMT、MET,的机理～获取CSCs始动和参与侵袭和转移的证据～从而阐明CSCs是肿瘤发生、演进的根源,课题二,,课题三重点研究CSCs在脉管生成中的作用～包括与内皮,祖,细胞和淋巴管内皮细胞的作用～探讨CSCs可塑性在新生脉管异质性形成中的作用和调控机制～从微环境和生长、侵袭、转移所依赖的环节—脉管生成研究CSCs在肿瘤发生发展中的作用,同时～为了重视CSCs与免疫细胞/免疫系统的相互作用这一缺乏研究的领域～揭示CSCs在肿瘤免疫逃逸发生中的作用～课题四专门就此列题研究。这样～课题二、三、四从三个角度密不可分地研究CSCs与微环境相互作用～始动和参与肿瘤发生发展过程。然后～以课题一~三为基础～利用不同亚群CSCs和肿瘤临床样本～研究、筛查侵袭和转移的分子标志物并加以验证,课题五,～以获取CSCs标记物的判断早期侵袭和转移的诊断和预后指标。最后～根据上述各课题的研究结果和已有工作基础～研究针对CSCs和脉管新生为靶标的肿瘤治疗新方法,课题六,～并探讨由于CSCs和脉管异质性所导致的治疗策略和疗效上的差异及其相应机制,图7,。各课题组的单位和人员组成遵循“以项目首席所在单位为主～按项目内容需求组合～体现优势互补、学科交叉、强强联合”的原则。 图7 各课题间的联系以及与项目预期目标的关系示意图 四、年度计划 年度 研究内容 预期目标 1. 建立不同侵袭、转移潜能、1. 获得不同侵袭潜能、不同转移潜 不同组织器官转移特异性的肿瘤能和组织器官特异性的肿瘤模型;建 模型;研究CSCs筛选方法学，建立CSCs体外扩增新方法和三维培养 立三维培养体系，构建“人工肿体系，获得CSCs三维培养体系优于 瘤组织”，比较三维培养体系与二维培养体系的证据;分选iCSCs和 二维培养体系对CSCs生物学特niCSCs,初步证明p53通路对CSCs表 性的影响。 型转化的调控作用; 2. 研究CSCs发生表型2. 获得CSCs转分化和构建VM的证 (EMT,MET)转化的规律，研究据及相关条件，初步阐明CSCs直接第 p53通路在其中的调控机制;研参与血管新生的分子机制,初步阐明一 究CSCs转分化特性或形成VM的T-MAP规律与诊治价值; 年 潜能及机制;研究T-MAP的规律、3. 获得具有人源化免疫系统的小鼠 诊治意义。 模型;获得iCSCs特异性抗原表达系 3. 建立人源化免疫动物模型，统;获得CXCR4和(或)FPR拮抗剂; 并进行鉴定。分离CSCs及亚群，获得能感染CIK和iCSCs细胞的腺病 进行组学分析。 毒载体; 4. 获得CSCs及亚群特征性基因表 达谱。 5. 发表SCI论文14~20篇; 6. 申请专利3~4件。 1. 主要研究CSCs起源、增殖、1. 认识T-MAP异质性(T-MAPH)的 分化以及在恶性肿瘤发生中的作临床治疗意义，揭示CSCs调控肿瘤第 用;研究CSCs的分化可塑性及其脉管形成的机制，探讨CSCs对二 分子机制。 T-MAPH形成的影响; 年 2. 观测CSCs与脉管分布和密度2. 探索出稳定的致癌物体外诱导正 的关系，分析CSCs分布与肿瘤脉常干细胞向CSCs转化模型;鉴定出 年度 研究内容 预期目标 管形态、构筑、免疫表型、组织在成体干细胞向CSCs转化过程中发成分的关系与临床意义;研究几挥关键作用的分子;获得CSCs可塑种治疗对T-MAPH影响及机制。 性表征及其主要调控通路，证明CSCs3. 研究整合素相互作用蛋白转分化潜能; Kindlins与促进EMT的转录因子3. 证明CSCs表型转化与肿瘤侵袭的协同整合及其在CSCs表型转转移的关系;证明Kindlins参与调换中的作用。 控CSCs表型转化，并初步阐明相关4. 利用体外共培养模型和免疫机制;筛选出染色体基因组DNA差异缺陷小鼠的荷瘤鼠模型，重点研失衡区带以及特异性甲基化分子标究CSCs对DCs、T细胞、B细胞、志物; NK细胞的免疫应答的调节作用4. 初步阐明CSCs与免疫细胞之间及相关机制。 的crosstalk及相关介导分子;获5. 筛选出影响iCSCs生物学特得iCSCs特异性蛋白抗原; 性的CXCR4和(或)FPR拮抗剂;5. 评估CXCR4、FPR等拮抗剂对研究CIK细胞装载溶瘤腺病毒基iCSCs生物学特性的作用;阐明CIK因治疗载体在肿瘤内释放能力和细胞装载溶瘤腺病毒基因治疗载体作用机理。 在肿瘤内释放能力和作用机理; 6. CSCs基因表达谱检测，验证，6. 分选获得iCSCs和niCSCs，获得并行生物信息学分析整合;筛选iCSCs、niCSCs与成体干细胞生物学出基因组DNA差异失衡区带的分特性差异的证据;建立稳定的示踪布规律，并验证;进行基因组甲肿瘤发生发展过程的方法; 基化分析、验证;生物信息学整7. 获得多个抑制iCSCs侵袭/转移合分析。 的单克隆抗体;评估CIK介导溶瘤 腺病毒靶向肝癌治疗的疗效和作用 机制; 8. 发完成中期结果总结;表SCI论 文34~38篇，申请专利6~8项。 9. 获得多个能用来筛选iCSCs的单 年度 研究内容 预期目标 克隆抗体;获得单克隆抗体作用靶 点; 10. 评估单克隆抗体在体内外抑制 iCSCs侵袭和转移的作用机理。 1. 研究iCSCs和niCSCs之间1. 证明CSCs维持基因在不同标本CSCs维持基因的表达情况及其来源的iCSCs中的表达存在差异，初表观遗传学调控机制;观测步阐明表观遗传学调控机制; iCSCs与骨髓源性间充质干细胞2. 建立iCSCs与MSC三维共培养体(MSC)、细胞外基质和微血管系，证明二者之间存在相互作用; niche的相互作用。 3. 阐明CSCs中CUDEC2基因调控2. 重点研究CSCs对骨髓源性内IRF-IFN信和NF-,B信号通路的机 +皮祖细胞、KDR血管祖细胞定向理，初步认识CSCs在免疫编辑中的迁移、趋化、增殖、分化和管型作用; 形成能力的影响及机理。 4. 了解CSCs对内皮祖细胞的影响;3. 研究CSCs中CUDEC2基因的阐明CSCs旁分泌因子分别对微血管 第 表达及其介导CSCs参与在肿瘤和微淋巴管内皮细胞的影响及机理; 三 免疫编辑的机制。 5. 完成中期进展报告;发表SCI论 年 4. 比较研究 iCSCs、niCSCs与文9~16篇,申请专利2-24项。 正常(成体)干细胞的生物学特(1)获得转移相关差异性蛋白谱及性与相关机制。开展“研究内容信号通路;筛选出可用于早期诊疗的1”中的工作，制备针对iCSCs蛋白分子; 的单克隆抗体。 (2)筛得差异性microRNA表达谱鉴5. 开展“研究内容4”中的工作，定出转移相关基因表达谱，初步阐明探讨CIK介导溶瘤腺病毒靶的疗其表观遗传学调控机制; 效和机制。 (3)获得用于早期诊断及鉴别诊断、6. 开展研究内容2的工作，进治疗的分子标志物和/或分子标志物行抗体/蛋白芯片，并验证，筛选群; 分子标志物，并验证; (4)进行组学分析:microRNA表达 年度 研究内容 预期目标 7. 开展研究内容3的工作: 谱检测，并验证; 8. 生物信息学整合分析。 6. 获得标志物谱，发表SCI论文4 篇以上。 1. 标记CSCs，并通过活体示踪1. 获得CSCs的归巢特性;获得 移植，观察CSCs的归巢特性;T-MAPH相关的蛋白质组学资料; 研究P2Y嘌呤受体激动剂对2. 证明P2Y嘌呤受体激动剂对CSCs iCSCs的作用及其信号传导生物学特性的影响; 调节机制。 3. 了解CSCs表达和产生趋化因子 2. 研究导向分子谱;阐明不同Sema3F表达状态的 Sema3/Nrp/Plexin受体复合肿瘤细胞对肿瘤淋巴管生长导向 物形成对肿瘤淋巴管内皮细和淋巴道转移的影响; 胞芽生的调控机制;观察4. 阐明CSCs趋化因子受体活化后对 第 T-MAP特征与肿瘤侵袭、转移免疫细胞表型的影响;获得介导 四 和治疗反应性的关系;预测CSCs与免疫细胞相互作用的下游 年 T-MAP诊治意义。 信号分子; 3. 研究特征性分子和趋化因子5. 研究导致iCSCs、niCSCs与成体 及其受体介导免疫细胞与干细胞生物学特性差异的相关分 CSCs相互作用及其机制;研子及信号转导通路; 究肿瘤相关新基因(CUEDC2)6. 获得预测或/和早期诊断肿瘤转 功能、已知基因SOX4和XPC移的分子模型; 新功能在CSCs始动肿瘤发生7. 在人体肿瘤标本中对以上分子模 中的作用及机制。研究上述单型的临床意义进行验证; 克隆抗体作用靶点;开展“研8. 发表SCI论文10~23篇;发表SCI 究内容3”中的工作，利用单论文88篇;申请专利4件。 年度 研究内容 预期目标 克隆抗体行iCSCs筛选;上述 单克隆抗体抑制iCSCs侵袭 和转移的机理; 4. 继续开展“研究内容4”中的 工作，CIK介导溶瘤腺病毒靶 的疗效和机制。 5. 对所获得的各标志物群进行 临床验证，探讨其诊疗意义; 6. 开展研究内容4的工作，开发 用于恶性肿瘤侵袭/转移的诊 疗方法及工具。 1. 以正常成体干细胞为对照，研1. 阐明CSCs细胞间隙连接通讯障碍 究CSC间隙连接通讯障碍情在CSCs侵袭、转移中的作用与临 况;从间隙连接种类、连接蛋床意义; 白家族分子表达等方面探讨2. 鉴定和研究T-MAPH相关的多个差 CSCs间隙连接通讯异常发生异蛋白质; 的机制及其临床意义。 3. 获得CSCs与免疫细胞关系具有临2. 鉴定不同构筑表型微血管的床意义的证据; 第 差异蛋白质，研究这些蛋白质4. 阐明CUEDC2等基因功能及其与 五 的功能(在体外对血管生成和CSCs生物学特性的关系; 年 T-MAPH形成的影响)。 5. 证明所筛得的遗传标志物的临床3. 研究筛选CSCs发挥重要作用意义; 的miRNA分子，并研究其与肿6. 解决早期诊断、预测转移和预后、 瘤发生的关系及临床意义。 判断治疗效果; 4. 完成单克隆抗体进行癌症患7. 获得基因重组的人源化单克隆抗 者组织和血液CSCs分布的检体和优化生产人源化单克隆抗体 测。 的细胞系; 5. 研究成果总结、结题。 8. 申报发明专利6,10件; 年度 研究内容 预期目标 9. 发表SCI论文18~22篇。 10. 总结研究结果，进行结题工作。