银耳凝集素红细胞凝集性能的研究

银耳凝集素红细胞凝集性能的研究 ※基础研究良品科学2007,Vo1.28,No.09103 银耳凝集素红细胞凝集性能的研究 侣国涵,马爱民,吴尧,谈佳玉 (华中农业大学食品科技学院,湖北武汉430070) 摘要:银耳的生长发育主要经过孢子,菌丝体,子实体三个阶段.银耳孢子,菌丝体,子实体中凝集素的 粗提方法主要包括磷酸盐缓冲液抽提,硫酸铵分级沉淀等.这三种凝集素的耐热性都较差,经6O?处理lOmin后, 凝集活性明显降低.它们的耐酸碱性差异较大,孢子凝集素只在中性环境下活性稳定,而菌丝体和子实体分别在 偏碱性和偏酸性的条件下稳定.Mg2+,A13+,Fe3+对三种凝集素的活性均有恢复和增强的作用.在供试的八种测 试糖中,只有菌丝体凝集素的凝集活性受到乳糖的抑制. 关键词:银耳;凝集素;红细胞凝集 StudyonHemagglutinationPropertiesofLectinsfromTremellafucifof SIGuo-han,MAAi-min,WUYao,TANJia-yu (College0fFoodScienceandTechnology,HuazhongAgriculturalUniversit y,Wuhan430070,China) Abstract:ThedevelopmentofTremellafuciformiscontainedthreestagesofg rowth,namelyspore,myceliumandfruitingbody. Theisolationprocedureinvolvedextractiondealtwithphosphatebufferedsalineandpmcipitationof30%~60%(NH4)2504. Thesethreelectinsfromthethreestagesarealllessthermostable.”~/’henheatedat70?.theylosetheirofigm~activity.The agglutinationactivityofthesporelectinisonlystableinneutralenvironment,whereasthelectinsofmyceliumandfruitingbody arealkali-andacid-stablerespectively.Theiractivitiesareaffectedbybo出 demetalizationandadditionofmetalionsincluding Mg”,A1,Fe3.Amongthevariouscarbohydratestested,lactoseistheonlysacchaddecapableofinhibitingtheagglutinating activityofmyceliumlectin. Keywords:TremellafuciformisBerk;lecfimhemagglutination 中图分类号:TS201.21文献标识码:A文章编 号:1002.6630(2007)09.0103.04 凝集素是一类非免疫原的,与糖专一结合的,能 够凝集细胞或沉淀含糖大分子的蛋白质或糖蛋白….在 生命科学各个领域的研究中,其用途已越来越广泛,已 成为生物化学,细胞学,免疫学及医学等领域中有用 的科研材料,并被应用于临床诊断,治疗和某些工业 生产[2j.自l888年俄国学者首次在蓖麻籽中发现凝集素 后,凝集素的研究全面展开.许多大型真菌含有大量 的凝集素,据Pemberton报道,在其研究的403种大型 真菌中,50%具有很强的凝集素活性,而且目前双孢 蘑菇凝集索已经成为一种商品. 银耳(Tremellafuc册Berk),又名白木耳,雪耳, 在分类上隶属于真菌门(EumYCOta),担子菌纲 (BasidiomyCeteS),银耳目(TremellaleS),银耳科 (Tremellaceae),银耳属(Tremella),属中温,好气性真菌, 主要分布于亚热带,也分布于热带,温带和寒带….银 耳甘平无毒,除具有润肺生津,滋阴养胃,益气和血, 收稿日期:2006.09.15 作者简介:侣国涵(1981.),男, 补脑强心的功效外,还有提神益气,滋润皮肤,恢复 肌肉疲劳,抵抗肿瘤等作用,具有极高的经济价值和 研究价值. 迄今对银耳中的凝集索研究未见报道.本实验将对 银耳在不同发育阶段,即孢子,菌丝体,子实体中所 含的凝集素进行抽提,并对其细胞凝集活性,糖专一 性,热稳定性等性能进行测定,在此基础上分析不同生 长期凝集素的差异,为其进一步的研究提供理论依据. 1材料与方法 1.1材料和试剂 银耳子实体,银耳菌丝体,银耳孢子:由本实验 室提供.新鲜鸡血市售.N.乙酰氨基葡萄糖Sigma 公司,其它糖为国产分析纯,其余试剂均为分析纯. 1.2方法 1.2.1银耳凝集索的提取 通迥作者 硕士研究生,研究方向为食品微生物. 1042007,VoL28,No.09食品科学※基础研究 银耳孢子,菌丝体,子实体干品研磨成粉末后, 加入PBS(0.05mol/L磷酸缓冲液一0.15mol/LNaC1,pH7.2) 缓冲液于4?冰箱内放置过夜.将浸出液离心(4?, 10000r/min,5min),取上清液均加(NH)zSO至饱和度 30%,静置0.5h,在4?,10000r/min的转速下离心 15min,取上清液加入固体(NH)2SO分别达到饱和度 60%,70%,60%,静置0.5h,在4?,10000r/min 的转速下离心15min,将收集到的沉淀物溶于PBS中, 并用蒸馏水透析至中无so检出,即得到孢子,菌丝 体,子实体凝集素的粗品. 1-2.2凝集活性的测定 鸡血红细胞的制备为在血样中加入Alsever氏抗凝 剂,离心除去血浆,红血球用生理盐水洗涤2,3次, 最后配成2%细胞悬液.参照孙册等的方法[2】,在96孔 “v”型血凝板中加入PBS25la1,取样品25u1作倍比 稀释.每孔中加入25u12%红细胞悬液,振荡混匀, 室温放置1.Oh后观察结果.无凝集时血球沉于”V”型 板底部,呈一小圆点;凝集时红细胞呈膜状附于孔底. 1.2I3温度稳定性 取1501a1样品加入150ta1PBS,在每个1.5ml离心管 中加入上述溶液20la1,在恒温水浴锅里,于30,80? 之间,每隔10?将一个样品恒温处理10min,取出后立 即用冰水冷却,随后在”v”型血凝板上作倍比稀释, 测定其对鸡红细胞的血凝活性,同时与室温样品对照【5】. 1_2.4酸碱稳定性 参照苏拔贤等的方法[6】,配制pH3.6,10.0的系列缓 冲液.pH3.6,5.0采用0.2mol/L乙酸一乙酸钠缓冲液; pH6.0,8.0采用0.2mol/L磷酸氢二钠一磷酸二氢钠缓冲 液;pH9.0,10.0采用0.05rnol/L甘氨酸一NaOH缓冲液. 取不同pH值缓冲液25u1,加入样品凝集素25u1, 混合后在4?冰箱放置1.Oh,经PBS倍比稀释后,每孔 加入25u12%鸡红细胞悬液,室温放置1.Oh,观察结 果【7—8】. 1.2.5金属离子对凝集素活性的影响 将样品凝集素对10mmol/LEDTA中充分透析,再 用蒸馏水透析除去EDTA,待用.在”v”型血凝板 上,依次在各孔中加入100mmol/LCa2+,Zn2+,Mg, Fe3+,A13+溶液25u1,用生理盐水作倍比稀释,每孔 加入样品凝集素25u1,混匀放置于4?冰箱,1.Oh后每 孔再加入25u12%鸡红细胞悬液混匀,室温放置,观 察结果.并以未经EDTA处理的样品作对照组【9】. 1.2.6糖抑制实验 在”V”型血凝板上,加入40mmol/L的各种糖溶 液25u1,对PBS进行倍比稀释后,每孔加入样品凝 集素25l,混合后在4?冰箱放置,1.0h后每孔再加入 25u12%鸡红细胞悬液,室温放置0.5h,观察结果[1O1. 2结果与分析 2.1银耳孢子,菌丝体,子实体凝集素的凝血活性 凝集素的活性单位定义为:发生凝集作用的最低滴定 的倒数为每毫升蛋白溶液所含有凝集素活性单位(unit){lu. 孢子,菌丝,子实体的凝集素粗样,经PBS倍比稀释后, 测定其对鸡红细胞的凝集活性,见1,结果表明银耳孢 子,菌丝,子实体对鸡红细胞均能发生凝集反应,但凝 集强度有差异,子实体凝集素的凝集作用最强,而孢子 凝集素的作用最弱.孢子,菌丝体,子实体中凝集素的 凝集活性分别为320,1280,2560U/ml. 表1银耳凝集素的凝血活性 Table1AgglutinatingactivityofTremellafuciformi$lectin 凝集素凝血滴度(U,IIl1) 孢子 菌丝 子实体 32O 1280 256o 2-2温度对银耳孢子,菌丝体,子实体凝集素细胞凝 集活性的影响 凝集素样品经热处理后,测定温度对其的影响. 由表2中得出孢子,菌丝,子实体凝集素的血凝活性在 30?时均能保持稳定,表明这时温度变化并没有影响其 活性基团.在40?时,孢子,菌丝体凝集素丧失了部 分活性,在50,60?之间,孢子,菌丝体凝集素活性 大部分丧失,但在70?处理后,这两种凝集素的活性 完全丧失.而银耳子实体凝集素在40~C以上时活性就已 完全消失,由此可见,孢子,菌丝凝集素比子实体凝 集素耐热.与其它食用菌凝集素比较,红菇在100?时 还能够保持其50%的活性;四孢蘑菇凝集素在低于80~C 稳定[121.银耳凝集素对热的稳定性较差. 表2温度对银耳孢予,菌丝体,予实体凝集素活性的影响 Table2Effec~oftemperatureonactivityofTremellafuciformis lectin 注:供试样品活性:孢子8U;菌丝体32U;子实体32U. 2.3pH对银耳孢子,菌丝体,予实体凝集素细胞凝 集活性的影响 ※基础研究食品科学2007,VoL28,No.09105 孢子,菌丝体,子实体凝集素在pH3.6,10.0的条 件下对鸡红细胞的凝集活性.从表3中可见银耳孢子, 菌丝体,子实体凝集素的耐酸碱性具有显着差异.孢子 凝集素在pH6.0,7.0之间凝集活性较高,当pH<5.0和 pH>7.0时,其活性明显下降.菌丝体凝集素在pH6.0, 10.0之间凝集活性较高,在pH4.0时凝集活性大部分 丧失,pH3.6时,活性则完全丧失.子实体凝集素在 pH3.6,7.0之间凝集活性较高,当pH>7.2时,活性 逐渐下降,在pH10.0时,活性大部分消失.比较三者 可得,孢子凝集素的耐酸碱性比其它两种凝集素弱,但 菌丝体凝集素不耐强酸,而子实体凝集素不耐强碱. 表3pH值对银耳凝集素活性的影晌 Table3Effe~sofpHagainstactivityofTremellafuciformis lectin 注:供试样品活性:孢子8U;菌丝体16U;子实体32U 2.4金属离子对银耳孢子,菌丝体,子实体凝集素细 胞凝集活性的影响 金属离子对孢子,菌丝体,子实体凝集素的影 响,由表4表明:三种凝集素经EDTA处理后凝集活性 消失,即孢子,菌丝体,子实体凝集素对鸡红细胞的 凝集活性都与金属离子有关.Znz+,Mgz+,Al+等离 子在浓度为1.56mmol/L时,即可使银耳菌丝体和子实体 凝集素具有凝集细胞的活性,而孢子凝集素凝集所需的 最低浓度为6.25mmol/L.而Caz+在很高的浓度下,才 使各凝集素出现凝集活性.Mg2+对孢子,菌丝体,子 表4金属离子对银耳凝集素的细胞凝集活性的影响 Table4EffectsofmetalionsonactivityofTremellafuciformis lectin 金属离子凝集素活性所需金属离子最低浓度(retool/L) 银耳孢子银耳菌丝体银耳子实体 注:供试样品活性:孢子8U:菌丝体16U;子实体32U.”一” 不凝集. 实体凝集素活性的恢复无任何作用. 2.5银耳孢子,菌丝体,子实体凝集素的糖抑制实验 在”v”型血凝板上测得孢子,菌丝体,子实体 凝集素的糖抑制结果如表5所示.从表中看出,D.葡 萄糖,D.甘露糖,麦芽糖,蔗糖,木糖,乳糖,D. 半乳糖,N.乙酰氨基葡萄糖这八种糖对孢子,子实体 凝集素的凝集活性无抑制作用,而菌丝体凝集素的凝集 作用可被乳糖抑制. 表5糖对银耳凝集紊活性的抑制作用 Table5InhibitionofagglutinatingofTremellafuciformislectin bysugam 注:”一”:无抑制作用;”+”:有抑制作用. 3讨论 3.1凝集素的细胞凝集作用是凝集分子的一个亚基与一 个细胞表面的凝集素专一识别的糖基结合,另一个亚基 与另一个细胞上的糖基结合,从而通过凝集素的”架 桥”作用而导致的.本实验中银耳孢子,菌丝体,子 实体的提取物都能使鸡红细胞凝集.热稳定性实验表明 银耳孢子,菌丝体,子实体凝集素对热均较为敏感, 因此在进一步的分离纯化过程中,应控制好温度以保证 其生物活性. 3.2酸碱稳定性实验表明银耳孢子,菌丝体,子实体 凝集素对酸碱的敏感度存在较大的差异.孢子凝集素在 中性环境中稳定,在酸性和碱性环境中凝集活性都下 降;菌丝体凝集素对碱具有一定的稳定性,但对酸不稳 定;而子实体凝集素与菌丝体凝集素相反.凝集素与糖 基的结合是一种非共价的相互作用,氢键,疏水键和 静电力都是可能的因素【7J,在碱性条件下(pH7.2,l0.0), 子实体凝集素的细胞凝集活性下降,说明子实体凝集素 与糖基的结合部位可能有带正电性基团的参与,菌丝体 凝集素与糖基的结合部位可能有带负电性基团的参与, 而孢子凝集素与糖基的结合部位可能有无极性的基团参 与.这也表明银耳孢子,菌丝体,子实体凝集素活性 基团组成可能是不同的.其具体的结构差异还待于进一 步研究. 1062007’Vo1.28,No.09良晶科学※基础研究 3-3金属离子影响的实验表明,金属离子是这三种凝集 素活性所必需的.在去金属离子的凝集素中加入浓度很 低的Zn2+,AI3+,Fe,+等金属离子,即可使其重新恢复 凝集活性.可见这些金属离子的存在对保持银耳孢子, 菌丝体,子实体凝集素天然结构具有很重要的作用. 3_4糖抑制实验表明,所测试的糖都不能抑制孢子, 子实体凝集素的凝集活性,只有乳糖能抑制菌丝体凝集 素的凝集活性.说明菌丝体凝集素有与互补的乳糖专一 结合的位点,它的结合位点只属于一个双糖范围【”].由 于糖结合特异性是凝集素的最重要的特征之--[14],继续 研究银耳孢子,子实体凝集素的糖结合特性,对银耳 孢子,子实体凝集素的生理活性等研究有重要的意义. 参考文献: 川1胡业华.凝集素的生物学研究【J].江西教育学院:自然科学版, 2001,22(6):47-49. 【2]孙册,朱政,莫汉庆.凝集素【M】.北京:科学出版社,1986. f3】PEMBERTONRT.Agglutinins(1ectins)fromsomeBritishhigher fungit1].MycologicalResearch,1994,98(3):277—290. 【4]彭卫红,王勇,黄忠乾,等.我国银耳研究现状与存在问【J].食用 菌,2005,12(1):51—56. 【5]5施佳军,赵呈裕.鸡纵凝集素的分离纯化及性质研究【J].天然产物 研究与开发,1998,10(1):20.24. 【6】苏拔贤.生物化学制备技术【M】.北京:科学出版社,1986. 【7】林玉满,苏爱华.大杯伞凝集素的分离纯化及其性质【J].应用与环 境生物,2004,10(4):497—501. 【8]孙慧,赵辰光,齐义鹏,等.一种新杨树菇(Agrocybeaegerita)凝集素 的纯化及生化特征【J】.中国生物化学与分子生物,2003,19(1): 96—102. 【9】刘艳如,余萍,郑怡.柱状田头菇凝集素的分离纯化及其部分性质 【J].食用菌,2004,11(3):17—23. 【10】ZHUANGC,MURATAT,USUIT,eta1.Purificationandcharaetedza- tionofalectinfromthetoxicmushroomAmanitapantherina[J】. 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