甜高粱蔗糖合成酶基因的克隆及转EPSPS基因的研究（可编辑）

甜高粱蔗糖合成酶基因的克隆及转EPSPS基因的研究（可编辑） 学校代码 分类号 ? 学 号 密 级 公开 彦商火学 论 文 学 位 甜高梁蔗糖合成酶基因的克隆及转册基因研窒 宋炫晏 学院名称 农学院 专业名称 作物遗传育种 冯斗教授 指导教师 士 提交日期 年月 申请学位级别 硕 年月日 学位授予日期 年月 论文答辩日期 答辩委员会主席 李容柏研究员 双盲评审 论文评阅人 论文评阅人 双盲评审广西大学学位论文原创性和使用授权声明 删嗍 本人声明所呈交的论文,是本人在导师的指导下独立进行研究所取得 的研究成果。除己特别加以标注和致谢的地方外,论文不包含任何其他个 人或集体已经发表或撰写的研究成果,也不包含本人或他人为获得广西大 学或其它单位的学位而使用过的材料。与我一同工作的同事对本论文的研 究工作所做的贡献均已在论文中作了明确说明。 本人在导师指导下所完成的学位论文及相关的职务作品,知识产权归 属广西大学。本人授权广西大学拥有学位论文的部分使用权,即:学校有 权保存并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和电子版,允许论 文被查阅和借阅,可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行 检索和传播,可以采用影印、缩印或其它复制手段保存、汇编学位论文。 本学位论文属于: 口保密,在 年解密后适用授权。 , 的不保密。 请在以上相应方框内打“?’’ 论文作者签名:驰炙 日期:易,辱分内刎怕 日期弦歹年石月纠目 指导教师签名:了墨萝十 作者:/?州函?刁 电子邮箱:叫“狮旆研义坝碗.伽甜高梁蔗糖合成酶基因 的克隆及转基因研究 摘要 甜高粱既能收获粮食,又能获得含糖茎秆,且其耐旱、耐盐碱不与粮食作物争地的 特点使其成为中国生物质能源的良好选择。但其作为生物质能源仍存在一些亟待解决的 问题:茎秆含糖量不高,对除草剂敏感不利于降低生产成本等,对光敏感不利于其两季 种植的高产等。本实验基于以上目的进行了部分实验:.克隆甜高粱北甜三号的蔗糖 合成酶基因及其前端调控序列;.建立北甜三号再生转化体系;.转抗除草剂基因 。主要结论如下: .北甜三号蔗糖合成酶序列与。经序列分析可知:此序列共计,起始密 码子至终止密码子共,共编码个氨基酸。经由比对后发现该序列与上 已登录甜高粱品种 的蔗糖合成酶编码序列相似度达%,说明了蔗糖 合成酶基因具有保守性; .北甜三号再生转化体系。不同基因型的甜高粱品种,其诱导胚性愈伤组织与分化 的配方也大相径庭。经实验与后期数据分析可知,北甜三号最佳诱导胚性愈伤组织培养 基为:./,./;最佳诱导分化培养基为:./ : ./ .转抗除草剂基因。经实验发现如果农杆菌浸染时间过长,在后期共培养过 程中会大量出现胚性愈伤组织褐化死掉现象;侵染时间如果过短,在后期筛 选胚性愈伤 组织时会发现大量假阳性。在浸染晃荡过程中,较易松散的颗粒状胚性愈伤 组织在后期 共培养过程中更容易存活;得出最佳共培养时间为小时,且筛选过程中较适 宜的抗 生素浓度第周为/卡纳霉素、/潮霉素和/羧苄青霉素,第周 为/卡纳霉素、./潮霉素和/羧苄青霉素。 关键词:甜高梁;北甜三号;蔗糖合成酶;再生体系;转基因’ , , , , . , ., ., , . , . ,, .. . ’ . ,, , . ’ . %,. .., ./ ,. , / . ./ ./ .. , ? . , . ? . ’ . , / / ,/ ./ / ,./ .: ; ; ; ;缩略词 缩略符号 英文全称 中文全称 氨苄青霉素十六烷基三甲基溴化铵乙二胺四乙酸 卡那霉素 光密度???? 。溴..氯..吲哚..半乳糖苷 萘乙酸 .... 吲哚乙酸,.二氯苯氧乙酸 , . .苄基腺嘌呤 苯基噻二唑基脲 目 录 前言?.. 日舌?.. .生物质能源作物概况及我国发展生物质能源的合理选择?. ..生物质能源作物种类及优势??.. ..国内外生物质能源作物的研究利用现状??. ..在中国发展生物质能源的合理选择.. .能源作物甜高粱的研究进展. ..甜高粱作为能源植物的特点??.. ..甜高粱作为生物质能源作物原料在工业化过程中存在的问题??. .植物蔗糖合成酶研究进展? .植物转抗除草剂基因研究进展??.. ..抗除草剂基因及其作用机制??.. ..转抗除草剂基因作物研究进展..甜高粱再生体系研究进展. .本研究目的、意义及创新点. 北甜三号蔗糖合成酶基因克隆. .材料与方法..植物材料..质粒与菌株?. ..酶、试剂和培养基??. ..实验方法...从甜高粱北甜三号叶片中提取总基因组. ...引物.? ... 反应体系’ ... 产物的回收...连接克隆载体??.. ...大肠杆菌感受态细胞制备??. ...大肠杆菌感受态细胞的转化?.. ...测序??. .结果与分析?.. ..甜高粱基因组.. 结果?.. ..序列测定与分析??.. .讨论.. 甜高粱品种北甜三号再生转化体系的建立??.. .材料与方法?.. ..实验材料?.. ..实验方法?.. ...外植体的消毒??.. ...不同浓度配比的生长素与细胞分裂素诱导胚性愈伤组织的培养基筛 选?.. ...愈伤组织的继代.。.不同浓度配比植物激素诱导胚性愈伤组织分化的培 养基筛选?. ...诱导生根试验??.. .实验结果与分析. ..不同浓度配比的,一与对北甜三号愈伤组织诱导的影响?. ..不同浓度配比的,一与对北甜三号胚性愈伤组织诱导的影响 ..不同浓度配比的,一与对北甜三号愈伤组织诱导的影响?. ..不同浓度配比的,一与对北甜三号胚性愈伤组织诱导的影响 ..不同浓度配比的与一对北甜三号胚性愈伤组织分化率的影响??.. ..不同浓度配比的与一对北甜三号胚性愈伤组织分化率的影响??.. .讨论.. 北甜三号农杆菌介导的转抗除草剂基因?. .实验材料与方法. ..植物材料?.. ..质粒与菌株? ..酶和试剂?.. ..实验方法?.. ...获取一重组质粒??.. ...农杆菌感受态细胞的制备??. ...含基因重组质粒的农杆菌菌株的转化 ...重组农杆菌的筛选及鉴定??. ...甜高粱北甜三号愈伤组织农杆菌介导的转化 ...转化后愈伤组织的筛选 ...筛选后愈伤组织的诱导分化??一...诱导生根? 。实验结果??. ..质粒双酶切鉴定结果?. ..测序结果?.. ..甜高粱北甜三号愈伤组织的农杆菌介导转化筛选结果? ...农杆菌介导转化后的共培养?.. ...农杆菌介导转化后愈伤组织的筛选结果?. ...筛选后愈伤组织的诱导分化结果. .讨论.. 全文结论 .北甜三号蔗糖合成酶的克隆及序列分析??.. .北甜三号再生体系的建立.. .农杆菌介导的转抗除草剂基因获得组培苗.问题与展望?.. 致 谢.. 参考文献??.. 附录:?.. 甜高梁蔗糖合成酶基因的克隆及转陋墓因研究 前言 根据英国石油公司世界能源统计:截至年底,已探明的全世界原油储备量接 近亿桶,世界煤炭资源剩余可开采量约为亿吨。如若按年的开采速度 计算,仅可维持全世界五十几年的石油消耗与一百四十几年的煤炭消耗。由于石油勘探 活动的增加及勘探技术的不断提高,从年起每年发现的原油储备量均高于年代 初期水平,然而石油开采量仍然持续高于新发现油田储量,导致石油价格不断飙升朱 剑明等,。短期内国际石油价格的大幅度震荡上行,显现出市场持续的增长需求。 以上现象警示我们:石油等一些不可再生能源终究是有限的,寻求可替代使用能源箭在 弦上。 国家建设始终是发展中国家的主题,而建设又不能离开能源。中国能源资源存在以 下特点:首先,水能和煤炭储备量丰富,分别位居世界第一位及第三位,但优质化石能 源相较于其他国家明显不足,已探明的石油及天然气资源储备量仅居于世界 第十三位及 第十七位。据中华人民共和国国土资源部等有关统计,水能资源主要分布于西南地区, 开发难度大,开发成本高,煤炭资源主要分布于中西部地区远离市场,运输成本高,石 油储备量仅为.亿吨,产能增幅不大,天然气资源储备量为亿吨,有大幅增长 可能,但总体上来说开采条件与资源总量较俄罗斯与伊朗等能源大国难江泽民,; 其次,虽然我国能源建设不断加强,但能源利用率较发达国家相比任然很低;最后,市 场于能源需求持续增长,可持续发展面临严峻挑战,发展新型可再生能源迫在眉睫。 .生物质能源作物概况及我国发展生物质能源的合理选择 生物质是所有的土地和水生植物以及有机废物的综合。生物质能源是植物经由太阳 辐射加工转化的化学态能量。由于其以植物为能量载体,因此具有稳定性和储能性。可 以同时产生生产能源及物质性产品的特点使其具有原料上的多样性。 ..生物质能源作物种类及优势 根据载体物质的不同,现主要将生物质能源划分为四类:油脂类作物、淀粉类作物、 糖类作物及木质纤维素类作物。涉及发酵酒精的能源作物主要有淀粉类作物 玉米、木 薯、马铃薯和小麦等粮食作物、糖类作物甘蔗、甜菜和甜高粱等和纤维素类作物 蓖麻等徐芬芬等,。生物质能源相较于其他能源主要具有资源品种丰富、可甜高梁蔗糖合成酶基因的克隆及转髂基因研究 再生、抗逆性强、生产周期短、高效能量产出、不受地域限制、环境友好、生产安全等 优势张卫明,。 ..国内外生物质能源作物的研究利用现状 由于生物质能源产业市场尚未成熟所造成的企业投入大,各国政府都出台了相关补 贴政策以推动本国生物质能源产业的快速发展。巴西政府经过长达年的甘蔗发酵酒 精的研究与应用,已具备成熟的酒精生产、运输及分销体系。瑞典利用作物废物甜高 粱秸秆等生产固体成型燃料已经发展的相当成熟;日本改进了从国外引进的固化成型 技术,研制了棒状燃料成型机和相关的燃料设备,具备成熟的压缩型燃料工业体系;美 国国会制定了《生物技术路线图》,并新建相关项目办公室和技术咨询委员会旨在给与 进行生物质能源开发的公司政策咨询及技术指导孙宏岭,。年燃料乙醇生 产量达到亿加仑。 ..在中国发展生物质能源的合理选择 依据自身特点,世界各国选用的生物质能源作物大相径庭:美国的玉米、巴西的甘 蔗及法国的甜菜等等。因此,如何因地适宜的选择合适的生物质能源作物对我国发展生 物乙醇能源产业至关重要。中国人多地少,粮食紧张,这就决定了在中国采用玉米、小 麦等粮食作物发酵酒精是不可取的;同时,中国作为食用糖短缺的国家,且食用糖的经 济价值远高于乙醇,因此甘蔗和甜菜用于大规模的生产发酵乙醇也是不现实的。这就决 定了中国发展生物质能源产业应该独辟蹊径,主张“不争地,不争粮、油、糖”的基本 原则,利用广泛边际性土地,发展高适应性、高抗逆性、高生物学产量的非粮食生物作 为工业乙醇发酵的原材料。 而甜高粱作为植物,具有生长快、产量高、抗逆性强等优势,一年种植两季且 在中国有着深远的栽培历史,在沙地和盐碱地等低质的边际性土地上种植也能获得较好 产出,综上所述选择甜高粱茎秆作为发酵工业酒精原材料是个不错的选择黎大爵等, 。 .能源作物甜高梁的研究进展 于 年首次对高粱进行了定义。之后正式对高粱属进行了分类。 目前所使用的高粱分类学概念为所提出的的。栽培甜高粱隶属于禾本科高梁族 高梁属甜高梁种下的亚种,拉丁名为勋 肠厂仁玩 “印.七肠,.,英文名 为.,英文中的玛啪还指甜高粱种甚至泛指高粱属植物、?等,。 甜高梁蔗翱分成酶基因的克隆及转隆陋墓因研究 关于高粱最详细的分类是由提出的,他描述了个栽培种,个相关的野生 种,并对这种不同类型的高粱进行了详细区分 .等。 ..甜高粱作为能源植物的特点 甜高粱作为能源植物具有以下几点优势:首先,甜高粱具有很强的生长能力。在广 西一年可种植两季,北方可种植一季,单株最高可达米,每公顷可产粮食,每 公顷糖产量约为吨,高产纪录为/;其次,甜高粱具有抗逆性强、适应性广 的特点。其在三十多度高温干旱恶劣环境下,柱头和花粉仍可维持小时左右生活力, 而此种环境下的玉米只有十几分钟的寿命。其对盐碱的承受浓度也高于玉米灯作物,能 耐受的盐浓度范围为.%..%,譬如:将甜高粱种植在山东滨州盐碱地上,最高亩产 甜高粱鲜秸秆仍可达 ..的各种类型土壤中均可栽培, 。其适应性广,在 在?以上积温达?.?就可以生长,因此只要选在合适品种,我国各省均可 等,;再 种植甜高粱。甜高粱主要通过种子繁殖,适于机械播种和收获 次,田宜水等年对甜高粱茎干乙醇全生命周期的分析表明:甜高粱乙醇能量产 出投入比为.,相较于玉米乙醇生命周期的能量产比小于,木薯乙醇技术路线在生 命周期化石能消耗与传统汽油技术路线相比并无优势,甜高粱乙醇作为生物质能源具有 很大优势;最后,随着科技的发展,新型技术不断应用于甜高粱茎干发酵乙醇中去。王 闻等于年中国可再生能源学会上就发表了一种促进甜高粱杆渣酶解的试验方法, 大大提高了了其聚糖转化率。 ..甜高粱作为生物质能源作物原料在工业化过程中存在的问题 一方面甜高粱作为能源质作物相较于甘蔗、甜菜、玉米等具有如上很多优势,但另 一方面甜高粱作为生物质能源生产的原料仍存在许多技术难题亟待突破和解决。首先, 甜高粱品种须具有茎秆高产性,只有这样才能单位面积收获更多的原料;其次,品种茎 秆需具备高糖垂度,只有这样才能获取含糖量高的汁液进行发酵酒精,但是目前生产中 所种植的甜高粱品种汁液垂度仅能达到%左右,远远达不到生产需求;再次品种的生 育周期应该尽可能的的短,只有这样才能充分利用光能提高土地使用效率。广西引种的 甜高粱目前能种植两季一年,但由于甜高粱属于感光植物,因此第二季产量远不如第一 季高;最后,品种生产过程中应该尽可能机械化,以减少劳动力的投入,但在实际种植 过程中发现甜高粱对除草剂敏感需人工除草。只有解决了以上问题,生物质能源作物甜 高粱才能真正成为成熟的工业发酵酒精的原材料,才能真正实现市场化,才能不断推动 我国的可持续发展和绿色环保生活的进程。 甜高梁蔗稠争成酶基因的克隆及转礤陋基因研究 .蔗糖合成酶研究进展 等第一次在小麦胚芽中发现蔗糖合成酶是在年。等 证明其是由四个亚基构成的四聚体,植物组织中一般存在有两种以上形式的同工酶,在 蔗糖代谢过程中起至关重要的作用。目前,国外学者已成功将蔗糖合成酶基因从马铃薯、 .等,等作物中克隆出来。国内学者雷美 玉米、甜菜、胡萝卜和甘蔗 华等年从甘蔗品种福农.叶片中克隆出蔗糖合成酶,全长,包括前端 .的上游调控序列,共个外显子,个内含子。这结果与等克隆测序结 果相似。刘洋等年从甜高粱品种叶片中克隆了蔗糖合成酶,序列 全长,包含个外显子,个内含子。经上序列比对,发现这两者相似 度达%。 根据研究发现,利用分子生物学技术增强对蔗糖合成酶的合成进行调控,能够达到 增加成熟果实糖锤度,提高产品经济效益的目的。那么蔗糖合成酶的表达量的高低在甜 高粱茎秆中糖分积累的过程中是否也起着至关重要的作用呢,仍有待研究。通过提高甜 高粱茎秆中蔗糖合成酶的表达量能否达到提高茎秆糖锤度的目的,现在还无从得知。而 甘蔗蔗糖合成酶编码序列前端存在信号盒对蔗糖合成酶表达起调控作用。利用转基 因技术,将甘蔗蔗糖合成酶基因及前段调控序列转入甜高梁特定品种中去,是否能获得 高含糖量的甜高粱特定品种,目前仍是个迷。 .植物转抗除草剂基因研究进展 化学除草剂是目前农业生产上应用最广的除草方法,但有些作物对除草剂并 不具备 抗性,因此对于此类作物的日常生产过程中的除草,化学除草剂在使用过程中具有一定 的局限性。有专家即对此种情况提出了针对性的选育具有除草剂抗性的作物的解决方 法。具有此种想法的美国抗草甘膦大豆已成功市场化,但我国还没有成熟的市场化抗除 草剂甜高粱品种,且甜高粱对除草剂敏感,在日常生产过程中如何高效除掉杂草仍是个 亟待解决的问题。因此培育出对除草剂具有抗性的甜高粱品种对其作为生物质能源作物 能否大规模的进行种植并最终形成成熟的发酵乙醇工业生产链起着至关重要的作用,并 对我国的可持续发展及绿色环保生活的推动有着深远的意义。 ..抗除草剂基因及其作用机制 现今已知的抗除草剂基因有以下几类:.抗草丁膦、双丙氨酰磷类:;. 抗草甘膦类:、;.抗磺酰脲类:.、?和;.抗三氮苯、阿 西大掌硕士学位论文 甜高梁蔗翱鲁.成酶基因的克隆及转点孵基因胃”电 特拉津等类::.抗,.类:班;.抗溴苯晴等类:王宜林等,。抗 除草剂因参与植物应对除草剂伤害的作用机理有以下两种:其一,通过对除草剂敏感的 靶蛋白进行修饰使其对除草剂过量表达或者是不敏感;其二,通过引入外来酶或者酶系 统,使除草剂对植物造成伤害作用前就使其分解或者解毒。培育植株对草甘膦的抗性通 过以上两个方面的作用机理研究,现已有三种成功方法:其一,陈梁鸿将 基因用基因枪法转入小麦幼穗及幼胚中,筛选后获得的再生植株具有草甘膦具有抗性; 其二,通过改变基因的作用位点使植株对一定浓度的草甘膦具有抗性 .,’;其三,导入外来基因编码草甘膦氧化还原酶基因也可以使植株 对一定量的草甘膦产生抗性等,。 ..转抗除草剂基因作物研究进展 刘敏等将个黑龙江省大面积种植的大豆品种与个抗除草剂大豆品种杂 交,对、、和的抗性特征进行了统计分析和遗传分析,得出结论:抗除草 剂基因是一对显性基因且遵循孟德尔遗传规律。唐微通过农杆菌介导法将 基因转入某水稻品种中,及杂交结果表明基因已整合到该品种基因组 中,发芽试验表明其具有抗性。刘小红等用基因枪法将质粒上的 基因导入了玉米愈伤组织中,进行次筛选后诱导分化,移栽大田后进行、 杂交及大田抗性鉴定,证明基因已整合至玉米基因组中且表达。抗除草剂玉米品种 在美国已经成功市场化,中国农科院与北京大学等合作也已成功培育出转合成 酶基因康草甘膦玉米,对进行具有自主知识产权的抗除草剂转基因作物具有 重大意义。 ..甜高粱再生体系研究进展 近年来,甜高粱作为具有广阔前景的生物质能源植物引起了广泛关注,关于甜高粱 组织培养方面的研究已有了重大突破,通过添加不同配比激素已获得甜高粱再生植株。 甜高粱组织培养中所用外植体多样,有幼穗、未成熟胚、成熟胚、茎尖、种子、幼 叶、花药、幼苗等。王良群等发现利用幼穗作为外植体获取的愈伤组织具有较 高的分化效率,但受幼穗取材时间、基因型与愈伤组织关系条件等影响较大,且幼穗诱 导愈伤组织时存在随着继代的增多,愈伤组织的胚性会逐渐丧失,因此幼穗作为甜高粱 组织培养中的外植体仍有很多问题不可解决。 植物激素在细胞分裂与伸长、组织与器官分化、开花与结实、成熟与衰老、休眠与 萌发及组织培养等方面起相互协调控制植物生长、发育重要作用。 不同品种来源的甜高粱诱导愈伤组织的植物激素配比也大相径庭。 甜高梁蔗翱争成酶基因的克隆及转礤陋基因研究 利用个基因型甜高粱品种在含,。的培养基中培养,获得胚性愈伤并获得再生 植株,但并未对诱导愈伤组织及分化出苗作详细描述。葛玉红利用甜高粱种 子 作为外植体诱导出胚性愈伤组织并诱导出丛生苗,其中最佳愈伤组织诱导配方为: ./ ./,诱导愈伤组织培养基中添加会降低其胚性愈 伤组织诱导率,丛生芽最佳诱导培养基配方为:./ ../ 。杨立恒等 ./ ,生根培养基为:为/./ 通过对新疆伊犁哈萨克自治州农业科学研究所提供的、、、四个品 种的甜高粱进行不同配比的植物激素及不同浓度的蔗糖诱导愈伤组织的研究得出最佳 诱导愈伤组织培养基为/ ./蔗糖。赵立铭等通过对甜高粱 品种考利和.诱导愈伤组织培养基的研究得出最佳愈伤组织诱导培养基为 ,.,最佳愈伤组织诱导分化的培 ./脯氨酸/水解酪蛋白./ 。 养基为 / ./ .本研究目的、意义及创新点 由于甜高粱耐旱、耐盐碱地、高光能利用率等特点,甜高粱是我国发展生物质能源 作物的最优选择。但在实现甜高梁茎秆发酵酒精的成熟市场化进程中仍存在一些亟待解 决的问题。譬如:培育出糖锤度的甜高梁品种,降低甜高粱对光的敏感度使其在短日照 条件下能继续营养生殖等。 本研究共包括部分内容。第部分内容计划以甜高粱北甜三号基因组为模 板克隆蔗糖合成酶基因全部序列及其前端的调控序列,为实验室后期的研究进行铺垫; 第部分内容旨在摸索甜高粱北甜三号的转化体系,其中包括了诱导愈伤组织的高效培 养基、分化培养基;第部分内容为农杆菌介导的转抗除草剂基因。本实验希望 通过以上方面的研究,一方面获得蔗糖合成酶编码序列与其前端调控序列为实验室后 期从分子水平上研究北甜三号蔗糖酶表达与茎秆糖分积累之间的关系的研究打下基础; 另一方利用农杆菌介导转抗除草剂基因获得抗除草剂的转基因北甜三号组培苗, 并达到建立甜高粱北甜三号的转基因平台的目的,从而为今后本实验室继续进行北甜三 号的遗传改良打下坚实的基础。 本实验室为首次克隆甜高梁北甜三号的蔗糖合成酶编码基因及其前端部分序列,前 期只有刘洋等克隆过甜高粱品种 的蔗糖合成酶编码序列。因此 虽然蔗糖合成酶基因是个高保守基因,但仍存在差异。此研究可帮助我们了解不同甜高 广西大掌硕士掌位论文 甜高梁蔗糖合成酶基因的克馕及转尸陋基因研究 粱品种之间蔗糖合成酶基因编码区的差异,并首次获得编码蔗糖合成酶基因前的部分序 列。农杆菌介导的转抗除草剂基因为首次甜高粱转抗除草剂基因实验,未见相关报道。 甜高梁蔗糖合成酶基因的克隆及转五硭 陋基因研究 北甜三号蔗糖合成酶基因克隆 .材料与方法 ..植物材料 甜高梁品种北甜三号 ..质粒与菌株 购白上海生工生物技术服务有限公司的.载体与本实验室保存的大肠 。 杆菌菌株 ..酶、试剂和培养基 购于北京天恩泽公司的片段回收试剂盒,购于上海生工生物工程技术服务有限 公司的、、,以及购于公司的?高保真酶。 常用溶液、缓冲液均用蒸馏水配制, 压力下湿热灭菌分钟。常用试剂如 下: ×: / .,/ ,./ ,%,%, .%一巯基乙醇; 氯仿/异戊醇::配置此体积比的氯仿/异戊醇需氯仿 ,异戊醇 ; / %,./ ; / ., / 溶液: ,.; 异丙醇;%乙醇; ×: . ,. 硼酸, /.,使用时稀释倍; , . 冰醋酸,使用时稀释 ×. /.,. 倍; 一溴氯一吲哚半乳糖苷贮备液:用二甲基甲酰胺配制 / 浓度的.母液,装入离心管中,装溶液的离心管应以黑色遮光纸包裹,这是由 于易于见光分解。之后将其置于一?条件下保存。注:配制时使用灭菌水, 因 此不必过滤除菌; 异丙基硫代一半乳糖苷溶液:将. 溶于 水中,加水至 ,配成 的一次性滤器过滤除菌后分装,保存于.?; /。用. .无菌;培养基。 广西大掌硕士掌位论文 甜高梁蔗糖合成酶基因的克隆及转点尸陋基因研究 ..实验方法 ...从甜高粱北甜三号叶片中提取总基因组 采用×法提取甜高粱北甜三号总基因组:首先,用灭菌剪刀剪碎. 左右擦拭干净的北甜三号,用液氮研磨成粉;之后将磨碎的甜高粱叶片粉末 放入离 心管中,加入预热的×提取液,于?条件下温育,期间摇动~次,以使 与基因组充分结合;再加入等体积氯仿/异戊醇:溶液,/条 件下离心分钟;然后取上清于新的灭菌离心管中,加入.倍体积的/溶 液,于。条件下温育~分钟;之后加入等体积氯仿/异戊醇:,/条 件下离心分钟;取上清液,重复第五个步骤次;取上清,加入.倍体积异丙醇预 冷.中放置分钟,后于/条件下离心分钟,弃溶液;最后用%乙 醇洗次,室温干燥分钟后加入溶液,用移液枪反复轻轻吹打直至溶 解,置于.。条件下备用。使用之前用琼脂糖凝胶电泳法检测提取的总基因的 完 整性及浓度。 ...引物设计 根据上已知甘蔗蔗糖合成酶基因组序列,第对引物从 第个外显子开始,第对引物从信号盒开始,利用网站上的引物设计软 件设计了对特异性引物,由上海生工合成。 第对从至::钢汀 上游引物 下游引物: 第对从至 : 上游弓物 下游引物 ... /反应体系 表.蔗糖合成酶基因的反应体系 . 体积 反应物 甜高梁蔗糖合成酶基因的克隆及转脚基因研究 续上表/ // / 按以下程序完成目的基因的扩增:.预变性:。条件下分钟;.变性: ?条件下秒;.退火:?条件下秒;.延伸:?条件下分钟个循环; .?条件下延伸分钟。 最后进行.%琼脂糖凝胶电泳产物检测,以确定是否含有目的片段。 ... 产物的回收 用%琼脂糖凝胶进行产物电泳后,使用北京天恩泽公司生产的回收试剂 盒纯化回收产物。具体步骤如下:首先是切胶,将含有目的片段的凝胶切下尽 量切薄放置于.离心管中,用墙头捣碎之后按:~::比例加入通用溶 胶液;后将离心管置于?条件下温育分钟左右,待管中含目的片段凝胶完全 融化即 可可轻轻晃动;然后将离心管中的溶液转移至离心吸附柱中后静置分钟左右, 将 吸附柱套于新离心管中,并置于条件下离心分钟,倒掉收集管中液体;再 于吸附柱中加入..通用洗柱液,静置分钟;之后将其置于条件下 离心分钟,倒掉离心管中的溶液;继续套离心管的吸附柱置于条件下离心 秒,并倒掉收集管中的溶液;再将离心吸附柱置于新的离心管中,加入已于 ?~。条件下预热的通用洗脱液,静置分钟;最后将其置于条件下离心 分钟,离心管中即纯化后的目的片段。 ...连接克隆载体 表连接反应体系 .. 体积 反应物× 西大掌硕士掌位孛龟文 甜高梁蔗糖合成酶基因的克隆及转酗基因研究 续上表 %按上表顺序添加反应物,最后加入连接酶 后,轻轻混匀,瞬时离心使液体置 于 管底,之后置于?~?条件下连接过夜。实验过程中注意设置对照。 ...大肠杆菌感受态细胞制备 配置大肠杆菌接种培养基固体培养基需胰蛋白胨,,酵母提 取液,琼脂糖/,之后定容调至.。 挑取大肠杆菌单菌落接种于液体培养基中不含抗生素,之后置于? 条件下振荡过夜培养。从过夜培养液按:的稀释比例加入新鲜培养 液中,。 分钟左右,待菌达到对数期.. 条件下振荡培养 时,将培养液转移至两只条件下预冷的无菌离心管中,置于冰上分钟左右, 使菌液冷却至,之后将离心管于。 条件下离心分钟,弃上清液。然 后给每只离心管中各加入的?条件下预冷的./无菌,将菌液混匀重 悬,冰浴分钟后置于 条件下离心~分钟,弃上清液。然后将每只离 心管中各加入.的?条件下预冷的无菌./将菌体重悬,冰浴分钟 后可以直接用于转化,也可以加入无菌甘油混匀后,按每管各分装于无菌 .离心管中,置于.条件下保存备用。 ...大肠杆菌感受态细胞的转化 首先准备含/卡纳霉素的培养基选择平板,每块板约培养基,凝 固后在平板上滴加 %,之后用酒精灯烧过灭菌的玻璃涂布棒 %., 将上述两种液体涂布均匀并晾干。取两管制备好的大肠杆菌感受态,插入冰中, 冰浴分钟,之后一管加入~过夜连接的连接产物,一管加入相应体积的空白对 照轻轻振荡后放置于冰上分钟,期间间或摇晃数次使其均匀混合。将感受态与连接 混合液轻轻摇匀后插入。条件下水浴秒进行热休克,然后将其迅速放回冰中,静 置分钟。再在超净工作台中向上述各管中分别加入新鲜的灭菌液体培养基 不含抗生素轻轻摇匀,然后固定到摇床的弹簧架上在?条件下振荡小广西大学硕士掌位论文 甜高梁蔗糖合成酶基因的克隆及转娜基因研究 时~小时。振荡后取各上述混合液左右,分别滴加在预先准备好的选择平板上, 涂布均匀。将涂好的培养皿做上标记,先放置在?恒温培养箱中分钟~分钟直 至培养基表面液体都渗入到培养基中后,再倒置于恒温培养箱中过夜培养小 时~小时。最后观察平板上长出的菌落克隆,挑取白斑菌落于。 印条件下 摇菌过夜,后进行菌液检测。 ...测序分析 菌液送往上海生物工程有限公司进行双向测序。然后用分子生物学软件 将测序结果进行拼接。 .结果与分析 ..甜高粱基因组 如图.所示,泳道、、、、、中甜高粱品种北甜三号基因组条带较 为清晰,由此可推断出以上泳道对应提取的基因组质量较好能够满足下一步 目的 片段体外扩增需求;泳道和泳道中条带存在严重降解拖尾现象,可知其对应 提取的基因组不适宜下步目的片断体外扩增需求。 .甜高粱品种北甜三号基因组电泳图谱.? .. 结果 按反应体系加样,根据引物合成单反复摸索退火温度。最终在退火条件 下进行实验能获得较为理想的目的片段。电泳检测结果如图.、图.所示。 。 图.中泳道和泳道即为第对引物的结果,泳道为 从图中可看出第对引物能扩增出约为.的基因片段,初步认定其为目的片段。 图 .中泳道、、、、均为第对引物的电泳检测结果,泳道和泳道为使 。图中未见.左右的基 用的基因组电泳结果,泳道为 广西大掌硕士掌位论文 甜高梁蔗糖合成酶基因的克隆及转礤陋基因研究 因片段,且基因组片段完整,因此第对引物不能扩增出目标大小的基因片段。 . 图.第对引物产物 图.第对引物产物 . . ..序列测定与分析 经分析:此序列全长,起始密码子至终止密码子共,共编码个 氨基酸。经由比对后发现该序列与上已登录的甜高粱品种 相似 度达%,与玉米蔗糖合成酶基因序列相似度达%,表明该序列应该为甜高梁北 甜三 号蔗糖合成酶基因,且说明了蔗糖合成酶基因具有保守性。 .讨论 本部分实验的目的是为了获取含调控序列的甜高粱北甜三号的蔗糖合成酶 序列。根 据已存的甘蔗蔗糖合成酶序列,利用上引物设计软件设计了对引物。其 中第对引物能扩增获得目的片段。经测序检测后与已登录的甜高粱品种 的蔗糖合成酶编码序列进行比对,相似度达%,可以确定其为甜高粱北甜三 号的蔗糖合成酶序列。此序列共计,起始密码子至终止密码子共,共编 码个氨基酸。在编码区前端有序列,其具体作用不知。张玉静提出生物在 面临自然选择压力时,基因序列倾向于保守化,基因越重要保守性越高,也许 这就是不 同物种的蔗糖合成酶基因相似度高的原因。 广西大掌硕士学位论文 甜高梁蔗糖合成酶基因的克隆及转嬲基因研究 等提出等位基因变异现象存在于大多数植物中,而这种等位基因变异与表形 性状具有一定的相关性,因此可利用这种差异性进行功能标记的开发。刘洋等曾试图通 过分析甜高粱蔗糖合成酶基因等位变异情况进行含糖量相关的功能标记开发,但对 个糖锤度不同的甜高粱品种的蔗糖合成酶基因上游序列进行分析,并没有发现等位变异 现象,与上公布的个普通高粱品种的蔗糖合成酶基因进行比对得出完全一致的 结论。本实验获得的北甜三号蔗糖合成酶基因与上登录的甜高粱品种的蔗糖合成 酶基因存在差异,这种差异也许是等位基因变异造成的,也许是测序结果存在误差。 广西大.孽蝇页士掌位论文 甜高粲蔗棚争成酶基因的克隆及转裕基因研究 甜高粱品种北甜三号再生转化体系的建立 基因型不同的甜高梁,其再生体系也存在些许差异。主要表现为诱导愈伤组织培养 基和分化培养基中激素浓度配比不同。本部分实验内容即根据前人的研究围绕以上方面 对北甜三号的再生转化体系进行研究。 .材料与方法 ..实验材料 甜高粱品种北甜三号的种子本实验室进行甜高粱广西引种时选出的糖垂度、茎秆 产量和粮食产量都较优的品种。 ..实验方法 ...外植体的消毒 挑选成熟饱满的甜高粱品种北甜三号种子作为外植体,用自来水冲洗干净后浸泡备 用。在无菌条件下用.%升汞处理分钟,期间间断晃动,使升汞能更好的作用于 种子,消毒效果更好。之后倒掉.%升汞溶液,用无菌水冲洗遍。 ...不同浓度配比的生长素与细胞分裂素诱导胚性愈伤组织的培养基筛选 将外植体先接种于不同浓度配比的植物激素愈伤组织诱导培养基上,培养周后 统计种子发芽率及诱导胚性愈伤组织出愈率。每组配方共计重复三次试验,每次试验中 每组配方设置个重复,且都采用同一批种子。胚性愈伤组织外表呈鲜亮的淡黄色, 颗粒状。按以下进行出愈率及胚性愈伤组织率计算: 出愈率愈伤组织的产生数量/发芽种子数量×% 胚性愈伤组织率胚性愈伤组织产生量/发芽种子数量×% 注:污染结果也统计在内。用软件处理后期数据,进行一般线性模型多因子方差 分析。 在尝试前言中所提到的诱导愈伤组织培养基配方后,胚性愈伤组织获得率不高,大 部分为不具有胚性的愈伤组织。因此设计了组诱导愈伤组织培养基配方表.以 探索北甜三号最佳胚性愈伤组织的诱导配方其中包括了前言中提到的配方。实验选 取不同浓度的,.、、。为基础培养基。广西大学硕士学位论文 甜高梁蔗糖合成酶基因的克隆及转删叁垦塑塞 表.愈伤组织诱导培养基 .. ...愈伤组织的继代 从诱导出的愈伤组织中挑选淡黄色颗粒状无水渍的胚性愈伤组织转接到新的继代 增殖培养基上继代培养基配方同最佳诱导愈伤组织培养基配方相同。于?左右, 光照为 条件下下继代培养。 ...不同浓度配比植物激素诱导胚性愈伤组织分化的培养基筛选 将诱导出的色泽鲜艳、蛋黄色颗粒状无水渍的胚性愈伤组织接种至分化培养基上。 于?左右,光照为 ~、光周期为 /光暗交替条件下培养。每瓶接 种团胚性愈伤组织,每个配方共计重复三次试验,每组配方设置个重复,接种 周后对愈伤组织分化率进行统计污染结果仍计算在内。按以下公式计算分化 率: % 愈伤组织分化率愈伤组织分化量/接种愈伤组织× 注:用软件处理后期数据,进行一般线性模型多因子方差分析。 尝试前言中提到的诱导愈伤组织分化的配方后并不能获取高分化率,因此设 计了 组配方见表.,探索最佳愈伤组织分化配方,实验因素选取不同浓度的、、 。为基础培养基。 甜高梁睁糖合成酶基因的克喇及转点礤陋基因研究 表.诱导愈伤组织分化培养基配方 .. ’ ...诱导生根试验 将诱导出的丛生苗切开,并接种于生根培养基上。于。左右,光照为 ~、光周期为 /光暗交替条件下培养。 根据前言中所提到的生根培养基配方能获取高效生根率,因此采用此配方进 行生根 。 试验。配方为:/ .实验结果与分析 ..不同浓度配比的.与对北甜三号愈伤组织诱导的影响 将接种含不同浓度配比的,.与培养基的北甜三号种子愈伤组织诱导结果 进行统计,计算诱导愈伤组织率后,进行一般线性模型多因子方差分析。具体 分析结果 见表及表.。 从表.中可以看出,变异来源,的显著值.为..,有显著 意义;变异来源的显著值.为..,有显著意义;变异来源,一 的显著值.为...,具有显著意义。这说明.与浓度的改变 对愈伤组织率有显著影响,且不同浓度的,.与配比之间存在相互作用对愈伤 组织率有显著影响。 由表.统计量分析可知,当浓度为./浓度为./时,愈伤 广西大学硕士掌位论文 甜高梁蔗糖合成酶基因的克隆及转脚基因研寝 组织率的均值达到最大.。结合表.的分析结果,可知诱导愈伤组织最佳,一 。 与浓度配比培养基配方:.‖ .‖ 表.方差分析表 洳 疋出. 表. ,.和诱导愈伤组织率统计量表 ., ..不同浓度配比的.与对北甜三号胚性愈伤组织诱导的影响 将接种含不同浓度配比的,.与培养基的北甜三号种子诱导胚性愈伤组织 数据进行统计。计算诱导胚性愈伤组织率后,进行一般线性模型多因子方差 分析。具体 甜商架蔗糖合成酶基因的克隆及转隆 陋基因研究 分析结果见表及表.。 从表中可以看出,变异来源.的显著值.为..,有显著 意义;变异来源的显著值.为...,有显著意义;变异来源. 的显著值.为..,具有显著意义。这说明.与浓度的改变对胚 性愈伤组织率有显著影响,且不同浓度的,.与配比之间存在相互作用对胚性 愈伤组织率有显著影响。 由表.统计量分析可知,当浓度为./浓度为./时,胚性 愈伤组织率的均值达到最大.。结合表的分析结果,可知诱导胚性愈伤组织最 。 佳,.与浓度配比培养基配方:./ 一./ 表方差分析表 .表. ,.和诱导胚性愈伤组织率统计量表 .,. % / / 甜高梁蔗糖合成酶基因的克隆及转点尸稻基因研究 广西大掌硕士学位论文 续上表 ..不同浓度配比的.与对北甜三号愈伤组织诱导的影响 将接种含不同浓度配比的,.与培养基的北甜三号种子愈伤组织诱导数据进 行统计。计算诱导愈伤组织率后,进行一般线性模型多因子方差分析。具体 分析结果见 表.及表。 从表.中可以看出,变异来源,.的显著值.为...,有显著 意义;变异来源的显著值.为..,有显著意义;变异来源. 的显著值.为...,具有显著意义。这说明.与浓度的改变对 愈伤组织率有显著影响,且不同浓度的,.与配比之间存在相互作用对愈伤组 织 率有显著影响。 由表统计量分析可知,当,一浓度为.,浓度为./时,愈伤 组织率的均值达到最大.。结合表.的分析结果,可知诱导愈伤组织最佳,.与 。 浓度配比培养基配方:./ ,. 表.方差分析 . 撕 表 .和诱导愈伤组织率统计量表 . ,木 查查苎塑查堂垡鲨塞 甜高架暴糖合成酶基因的克隆及转嬲基因研究 续上表 ..不同浓度配比的.与对北甜三号胚性愈伤组织诱导的影响 将接种含不同浓度配比的,.与培养基的北甜三号种子愈伤组织诱导数据进 行统计。计算诱导胚性愈伤组织率后,进行一般线性模型多因子方差分析。 具体分析结 果见表.及表。 表.中可以看出,变异来源,.的显著值.为...,有显著 意义;变异来源的显著值.为...,有显著意义;变异来源,. 的显著值.为...,具有显著意义。这说明.与浓度的改变 对胚性愈伤组织率有显著影响,且不同浓度的,.与配比之间存在相互作用对 胚 性愈伤组织率具显著影响。 由表.统计量分析可知,当浓度为./,浓度为./时,胚性 愈伤组织率的均值达到最大.。结合表.的分析结果,可知诱导胚性愈伤组织 。 最佳.与浓度配比培养基配方:./ ./ 表.方差分析表 .? 甜高梁蔗糖合成酶基因的克隆及转艘墨囤堑塞 广西大学硕士学位论文 续上表 . . . . . . . . . 表. .和诱导胚性愈伤组织率统计量表 .. ,宰. % ,.// ..不同浓度配比的与对北甜三号胚性愈伤组织分化率的影响 将接种含不同浓度配比的与培养基的诱导胚性愈伤组织分化数据进行统 计。计算愈伤组织分化率后,进行一般线性模型多因子方差分析分析。具体 分析结果见 表.及表.。 表中可以看出,变异来源的显著值.为.一.,有显著意 义;变异来源的显著值.为...,有显著意义;变异来源. 的显著值.为.一.,具有显著意义。这说明与浓度的改变对 胚性愈伤组织分化率有显著影响,且不同浓度的与配比之间存在相互作用对 胚性愈伤组织分化率具显著影响。 由表?统计量分析可知,当浓度为./,浓度为./时,胚性 愈伤组织分化率的均值达到最大.。结合表.的分析结果,可知诱导胚性愈伤 广西大掌硕士掌位论文 甜高梁蔗稠分成酶基因的克硅:及转凫基因研究 。 组织分化最佳与浓度配比培养基配方:./ ./ 表.方差分析 .? . . . . .. . . . . .. 宰. . . . . . 表. 和诱导胚性愈伤组织分化率统计量表 . ..不同浓度配比的与对北甜三号胚性愈伤组织分化率的影响 将接种含不同浓度配比的与培养基的诱导胚性愈伤组织分化数据进行 甜高梁蔗糖合成酶基因的克隆及转礤陋基因研究 统计。计算愈伤组织分化率后,进行一般线性模型多因子方差分析。具体分 析结果见表 .及表.。 表.中可以看出,变异来源的显著值.为...,有显著 意义;变异来源的显著值.为...,有显著意义;变异来源 .的显著值.为...,具有显著意义。这说明与 浓度的改变对胚性愈伤组织分化率有显著影响,且不同浓度的与配比之间 存在相互作用对胚性愈伤组织分化率具显著影响。 由表?统计量分析可知,当浓度为./,浓度为./时,胚性 愈伤组织分化率的均值达到最大.。结合表.的分析结果,可知诱导胚性愈伤 。 组织分化最佳与浓度配比培养基配方:., . 表.方差分析 .? 表. 和诱导胚性愈伤组织分化率统计量表 .? 广西大学硕士学位论文 甜高梁蔗糖合成酶基因的克硅及转琢陋基因研究 续上表 ...诱导生根 能获取高效生根率。如图.所 根据前面所提到的生根培养基配方/ 不。 图诱导生根 。讨论 一个高效的再生体系是遗传转化体系的关键。本部分实验在葛玉红等已有的 实验结 果上探索北甜三号高效再生体系的建立。 甜高粱北甜三号是本实验室进行甜高粱广西引种过程中筛选出的各方面性 状都较 优的品种。刘明等通过对高粱不同外植体幼胚、种子进行愈伤组织诱导,得 出结论: 幼胚的诱导效果最好。但由于季节、发育时期等因素限制,成熟种子作为外植体来说更 具便捷性。因此本实验采用了北甜三号种子作为供试材料。 本实验最初采用了葛玉红等的诱导甜高粱北甜三号愈伤组织的培养基配方含有 甜高梁蔗糖合成酶基因的克隆及转礤瑙基因.究 的培养基进行胚性愈伤组织诱导,但并未能获得大 . ..、./ 量胚性愈伤组织,出现此种情况的原因也许是实验采用的种子来源不同。赵立铭等 汀的培养 进行甜高梁再生体系的研究得出含有./ .和./ 基能诱导出良好的愈伤组织。因此,本实验进行了.、组合与.、组 合的配方筛选试验。经试验得出这两种激素组合在一定浓度配比下均能高效诱导出北甜 三号愈伤组织,但诱导胚性愈伤组织率却大相径庭。其中.在诱导胚性愈伤组织中 起重要作用。这与赵立铭关于甜高粱再生体系建立的研究结果具有一致性。两相比较, ,.、组合最佳配方胚性愈伤组织诱导率高于.、组合,数据分析与本 次实验结果相同。,.与组合诱导的愈伤组织大多不具有胚性,常为灰白色水渍 状膨大细胞团,在接种前期就大量增殖。本次实验中最佳诱导北甜三号胚性愈伤组织培 。 养基配方为:./ .. / 对北甜三号胚性愈伤组织进行了诱导芽与胚状体的分化培养,得出结论:、 组合与、组合均能高效诱导北甜三号胚性愈伤组织分化,但胚性愈伤组织分 化率却不尽相同。其中与组合诱导胚性愈伤组织分化最佳培养基配方的胚性 愈伤组织分化率均值为.;与组合诱导胚性愈伤组织分化最佳培养基配 方的胚性愈伤组织率均值为.。两相比较,、组合最佳配方胚性愈伤组 织分化率高于、组合,数据分析与本次实验结果相同。因此,本次实验中最 。 佳诱导北甜三号胚性愈伤组织分化培养基配方为:./ ./ 赵立铭等进行甜高粱再生体系建立时采用的甜高粱品种为考利和.,葛玉红等 采用的甜高粱品种为辽甜三号和北甜三号,由于品种的不同,培养基配方也具有很大的 差异性。本实验在进行北甜三号再生体系建立时,采用了葛玉红等的北甜三号培养基配 方,但并未获得相同的结论,其中的原因未知。 堕查整塑坌堂垡拎文 甜高梁蔗糖合成酶基因的克隆及转嬲基因研究 北甜三号农杆菌介导的转抗除草剂基因 .实验材料与方法 ..植物材料 甜高梁品种北甜三号 ..质粒与菌株 实验室已存的由谢鸿锴师兄构建的含.重组质粒剧强盼为 。 抗草甘膦基因的大肠杆菌菌株 ..酶和试剂 ,,北京天恩泽公司的质粒提取试剂盒及培养基。 ..实验方法...获取.只只重组质粒 将含有.重组质粒的大肠杆菌菌液从.?冰箱中取出,之后于 超净工作台中在平板含上划线筛选。待菌落长出后挑单克隆于。 条件下摇菌过夜。 之后用试剂盒提取重组质粒。具体方法如下:首先,用离一管收集~ 菌液在条件下离心分钟后弃上清液,反复次,之后再瞬时离心,吸取 残留液体;然后在离心管中加入预冷溶液冰上重悬用漩涡振荡器振荡重 悬或是用枪吸打重悬都可以;之后于离心管中加入溶液,温和反复颠倒混匀 次,直到溶液变粘稠即可,然后将离心管置于冰上放置不超过分钟由于溶液 中含有,因此放置时间不宜过长;再在离心管中加入冰上预冷的溶液, 反复颠倒次使溶液混合均匀期间可见肉眼可见的白色沉淀产生,将离心管置 于冰上 。条件下离心分钟;然后将上清液转移至套上新离心管的 分钟后,在 吸附柱上,静置分钟使质粒与吸附柱结合此步骤很重要;将套上离心管的吸 附柱 。条件下离, 分钟,弃离心管中液体;再加入洗柱液于吸附柱中 于 于 条件下离心分钟,弃离心管中液体,重复此步骤次后在 ?条件下离心分钟以甩干残留液体:最后将吸附柱套上新离心管,在吸附柱 中心加入 于~。条件下预热的洗脱液,静置分钟后置于条件下离心分 钟,离心管中即为目的质粒,以备后面实验使用。 将提取的质粒部分进行双酶切鉴定,看其是否为含基因的重组质粒,酶切 甜高梁蔗糖合成酶基因的克隆及转劂基因研塞 反应体系如表所示。 表.双酶切反应体系. 体积 成分 质粒 × 侬 . . ...