【最新word论文】仙台病毒载体对未成熟树突状细胞蛋白表达的影响【医学专业论文】

【最新论文】仙台病毒载体对未成熟树突状细胞蛋白表达的影响【医学专业论文】 仙台病毒载体对未成熟树突状细胞蛋白表达的影响 作者:易发平 张平波 郭风劲 马永平 宋方洲 【关键词】 仙台病毒载体;树突状细胞;蛋白质组 【Abstract】 AIM: To investigate the protein changes in immature dendritic cells (DC) infected with sendai virus vector. METHODS: The total cellular proteins were collected and determined in the immature DC infected with sendai virus vector and the control ones uninfected with it. They were separated using 2dimensional gel electrophoresis (2DE) and visualized by silver staining. Digital images were analyzed by PDQuest software. The differentially expressed protein spots were picked and digested in gel, followed by identification with peptide mass fingerprinting (PMF) using MALDITOF MS. RESULTS: More than 40 protein spots disappeared in 2DE of the treated group. Among them 5 protein spots that were apparently not expressed were identified by PMF. CONCLUSION: Protein expression decreased in DC infected with sendai virus vector. 【Keywords】 sendai virus vector; dendritic cell; proteomic 目的:研究仙台病毒载体对未成熟树突状细胞(DC)蛋白质表达的【摘要】 影响. 方法:提取转染仙台病毒载体的树突状细胞和对照细胞的总蛋白，定量. 双 向凝胶电泳分离蛋白质组分，胶体银染显色，PDQuest进行图像后选取差异 点，胶内酶解后MALDITOF MS进行肽指纹图谱鉴定. 结果:图像分析结果显示， 处理组2DE图缺少了40个以上的蛋白点，对其中明显没有表达的5个蛋白点进行 了鉴定. 结论:仙台病毒载体感染未成熟树突状细胞可引起蛋白表达的减少. 【关键词】 仙台病毒载体;树突状细胞;蛋白质组 0引言 随着人类基因组的成功实施，各国科学家将生命科学的战略重点转到以 阐明人类基因组整体功能为目标的功能基因组学上. 蛋白质作为生命活动的“执 行者”，自然成为新的研究焦点. 以二维电泳(2DE)为核心的蛋白分离技术和以 质谱方法为主的蛋白质鉴定技术等技术体系已基本成熟. 树突状细胞(DC)是至 今发现最强的抗原递呈细胞，在国内外都已将其作为肿瘤疫苗应用于基因治疗. 仙台病毒载体是细胞质型RNA载体，对各种动物细胞有较高的感染效率;它本身 不进入细胞核内，在细胞质中进行基因表达;在理论上不存在改变细胞核内染色 体的危险性，与以往的载体相比具有更高的安全性. 我们通过蛋白质组学方法来 研究仙台病毒感染树突状细胞后蛋白表达变化，为联合运用树突状细胞和仙台病 毒进行基因治疗的提供了实验依据. 1材料和方法 1.1材料C57BL/6小鼠，6~8周龄，雌性，由日本SLC株式公司培育. IPG胶 条购于Amersham Pharmacia Biotech (Uppsala, Sweden)，trypsin(测序级) 购于Promega (Madison, WI, USA)， CHAPS，DTT，TEMED，BIS购于BIORAD，TFA 购于Sigma，其余试剂采用国产分析纯. 1.2方法参照文献,1,方法培养C57BL/6小鼠来源的DC. 小鼠骨髓细胞，在 含IL4 25 U/mL，GMCSF 250 U/mL的1640培养基中于37?的CO2培养箱培养， 1 第4日更换一半培养基，第7日回收细胞. 每1×106细胞加100 μL 1640培养基，感染仙台病毒(感染重数，multiply of infection, moi=40)，37? 1 h，收集细胞. 用醋酸镁缓冲液冲洗收集到的细胞数次，参照文献,2,方法提取蛋白，并测定蛋白浓度，样品于-70?冻存备用. 双向电泳参照Amersham公司技术手册，18 cm pH 3,10胶条，上样体积350 μL，上样量100 μg，一向等电聚焦设置50 V 12 h;500 V 1 h;1000 V 1 h;4000 V 1 h;6000 V 1 h;8000 V 10 h. 胶条分别在含10 g/L DTT和40 g/L IAA的平衡液(50 mmol/L TrisHCl pH 8.8，6 mol/L 尿素、300 g/L甘油、20 g/L SDS)中平衡15 min后进行第二向SDSPAGE电泳，300 g/L的丙烯酰胺，银染法检测蛋白. 重复3次. 染色后的双向电泳凝胶照相后用PDQuest软件(BioRad Laboratories, Hercules,CA)进行图像分析. 包括确定蛋白点的分子量、等电点和斑点匹配，切取重复性较好的差异蛋白点，经过脱色、胰酶酶解、浓缩后进行质谱分析. 取1 μL样品于点样盘，加入等体积基质，室温干燥后用带有PerSeptive Biosystem MALDITOF VoyagerDE RP Biospectrometry工作站(Applied Biosystems, Framingham, MA)的MALDITOF MS分析. 所得肽指纹图谱用SWISSPROT.2005.01.06 和NCBInr.2005.01.06数据库进行搜索. 2结果 仙台病毒感染未成熟DC后双向电泳图谱有差(图1). 与对照(未成熟DC 2DE图谱)比较，通过PDQuest软件分析发现，感染后的DC蛋白斑点明显全蛋白 减少，达40个以上. 蛋白质分子质量在Mr (3.0,6.6)×104，pI值主要分布于5.5,9.2间. 对其中明显未表达的5个蛋白点作MALDITOF MS分析，得到图2. 通过数据库搜索，结合2DE图谱上相应蛋白质的分子量、pI值，确定它们分别为小鼠钙粒蛋白B，磷酸丙糖异构酶，乳酸脱氢酶C链，钙磷脂结合蛋白?和白细胞介素11受体β链(表1).图1未成熟DC(A)和仙台病毒载体转染后的DC(B)的双向电泳图(略) 3讨论 钙粒蛋白B参与翻译后调控，目前有关其功能的研究报道甚少. 钙粒蛋白家族与一些肿瘤的发展相关，而且主要存在于胞浆中. 磷酸丙糖异构酶存在于细胞质基质中. 其功能是在糖酵解代谢途径中催化磷酸二羟丙酮与3磷酸甘油醛之间的相互转化，并在光合作用、糖异生等代谢途径中也催化同一反应. 已有大量的原细菌、真细菌和真核生物TIM 的研究报导. 表1仙台病毒载体转染未成熟DC后差异蛋白鉴定结果(略) 乳酸脱氢酶也存在于细胞质基质中. 其功能是在乳酸发酵过程中使丙酮酸还原成乳酸. 钙磷脂结合蛋白?是钙磷脂结合蛋白超家族中的成员,作为表皮生长因子受体酪氨酸激酶的底物, 通过阻断mRNA的合成而抑制磷脂酶A2的表达. 具有多种生物学功能，并在多种肿瘤发生早期出现表达水平的改变,尽管目前具体的机制还不清楚,但它为研究肿瘤的发生、发展、早期诊断、治疗提供了新的线索. 白细胞介素11 由骨髓基质细胞产生，分子质量约为Mr 2.3×104，是造血微环境中一个多功能的调节因子. 其受体是一种膜蛋白. 上述5种蛋白在仙台病毒载体感染后的DC中明显没有表达，而通过细胞因子诱导的未成熟DC中许多蛋白表达是明显上调的,3,，包佳玲等用结核分枝杆菌感染人源DC也发现有4种蛋白是明显上调的,4,. 这可能是因为仙台病毒的的遗 2 传物质是RNA，只在细胞质中表达，因此抑制了存在于细胞质中的蛋白表达. 我 们用敲出了仙台病毒复制序列后来感染未成熟DC的蛋白分析中也证实了这一点， 以后将陆续报道. 最近，Sandra等,5,也发现用不同的细胞因子诱导DC，其蛋 白表达差异很大. 图2蛋白点2(A)，3(B)和5(C)的肽指纹图谱(略) 致谢日本九州大学张玲博士对本实验细胞培养部分提供了大力帮助，特此致 谢. 【参考文献】 ,1, 蔡莉，惠延年，王琳，等. TGFβ2对树突状细胞表型和功能的影响,J,. 第四军医大学学报，2003, 24(13):1156-1158. ,2, Zhang PB, Kohji Y, Yoich A, et al. Proteomic Studies of Isoforms of the P25 Component of Bombyx mori Fibroin ,J,. Biosc, Biotechno, Biochem, 2005, 69(11):2086-2093. ,3, Tang Z, Saltzman A. Understanding human dendritic cell biology through gene profiling,J,. Inflamm Res, 2004, 53:424-441. ,4, 包佳玲，乐军，田野苹，等. 结核分枝杆菌感染人源树突状细胞的蛋 白质表达谱,J,. 微生物学报，2005, 45(3):415-419. ,5, Sandra RP, Vitor MF, Glauce GG, et al. Changes in the proteomic profile during differentiation and maturation of human monocytederived dendritic cells stimulated with granulocyte macrophage colony stimulating factor/interleukin4 and lipopolysaccharide,J,. Proteomics, 2005, 5:1186-1198. 3