浅论褪黑素对UUO所致肾脏氧化损伤和血液流变学变化的影响

浅论褪黑素对UUO所致肾脏氧化损伤和血液流变学变化的影响 浅论褪黑素对UUO所致肾脏氧化损伤和血液流变学变化的影响 作者: 刘昌明, 华春秀, 李着华【摘要】 目的 探讨褪黑素对单侧输尿管梗阻(Unilateral ureteral obstruction，UUO)所致肾脏氧化损伤及机体血液流变学的影响。 方法 成年健康雌性SD大鼠30只，随机分为三组: 假手术组(Sham)、模型组(UUO )和褪黑素组(Mel)各10只。UUO组 和Mel组行左侧输尿管结扎， Sham组不结扎输尿管。Mel组于术后腹腔注射Mel(10 mg/kg ?d )，UUO组和Sham组给予等量含有5%乙醇的生理盐水溶液，连 续14d后，取左肾皮质检测丙二醛(alondialdehvde,MDA)含量、超氧化物歧化 酶(superoxide dismutase,SOD)活性;腹主动脉取血检测机体血液流变学变化。结果 UUO组与Sham组比较，肾组织中MDA含量增加，SOD活性降低，全血粘度、血浆粘度和全血还原粘度升高，红细胞压积、红细胞计数和红细胞聚集指数降 低; Mel组与UUO组比较，肾脏肾组织中MDA含量降低，SOD活性升高，红细 胞计数和红细胞压积增加，全血粘度和全血还原粘度降低。结论 Mel可以减轻 UUO所致肾脏氧化应激损伤和改善UUO所致机体血液流变学变化，说明mel对梗阻性肾损伤具有明显的保护作用。 【关键词】 褪黑素 ; 单侧输尿管梗阻 ; 氧化应激 ; 血液流变学 renal oxidation damage and on Abstract Objective To study the effect of melatonin on the change of body hemorrheology induced by unilateral ureteral obstruction (UUO). Methods 30 female adult Sprague-Dawley rats were randomly divided into 3 groups: sham group, UUO group and melatonin group, 10 in each; left ureteral ligation was performed on rats in UUO group and melatonin group but not on rats in sham group; intraperitoneal injuection of melatonin (10mg/kg?d) was made to rats in melatonin after operation continuously for 14 days while the same volume of alcohol physiological saline was injected to rats in UUO group and sham group; the content of malordialdehyde and the activity of superoxide dismutase in left renal cortex were detected; blood sample was taken from abdominal aorta to detect the change of body hemorrheology. Results The content of MDA in nephridial tissue increased in UUO group while the activity of T-SOD decreased; the whole blood viscosity, plasma viscosity and the whole blood reduced viscosity increased while the hematocrit, red blood cell count and erythrocyte aggregation index decreased; in melatonin group, the content of MDA in nephridial tissue decreased, the whole blood viscosity and the whole blood reduced viscosity decreased as well while the activity of T-SOD, the red blood cell count and hematocrit increased. Conclusions Melatonin can reduce the renal oxidative stress damage induced by UUO and can improve the body hemorrheology, which suggests that melatonin is of protective effect for obstructive renal damage. KEYWORDS melatonin unilateral ureteral obstruction oxidative stress hemorrheology 单侧输尿管梗阻‎‎(Unilateral ureteral obstruction，UUO)是研究肾间质纤维化的经典模型，可以在较短时间内引起肾间质成纤维细胞弥漫性增殖，导致间质纤维化 ,1,。许多研究表明，UUO导致氧化应激反应参与了肾间质纤维化的发生发展，抗氧化应激治疗能有效减轻肾间质纤维化,2,。褪黑素(melatonin，Mel) 是强有力的抗氧化剂，能够显着减轻氧自由基的损伤，对急性肾损害具有明显的保护作用 ,3,。但对于UUO所致肾损伤是否具有保护作用目前尚未见报道。本研究采用大鼠UUO模型，观察Mel对UUO所致氧化应激反应、肾脏病理改变和机体血液流变学变化，探讨Mel对UUO所致肾氧化损伤和机体血液流变学变化的影响，为防治梗阻性肾损伤提供新的实验基础。 1 材料与方法 1(1 动物分组和给药 清洁级雌性SD大鼠30只，体重(200?20)g，分笼喂养，自由饮水、进食。将大鼠随机分为三组: UUO模型组(UUO)、褪黑素治疗组(Mel)和假手术组(Sham)各10只。UUO组和Mel组用3%戊巴比妥钠(2ml/kg)腹腔注射麻醉后，仰卧位固定于手术台上，局部备皮，75%酒精消毒铺巾，行腹部正中左侧2cm纵行切口，逐层切开皮肤、肌肉及腹壁各层。暴露并分离左侧输尿管，沿左肾下极寻找到输尿管，用4,0丝线上下结扎输尿管两处之后从两结扎点中间剪断输尿管，逐层缝合腹壁及皮肤，完成UUO模型的制作。Sham组仅开腹、游离左侧输尿管，不结扎及剪断。所有大鼠术后注射青霉素(10U/d，连续3天)预防感染。Mel组术后当天开始每日16时给予腹腔注射褪黑素10mg/kg，褪黑素先用无水乙醇溶解，再用生理盐水稀释成为含有5,乙醇的生理盐水褪黑素溶液。UUO组和Sham组每天给予等体积含有5,乙醇生理盐水腹腔注射，连续14天。 1.2 观察指标与方法 三组大鼠均于术后14天腹腔注射3%戊巴比妥钠2ml/kg麻醉，经腹主动脉采血5ml后，取出左侧肾组织，一半置于4%的甲醛溶液中固定;另一半肾脏组织放入冻存管内，置于-80?冰箱中保存备用。 1.2.1 肾组织病理 肾组织经4%多聚甲醛固定，常规脱水、透明、浸蜡，石蜡包埋，制作石蜡切片。常规HE染色方法。4μm切片行HE染色。 1.2.2 肾组织SOD和MDA的检测 取100mg肾组织制作10%组织匀浆，应用考马斯亮蓝法测定匀浆液中蛋白质的浓度;黄嘌呤氧化酶法测定肾组织SOD活性;硫代巴比妥酸(TBA)法测定肾组织MDA的含量，具体步骤以试剂盒说明书进行操作。 1.2.3 血液流变学的检测 大鼠麻醉后，经腹主动脉采血5ml以肝素钠抗凝，保持37?恒温，4小时内血液流变学检测。血液流变学采用FASCO-3010型全自动血流变快测仪(重庆大学维多生物研究所)，具体检测项目包括全血粘度高切(HSR)、全血粘度中切(MSR)、全血粘度低切(LSR)、血浆粘度(PV)、红细胞压积(HC)、红细胞聚集(AI)和红细胞变性指数(TI)等. 1.3 统计学处理 采用SPSS 14.0统计软件，对各组SOD、MDA和血液流变学指标数据进行统计学分析，所有数据均以?s表示,计量资料采用t检验，以P,0.05为差异具有统计学意义。 2 结 果 2.1 肾脏病理学改变 2. 1.1 肉眼观察 Sham组肾脏大小形态正常，颜色呈暗红色;UUO组和Mel组梗阻侧肾脏肿大，明显囊性感，颜色变浅呈灰白色，内含褐色混浊液体，剖面观察肾实质明显变薄。 2. 1.2 光镜下观察 HE染色观察显示，Sham组偶见肾小管上皮细胞空泡变性，单核细胞浸润;UUO组肾间质水肿，间质内弥漫性淋巴细胞、单核细胞浸润，肾小管上皮细胞肿胀，部分肾小管呈灶状萎缩，小管管腔闭塞和(或)扩张，肾小球病变不明显;Mel组病理变化较UUO组明显减轻，仅见肾间质轻微水肿和散在少许淋巴 细胞、巨噬细胞浸润。 2.2 肾组织SOD和MDA含量的变化 与Sham组相比，UUO组左侧肾皮质SOD活性显着降低(P,0.01)， MDA含量明显升高(P,0.05);与 UUO组相比，Mel组SOD含量明显升高(P,0.05)，MDA的含量明显降低(P,0.05)，见表1。表1 各组大鼠SOD活性、MDA含量的比较(略)注: 与Sham组相比，*P,0.01，#P,0.05;与UUO组相比，?P,0.05 2.3 血流变学的变化 与Sham组相比，UUO组全血高切、中切、低切粘度明显升高(P,0.05)，血浆粘度、全血还原粘度显着升高(P,0.01)，红细胞计数、红细胞压积和红细胞聚集指数降低(P,0.0 1、P,0.05);与UUO组相比，Mel组红细胞计数和红细胞压积增加(P,0.05)，全血高切、中切、低切粘度均降低，全血还原粘度显着降低(P,0.01)，见表2。表2 Mel对各组大鼠血液流变学的影响(略)注: 与Sham组相比，?P,0.05，?P,0.01与UUO组相比，?P,0.05，?P,0.01 3 讨 论 3.1 Mel的抗氧化损伤作用 正常情况下，肾脏的氧化/抗氧化系统保持着动态平衡，不会引起组织细胞的损伤，只有在肾脏氧自由基产生增多或者抗氧化能力下降时，才会导致肾组织细胞发生损伤。本实验中，由于结扎输尿管造成肾小球滤过率(GFR)下降和肾血流量减少，肾组织因缺血、缺氧可通过活化黄嘌呤氧化酶等途径使自由基产生增多，同时由于缺血引起内源性自由基清除系统的代谢底物(如还原型谷胱甘肽)及SOD等缺乏使自由基清除减少，组织细胞内氧自由基增多，引起肾组织过氧化损伤。 MDA和S0D是评价氧化应激水平的常用指标,4,，本实验结果显示UUO组与Sham组比较，肾组织中MDA含量升高和SOD活性降低，肾脏氧化与抗氧化平衡状态被破坏因而导致肾脏肿大，肾间质弥漫性单核细胞和淋巴细胞浸润，肾间质增宽、水肿，肾小管上皮萎缩，管腔扩张。而Mel组与UUO组比较MDA含量明显降低、SOD活性升高，肾组织损伤明显减轻，表现为间质内仅见散在淋巴细胞、巨噬细胞浸润，间质轻微水肿，说明Mel对UUO所致肾损伤具有明显的保护作用。这种作用可能与Mel的抗氧化、减轻钙超载和改善线粒体的功能状态有关,5,。 3.2 Mel对机体血液流变学的影响 脂质过氧化与血液流变学变化有着密切的关系，如缺血性脑病过程中，血液流变学的改变可以加重局部微循环障碍，增加氧自由基的产生而损伤神经细胞，伴随自由基的清除减少，发生自由基连锁反应，诱发血管痉挛，促进血管内凝血,6,。本研究结果显示UUO可导致机体发生血液流变学改变，表现为全血高切、中切、低切粘度升高，血浆粘度、全血还原粘度升高，红细胞压积、红细胞计数和红细胞聚集指数降低,这可能与输尿管结扎造成肾脏缺血、缺氧引发脂质过氧化有关。而Mel组显示全血高切、中切、低切粘度均降低，全血还原粘度显着降低，说明Mel对UUO所致血液粘度增高具有明显的改善作用。 综上所述，Mel对UUO导致的肾损伤具有明显的保护作用，其机制可能与抗氧化和改善血液流变学变化等有关。【参考文献】 ,,,Moriyama T，Kawada N，Nagatoya K，et al(Fluvastatin suppresses oxidative stress and fibrosis in the interstitium of mouse kidneys with unilateral ureteral bstruction,J,(Kidney International，2017，59(6): 2095-2103. ,2,Xie XS，Liu HC, et al(Ginsenoside Rb1, a panoxadiol saponin against oxidative damage and renal interstitial fibrosis in rats with unilateral ureteral obstruction,J,. Chin J Integr Med，2017,15 (2):133-140. ,3,Tan DX，Manchester LC，et al(One molecule，many derivatives: A never-ending interaction of melatonin with reactive oxygen and nitrogen species,J,(J Pineal Res，2017，42 (1): 28-42( ,4,张晓暄，李银辉，郑伟，等.单侧输尿管梗阻大鼠肾间质纤维化中氧化应激的变化,J,.中国现代医学杂志，2017，17 (4): 414-417. ,5,李晓艳，张卯年.褪黑素的抗氧化作用及其在眼部疾病应用的研究进展,J,.国际眼科杂志，2017，8(8): 1657-1660. ,6,赵辉，张秋霞，穆阳.侯氏黑散对脑缺血大鼠血液流变学指标及 中国实验方剂学杂志，2017，12(12): 自由基代谢的影响,J,. 37-40.。【摘要】 目的 探讨褪黑素对单侧输尿管梗阻(Unilateral ureteral obstruction，UUO)所致肾脏氧化损伤及机体血液流变学的影响。 方法 成年健康雌性SD大鼠30只，随机分为三组: 假手术组(Sham)、模型组(UUO )和褪黑素组(Mel)各10只。UUO组和Mel组行左侧输尿管结扎， Sham组不结扎输尿管。Mel组于术后腹腔注射Mel(10 mg/kg ?d )，UUO组和Sham组给予等量含有5%乙醇的生理盐水溶液，连续14d后，取左肾皮质检测丙二醛(alondialdehvde,MDA)含量、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性;腹主动脉取血检测机体血液流变学变化。结果 UUO组与Sham组比较，肾组织中MDA含量增加，SOD活性降低，全血粘度、血浆粘度和全血还原粘度升高，红细胞压积、红细胞计数和红细胞聚集指数降低; Mel组与UUO组比较，肾脏肾组织中MDA含量降低，SOD活性升高，红细胞计数和红细胞压积增加，全血粘度和全血还原粘度降低。结论 Mel可以减轻UUO所致肾脏氧化应激损伤和改善UUO所致机体血液流变学变化，说明mel对梗阻性肾损伤具有明显的保护作用。 【关键词】 褪黑素 ; 单侧输尿管梗阻 ; 氧化应激 ; 血液流变学 Effect of Melatonin on Renal Oxidation Damage and on the Change of Body Hemorrheology Induced by UUO Liu Changming, Hua Chunxiu, Li Zhuhua Department of Pathophysiology, Luzhou Medical College, Luzhou City, Sichuan Province 646000 Abstract Objective To study the effect of melatonin on renal oxidation damage and on the change of body hemorrheology induced by unilateral ureteral obstruction (UUO). Methods 30 female adult Sprague-Dawley rats were randomly divided into 3 groups: sham group, UUO group and melatonin group, 10 in each; left ureteral ligation was performed on rats in UUO group and melatonin group but not on rats in sham group; intraperitoneal injuection of melatonin (10mg/kg?d) was made to rats in melatonin after operation continuously for 14 days while the same volume of alcohol physiological saline was injected to rats in UUO group and sham group; the content of malordialdehyde and the activity of superoxide dismutase in left renal cortex were detected; blood sample was taken from abdominal aorta to detect the change of body hemorrheology. Results The content of MDA in nephridial tissue increased in UUO group while the activity of T-SOD decreased; the whole blood viscosity, plasma viscosity and the whole blood reduced viscosity increased while the hematocrit, red blood cell count and erythrocyte aggregation index decreased; in melatonin group, the content of MDA in nephridial tissue decreased, the whole blood viscosity and the whole blood reduced viscosity decreased as well while the activity of T-SOD, the red blood cell count and hematocrit increased. Conclusions Melatonin can reduce the renal oxidative stress damage induced by UUO and can improve the body hemorrheology, which suggests that melatonin is of protective effect for obstructive renal damage. KEYWORDS melatonin unilateral ureteral obstruction oxidative stress hemorrheology 单侧输尿管梗阻(Unilateral ureteral obstruction，UUO)是研究肾间质纤维化的经典模型，可以在较短时间内引起肾间质成纤维细胞弥漫性增殖，导致间质纤维化,1,。许多研究表明，UUO导致氧化应 激反应参与了肾间质纤维化的发生发展，抗氧化应激治疗能有效减轻肾间质纤维化 ,2,。褪黑素(melatonin，Mel) 是强有力的抗氧化剂，能够显着减轻氧自由基的损伤，对急性肾损害具有明显的保护作用,3,。但对于UUO所致肾损伤是否具 有保护作用目前尚未见报道。本研究采用大鼠UUO模型，观察Mel对UUO所致 氧化应激反应、肾脏病理改变和机体血液流变学变化，探讨Mel对UUO所致肾氧 化损伤和机体血‎‎液流变学变化的影响，为防治梗阻性肾损伤提供新的实验基础。 1 材料与方法 1(1 动物分组和给药 清洁级雌性SD大鼠30只，体重(200?20)g，分笼喂养，自由饮水、进食。将大鼠随机分为三组: UUO模型组(UUO)、褪黑素治疗组(Mel)和假手术组(Sham)各10只。UUO组和Mel组用3%戊巴比妥钠(2ml/kg)腹腔注射麻醉后，仰卧位固定于手术台上，局部备皮，75%酒精消毒铺巾，行腹部正中左侧2cm纵行切口，逐层切开皮肤、 肌肉及腹壁各层。暴露并分离左侧输尿管，沿左肾下极寻找到输尿管，用4,0丝 线上下结扎输尿管两处之后从两结扎点中间剪断输尿管，逐层缝合腹壁及皮肤，完 成UUO模型的制作。Sham组仅开腹、游离左侧输尿管，不结扎及剪断。所有大 鼠术后注射青霉素(10U/d，连续3天)预防感染。Mel组术后当天开始每日16时给予腹腔注射褪黑素10mg/kg，褪黑素先用无水乙醇溶解，再用生理盐水稀释成为 含有5,乙醇的生理盐水褪黑素溶液。UUO组和Sham组每天给予等体积含有5, 乙醇生理盐水腹腔注射，连续14天。 1.2 观察指标与方法 三组大鼠均于术后14天腹腔注射3%戊巴比妥钠2ml/kg麻醉，经腹主动脉采血5ml后，取出左侧肾组织，一半置于4%的甲醛溶液中固定;另一半肾脏组织放入冻存管内，置于-80?冰箱中保存备用。 1.2.1 肾组织病理 肾组织经4%多聚甲醛固定，常规脱水、透明、浸蜡，石蜡包埋，制作石蜡切片。常规HE染色方法。4μm切片行HE染色。 1.2.2 肾组织SOD和MDA的检测 取100mg肾组织制作10%组织匀浆，应用考马斯亮蓝法测定匀浆液中蛋白质的浓度;黄嘌呤氧化酶法测定肾组织SOD活性;硫代巴比妥酸(TBA)法测定肾组织MDA的含量，具体步骤以试剂盒说明书进行操作。 1.2.3 血液流变学的检测 大鼠麻醉后，经腹主动脉采血5ml以肝素钠抗凝，保持37?恒温，4小时内血液流变学检测。血液流变学采用FASCO-3010型全自动血流变快测仪(重庆大学维多生物工程研究所)，具体检测项目包括全血粘度高切(HSR)、全血粘度中切(MSR)、全血粘度低切(LSR)、血浆粘度(PV)、红细胞压积(HC)、红细胞聚集(AI)和红细胞变性指数(TI)等. 1.3 统计学处理 采用SPSS 14.0统计软件，对各组SOD、MDA和血液流变学指标数据进行统计学分析，所有数据均以?s表示,计量资料采用t检验，以P,0.05为差异具有统计学意义。 2 结 果 2.1 肾脏病理学改变 2. 1.1 肉眼观察 Sham组肾脏大小形态正常，颜色呈暗红色;UUO组和Mel组梗阻侧肾脏肿大，明显囊性感，颜色变浅呈灰白色，内含褐色混浊液体，剖面观察肾实质明显变薄。 2. 1.2 光镜下观察 HE染色观察显示，Sham组偶见肾小管上皮细胞空泡变性，单核细胞浸润;UUO组肾间质水肿，间质内弥漫性淋巴细胞、单核细胞浸润，肾小管上皮细胞肿胀，部分肾小管呈灶状萎缩，小管管腔闭塞和(或)扩张，肾小球病变不明显;Mel组病理变化较UUO组明显减轻，仅见肾间质轻微水肿和散在少许淋巴细胞、巨噬细胞浸润。 2.2 肾组织SOD和MDA含量的变化 与Sham组相比，UUO组左侧肾皮质SOD活性显着降低(P,0.01)， MDA含量明显升高(P,0.05);与 UUO组相比，Mel组SOD含量明显升高(P,0.05)，MDA的含量明显降低(P,0.05)，见表1。表1 各组大鼠SOD活性、MDA含量的比较(略)注: 与Sham组相比，*P,0.01，#P,0.05;与UUO组相比，?P,0.05 2.3 血流变学的变化 与Sham组相比，UUO组全血高切、中切、低切粘度明显升高(P,0.05)，血浆粘度、全血还原粘度显着升高(P,0.01)，红细胞计数、红细胞压积和红细胞聚集指数降低(P,0.0 1、P,0.05);与UUO组相比，Mel组红细胞计数和红细胞压积增加(P,0.05)，全血高切、中切、低切粘度均降低，全血还原粘度显着降低(P,0.01)，见表2。表2 Mel对各组大鼠血液流变学的影响(略)注: 与Sham组相比，?P,0.05，?P,0.01与UUO组相比，?P,0.05，?P,0.01 3 讨 论 3.1 Mel的抗氧化损伤作用 正常情况下，肾脏的氧化/抗氧化系统保持着动态平衡，不会引起组织细胞的损伤，只有在肾脏氧自由基产生增多或者抗氧化能力下降时，才会导致肾组织细胞发生损伤。本实验中，由于结扎输尿管造成肾小球滤 过率(GFR)下降和肾血流量减少，肾组织因缺血、缺氧可通过活化黄嘌呤氧化酶等途径使自由基产生增多，同时由于缺血引起内源性自由基清除系统的代谢底物(如还原型谷胱甘肽)及SOD等缺乏使自由基清除减少，组织细胞内氧自由基增多，引起肾组织过氧化损伤。 MDA和S0D是评价氧化应激水平的常用指标,4,，本实验结果显示UUO组与Sham组比较，肾组织中MDA含量升高和SOD活性降低，肾脏氧化与抗氧化平衡状态被破坏因而导致肾脏肿大，肾间质弥漫性单核细胞和淋巴细胞浸润，肾间质增宽、水肿，肾小管上皮萎缩，管腔扩张。而Mel组与UUO组比较MDA含量明显降低、SOD活性升高，肾组织损伤明显减轻，表现为间质内仅见散在淋巴细胞、巨噬细胞浸润，间质轻微水肿，说明Mel对UUO所致肾损伤具有明显的保护作用。这种作用可能与Mel的抗氧化、减轻钙超载和改善线粒体的功能状态有关,5,。 3.2 Mel对机体血液流变学的影响 脂质过氧化与血液流变学变化有着密切的关系，如缺血性脑病过程中，血液流变学的改变可以加重局部微循环障碍，增加氧自由基的产生而损伤神经细胞，伴随自由基的清除减少，发生自由基连锁反应，诱发血管痉挛，促进血管内凝血,6,。本研究结果显示UUO可导致机体发生血液流变学改变，表现为全血高切、中切、低切粘度升高，血浆粘度、全血还原粘度升高，红细胞压积、红细胞计数和红细胞聚集指数降低,这可能与输尿管结扎造成肾脏缺血、缺氧引发脂质过氧化有关。而Mel组显示全血高切、中切、低切粘度均降低，全血还原粘度显着降低，说明Mel对UUO所致血液粘度增高具有明显的改善作用。 综上所述，Mel对UUO导致的肾损伤具有明显的保护作用，其机制可能与抗氧化和改善血液流变学变化等有关。【参考文献】 ,,,Moriyama T，Kawada N，Nagatoya K，et al(Fluvastatin suppresses oxidative stress and fibrosis in the interstitium of mouse kidneys with unilateral ureteral bstruction,J,(Kidney International，2017，59(6): 2095-2103. ,2,Xie XS，Liu HC, et al(Ginsenoside Rb1, a panoxadiol saponin against oxidative damage and renal interstitial fibrosis in rats with unilateral ureteral obstruction,J,. Chin J Integr Med，2017,15 (2):133-140. ,3,Tan DX，Manchester LC，et al(One molecule，many derivatives: A never-ending interaction of melatonin with reactive oxygen and nitrogen species,J,(J Pineal Res，2017，42 (1): 28-42( ,4,张晓暄，李银辉，郑伟，等.单侧输尿管梗阻大鼠肾间质纤维化中氧化应激的变化,J,.中国现代医学杂志，2017，17 (4): 414-417. ,5,李晓艳，张卯年.褪黑素的抗氧化作用及其在眼部疾病应用的研究进展,J,.国际眼科杂志，2017，8(8): 1657-1660. ,6,赵辉，张秋霞，穆阳.侯氏黑散对脑缺血大鼠血液流变学指标及自由基代谢的影响,J,.中国实验方剂学杂志，2017，12(12): 37-40.