【word】 变质鸡蛋中蜡样芽孢杆菌的分离与鉴定

【word】 变质鸡蛋中蜡样芽孢杆菌的分离与鉴定 变质鸡蛋中蜡样芽孢杆菌的分离与鉴定 18中国兽医杂志2011年(第47卷)第4期 变质鸡蛋中蜡样芽孢杆菌的分离与鉴定 潘青,杨君敬,李树梅,欧长波,曾汶曙,何诚 (中国农业大学动物医学院,北京海淀100193) 摘要:从山东地区保存超过14d大范围出现变质鸡蛋中分离到一株细菌,经过培养特性,生理生化鉴定和16SrDNA鉴 定,鉴定为蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus).分别将变质鸡蛋,煮熟的变质蛋,健康鸡蛋进行厌氧培养和细菌计数,发现健康鸡 蛋和煮熟的变质蛋无蜡样芽孢杆菌,而变质鸡蛋中的细菌数量达到1.3×lO.CFU/g.本试验表明,蛋黄中过量的蜡样芽孢杆 菌可能与鸡蛋变质有关,应注意过量添加蜡样芽孢杆菌可能影响蛋品的保鲜和食用安全性. 关键词:变质;蜡样芽孢杆菌;分离;鉴定;鸡蛋 中图分类号:$852.616文献标识码:A文章编号:0529—6005(2011)04—0018—03 IsolationandidentificationofaBacilluscereusindeterioratedeggs PANQing,YANGJun—jing,LIShu—mei,OUChang_bo,ZENGWen—shu,HECheng (CollegeofVeterinaryMedicine,ChinaAgriculturalUniversity,Beijing100 193,China) Abstract:Thestrain,isolatedfromdeterioratedeggs,wasidentifiedasBacilluscereusbythephysio— logical,biochemicaland16SrDNAanalyses.Itwasfoundthatbothhealthyeggsandboileddeteriorated eggsweresterile,butthedeterioratedeggscontainedmanybacteriaandthenumberofthebacteriais1.3 ×10.CFU/g.Fromfoodsafetyviewofpoint,weshouldpayattentiontoBacilluscereuscontaminationin thedeterioratedeggs. Keywords:deterioratedeggs;Bacilluscereus;isolationandidentification;bacterialcolonycount Correspondingauthor:HECheng 鸡蛋是大众喜爱的食品,鲜鸡蛋所含营养丰富 而全面,营养学家称之为”完全蛋白质模式”,被人们 誉为”理想的营养库”,是人类最好的营养来源之一. 因此,每天保证摄取新鲜鸡蛋成为我们蛋白质供应 的主要途径之一.2009年冬季山东聊城地区出现 鸡蛋在保存14d之后出现变质,导致大量鸡蛋被处 理.变质特征为:鸡蛋煮熟后,蛋白呈褐色,蛋黄颜 色变浅,蛋黄切面整齐不碎裂.食用时蛋黄和蛋清 发粘,俗称”橡皮蛋”(见图1).本试验对山东聊城 送检的4O枚”橡皮蛋”进行细菌的分离,其中25枚 检测出含有蜡样芽孢杆菌,检出率为62.5,经过 生理生化和16SrDNA鉴定,探讨蛋黄中过多的蜡 样芽孢杆菌(Bacilluscereus)与鸡蛋变质之间的关 系,以及对于鸡蛋的食用安全性影响. 1材料与方法 收稿日期:2010—05—26 作者简介:潘青(1987一),男,硕士生,研究方向为实验动物学,E mail:panqing2OO5O1O1@126.com 通讯作者:何诚,E—mail:hehonest@yahoo.com.ca 图1橡皮蛋切面 1.1材料储存7d,14d的鸡蛋40枚,山东聊城 送检.流体硫乙醇酸盐培养基(购自北京奥博星生 物技术有限责任公司);营养琼脂(购自北京陆桥生 物技术有限责任公司);三糖铁琼脂(购自北京奥博 星生物技术有限责任公司);血琼脂平板(购自北京 奥博星生物技术有限责任公司).蜡样芽孢杆菌标 准株:由中国农业大学农学与生物技术学院王琦教 授赠送. 1.2方法 l_2.1细菌的分离及纯化接种环挑取少量的蛋 清,加入到经高压灭菌的流体硫乙醇钠厌氧培养基 ChineseJournalofVeterinaryMedicine中国兽医杂志2011年(第47卷) 第4期19 或营养肉汤中,置37?,180r/min,摇床增菌培养 8,10h.无菌条件下,采用平板划线法,接种增菌 后的菌液于营养琼脂培养平板上,分别在有氧条件 和厌氧条件下培养,37?培养8,10h.挑取单个 菌落接种于营养琼脂平板上,进一步纯化,得到高纯 度的菌落. 1.2.2形态学观察,培养特性及生理生化特性挑 取单个菌落,用火焰固定,进行革兰染色,在显微镜 下对细菌进行形态学的观察;挑取单个菌落接种于 血琼脂平板上,37?培养8,10h,观察菌落的形态 以及是否出现溶血环;挑取单个菌落进行三糖铁斜 面穿刺试验,观察细菌的产酸及产气情况. 1.2.3分离株的分子生物学鉴定采用16SrD— NA序列分析法对分离菌株进行种属分类鉴定. 16SrDNA引物序歹0如下:Primerl,5,_GAGTTT— GATCMTGGCTCAG一3:Primer2,5’-TACCTT— GTTACGACTT一3,[. PCR扩增:提取分离菌株的总DNA后,按以下 反应条件扩增并设空白对照,空白对照含有除外 的所有组分,PCR扩增反应体系l_2及反应条件如下: PCR扩增体系:反应体积为40L,反应体系 中含:DNAMIX酶2OL,灭菌超纯水13L,上游 引物(10pmol//aL)1.5L,下游引物(10pmol//~L) 1.5L,模板4L. PCR反应条件:Stage194?,5min;Stage230 个循环(94?,30s;55?30s;72?90s);Stage3 72?,10rain. 凝胶电泳检测:制备一块19/5琼脂糖凝胶,取扩 增产物5L,点样后电泳,EB染色后于凝胶成像系 统分析结果. 扩增产物测序:扩增产物送北京三博远志生物 技术有限责任公司进行测序. GenBank比对:将得到的碱基序列在GerrBank等 国际核酸序列数据库内进行同源序列搜索(blast search),找出菌株与数据库中同源性最高的模式菌株 或保藏与ATCC或DSM等国际菌种保藏中心的菌株. 1.2.4变质鸡蛋的菌落计数称取变质蛋清5g, 煮熟的变质蛋5g,健康鸡蛋5g,分别加少量的无菌 生理盐水稀释,在组织研磨器中研磨均匀,分别梯度 稀释到10,,10,.吸取0.1mL研磨液转入到灭 菌后的细菌培养基琼脂平板,均匀涂布后放置于 37?培养箱中,培养72h后,观察菌落生长和分布 情况并计数. 2结果 2.1细菌培养特点将接种菌落的营养琼脂平板 置于37?二氧化碳培养箱中培养8,10h后,需氧 条件和厌氧条件下,观察发现均有菌落生长,说明此 菌为兼性厌氧菌,菌落为乳白色,圆形突起,表面光 滑,白蜡状,直径约1,2mm;血液培养平板出现的 菌落呈乳白色,边缘不整齐,凸起如菜花状,表面不 光滑,并出现明显的一溶血环;三糖铁斜面穿刺试验 结果显示,斜面上面部分变红,下面部分变黄,没有 出现黑色,说明该菌产酸,不产生硫化氢. 2.2生理生化试验特性挑取变质蛋中分离出的 菌株的单个菌落进行分离纯化,革兰染色之后采用 光学显微镜观察,得到显微照片.图中可以明显的 看到该菌为革兰阳性菌,成长杆状.对分离菌株的 部分生理生化特征进行检测,结果见表1.根据形 态观察及生理生化测定结果,查《伯杰细菌鉴定手 册》及《常见细菌系统鉴定手册》可知,该分离菌株的 生理生化结果与芽孢杆菌属(Bacillus)相符. 表1分离菌株的生理生化特征 生理生化试验结果 2.316SrDNA分子鉴定对分离菌株进行PCR 扩增与测序,得到菌株的16SrDNA的PCR扩增电 泳图,见图2.将菌株的16SrDNA序列与Gen— Bank中已报道菌株的同源性比较,结果表明,菌株 与蜡样芽孢杆菌(B.cereus)的同源性达99%. bp 3400 1600 1200 1000 700 图2菌株的16SrDNA的PCR扩增电泳图 M:Marker?;1:阳性对照;2:PCR产物;3:阴性对照 2.4菌落计数分别挑选变质鸡蛋,煮熟的变质蛋, 健康鸡蛋,37?培养72h,进行细菌计数,健康鸡蛋和 煮熟的橡皮蛋细菌计数为0,变质鸡蛋中的细菌数量 是1.3×10CFU/g.培养后的菌落进行革兰染色,其 形态特征与蜡样芽孢杆菌对照细菌相似. 3讨论 3.1变质鸡蛋中细菌的分离和鉴定蜡样芽孢杆 菌(Bacilluscereus)是一种在自然界中广泛分布的 +++十一一一+ 解 性糖氢质水 动糖糖芽化基粉精 运蔗果麦硫靛淀糊 20中国兽医杂志2011年(第47卷)第4期 ChineseJournalofVeterinaryMedicine 好气性,能产生芽孢的杆菌,常处于孢子和休眠状态 下.蜡样芽孢杆菌一般不会致病,但有的菌株能导 致食物中毒症状[3],主要分腹泻型和呕吐型两种不 同类型的食物中毒[4].其中,呕吐型食物中毒由该 菌株产生的热稳定性十二肽环状毒素引发,腹泻型 由多种肠毒素引起.蜡样芽孢杆菌引起的食物中毒 是最常见的食物中毒之一,但目前各国并未强制要 求检测食品中蜡样芽孢杆菌含量[5].目前蜡样芽孢 杆菌检测方法主要是利用蜡样芽孢杆菌可发酵葡萄 糖和麦芽糖,不发酵甘露糖醇,产卵磷脂酶以及在马 和羊血琼脂上B型溶血的生化特性,使用选择性培 养基使其与其他微生物区分开来_6]. 本试验通过对分离细菌进行培养特性,生理生 化特性以及16SrDNA鉴定,并且与蜡样芽孢杆菌 菌进行比对,初步鉴定分离的细菌为蜡样芽孢 杆菌(Bacilluscereus).随后分别测定变质鸡蛋,煮 熟的变质蛋,健康鸡蛋的细菌菌落,蛋黄,蛋清 中含有大量的蜡样芽孢杆菌.因此,本试验证实,变 质的鸡蛋中分离的细菌主要是蜡样芽孢杆菌. 3.2鸡蛋中过量的蜡样芽孢杆菌与鸡蛋变质之间 的关系已有文献报道,饲料中棉酚超标可以造成 橡皮蛋,其内在的机制是过量的棉酚导致鸡蛋蛋白 变性[7].本次送检的蛋鸡饲料中没有添加任何棉子 饼等可以引起棉酚蓄积的饲料原料(蛋鸡饲料配方: 玉米62.5,豆粕18.0,米糠4.0,土霉素菌丝 蛋白2.0,石粉8.5,北农大5预混料5.0), 因而本次变质的鸡蛋排除了饲料棉酚中毒的可能. 目前微生态制剂(含蜡样芽孢杆菌)已经被广泛应用 到蛋鸡饲料,乳猪饲料,肉鸡饲料中,可以改善对饲 料的消化性能,平衡肠道微生物,减少肠道疾病的发 生,提高饲料的利用率[8]. 金银花大蒜液治疗仔猪白痢 马伦 (青海省西宁市湟中县大才乡兽医站,青海湟中811605) 仔猪白痢是哺乳仔猪常发的一种急性传染病,主 要由大肠杆菌引起,患病仔猪以排泄乳白色或灰白色 糊状腥臭粪便为主要特征,多发于10日龄至2O日龄 的哺乳仔猪,本病一年四季均可发生,但以春秋季节 发病最多,一般认为本病发生的主要诱因是气候骤 变,阴雨潮湿,冷热不定,圈舍场地不洁,乱食污泥浊 水,补饲过迟,饲料品质不良,饲料配合不当或突然改 变,母猪乳汁太浓或不足等多种因素,本病发病率约 为50左右,如不采取积极治疗,常可导致死 亡,对养猪业的危害极大. 笔者在多年的临床实践中,利用金银花大蒜液治 疗仔猪白痢取得了很好的效果,其治愈率达100, 本试验中发现,出现变质的鸡蛋与新鲜鸡蛋在 蜡样芽孢杆菌的数量出现差异性显着,这提示饲料 中添加的大量蜡样芽孢杆菌在蛋黄进行蓄积,在室 温下储存超过7d,为变质提供了很好的时间一空间 条件,使其在蛋黄中进行厌氧繁殖,从蛋黄向蛋清蔓 延,产生大量的内毒素,引起蛋黄变性,成为鸡蛋变 质的直接诱发因素,出现所谓的”橡皮蛋”.如果米 饭中的蜡样芽孢杆菌达到1.4×10CFU/g会引起 食物中毒Lg].本试验中测定的数量已经高达1.3× 10.CFU/g,为中毒米饭中的100倍.如果食用未煮 熟的含有蜡样芽孢杆菌的鸡蛋,存在的食品安全隐 患很高,但这种变质鸡蛋中产生的内毒素是否在鸡 蛋加热过程中降解,含量是多少,还需要进一步 测定. 参考文献: [1]张丽萍,徐莲,吴莹,等.氯氰菊酯降解菌的筛选鉴定及其降解 特性研究EJ].生态与农村环境,2009,25(3):69—72. E2]王振国,刘金华,肖成蕊,等.利用PCR技术检测致病性蜡样芽 孢杆菌的研究[J].生物技术,2005,15(5):45—47. E3]KotirantaA,LounatmaaK,HaapasaloM.Epidemiologyand pathogenesisofBacilluscereusinfectionsEJ].MicroInfect, 2000,2:189—198. [4]周帼萍,袁志明.蜡样芽孢杆菌污染及对食品安全的影响[J]. 食品科学,2007,28(3):357-361. [5]周帼萍,胡晓敏,都建琳,等.几种蜡样芽孢杆菌群微生物的选 择性培养基比较[J].武汉工业学院,2009,28(4):15—19. [6]刘中富.宜昌市40年细菌性食物中毒分析与控制的探讨[J]. 中国卫生监督杂志,2002(9):44—46. [7]沈峥.棉酚与”橡皮蛋”[J].化学教学,2009,12(3):50—52. [8]黄丽彬,陈有容,齐凤兰.蜡样芽孢杆菌在饲料中的应用[J]. 粮食与饲料工业,2001,9(2):32—33. [9]杨佐毅,李理,刘冬梅.白腐乳中蜡样芽孢杆菌的分离与鉴定 EJ].中国酿造,2008,17(3):39—41. 现将药物配制和灌药方法介绍如下. 1药物配制取金银花100g,加水8000mL, 10000mL,煮沸数小时,待水至3000mL左右时, 用纱布过滤,除去残渣,过滤出来的药液再在火上浓 缩到100mL,另称取大蒜10g,捣碎,加水100mL, 浸泡1,3h后过滤,除去残渣,用药前取两份金银花 浓缩液,一份大蒜浸出液混合,体重3,7kg的小猪 灌服2OmL,体重7,15kg的小猪,每次灌服3O mL,1日2次,直至小猪粪便由稀变干,由白色变为 褐色为止,一般用药两天即可痊愈. 2灌药方法用自制开口器打开口腔,然后将细胶 管插入胃中,接上吸好药液的注射器,注人胃中即可. 为避免回抽胃管时药液吸入气管,可用注完药液的注 射器吸上空气将残留胃管中的药液注人胃中,再折叠 胃管拉出口腔. 本病在农区尤其是自繁自养的生产条件下发生较 多,笔者用此法治疗800余例,全部治愈,疗效快无再发.