胸腺素β4在系膜增生和肾小管间质纤维化肾组织中的表达和意义

胸腺素β4在系膜增生和肾小管间质纤维化肾组织中的表达和意义 胸腺素β4在系膜增生和肾小管间质纤维化肾组织中的 表达和意义 硕士专业学位论文 论文题目 胸腺素β4 在 系膜增 生和肾 小管间 质纤 维化 肾组织中 的表达 和意义 研究生姓名 汪 瑛 指 导 教 师 姓 名 李晓忠 教授 专 业 名 称 儿科学 研 究 方 向 肾脏免疫 论 文 提 交 日 期 2013 年 4 月胸腺 素β4 在 系膜 增生 和肾 小管 间质 纤维 化肾 组织 中的 表达 和 意义 中文 摘要 胸腺素β4 在系膜增生和肾 小管间质纤维化 肾组织中的表达和意义 中文摘要 目的:探讨 胸腺素β4(Thymosin beta 4,T β4 )在儿童系膜增生肾组织中 的表达 及意义, 在小鼠 叶酸性 肾病模型 肾小管 间质 纤维化中的 表达及 其与 纤维 化的关 系, 在 肾脏纤维化过程中的作用及可能的作用机制。 方法:1 选取 苏 州大 学 附属 儿 童医 院 肾脏 科 近半 年 的36例 以 系膜 增 生为 主 要 病 理表现病例的肾活检标本,按系膜增生程度分为轻、中、重三组,按有无肾小管间 质 纤 维 化分 为 两 组, 用 免疫 组 织化 学 染 色方 法检 测T β4 的表 达 ; 收 集 临 床尿 微 量 白 蛋白、尿肌酐、α1微球蛋白、β2微球蛋白、24 小时尿蛋白定量资料,观察尿蛋白 水平和T β4 的表 达、 系膜 增生 程度之 间的 关系 。2 采用 两次 腹腔注 射叶 酸的 方法建 立肾小管间质纤维化动物模型,CD1 小 鼠 随 机 分 为 对 照 组 和 叶 酸 组 , 分别于第14 天 和21 天处死小鼠, 摘 取肾脏行常 规HE 染色、MASSON 染色 , 用免疫组织 化学染色方 法检测T β4 的表达。所有统计用SPSS17.0进行,采用t 检验、F检验、秩和检验 进行分析。 结果:(1 )T β4 在 儿 童 轻 、 中 、 重 度 系 膜 增 生 三 组 间 的 表 达 有 显 著 差 异 (P0.05 ), 在重度 系膜 增生组 的表 达高于 轻 度、中 度系膜 增生 组 (P0.05 ) 。T β 4在肾小 管间质 纤维 化组的 表达高 于 无肾 小管 间质纤维 化 组(P0.05 )。尿 微量白蛋 白/ 肌 酐 、 α1 微 球 蛋 白/ 肌 酐 、 β2 微 球 蛋 白/ 肌酐和24 小 时 尿 蛋 白 定 量 在 儿 童 轻 、 中、重度系膜增生 三组间有显 著差异(P0.05 )。(2)T β4在小 鼠叶酸性肾 病肾小 管间质纤维化组的表达高于正常对照组(P0.05 ) ,T β4 在叶酸两周组和叶酸三周 组的表达无明显差异(P0.05 )。 结论: (1 )T β4 在 儿 童 不 同 程 度 系 膜 增 生 肾 组 织 中 的 表 达 不 同 , 在 系 膜 增 生 组织上调表达 , 亦 在 合 并肾 小 管 间 质 纤 维 化组上 调 表 达 , 可能参与肾脏系膜增生和 I中文 摘要 胸腺 素β4 在 系膜 增生 和肾 小管 间质 纤维 化肾 组织 中的 表达 和 意义 肾小管间质纤维化 的过程 。(2)T β4在儿童及小鼠肾小管间质纤维化肾组织的表达 明显升高, 可能 在 肾小 管 间 质 纤 维 化 中 发 挥 作用 。 (3 ) 尿 微 量 白蛋 白 、 α1 微球蛋 白、β2微球蛋白、24小时尿蛋白定量 和系膜增生程度 有一定的相关性 。 关键 词 : 胸腺素β4 系 膜增生 肾小管间质纤 维化 作 者: 汪 瑛 指导 老师: 李晓忠 教授 IIExpression of Thymosin beta 4 on renal tissues with mesangial proliferation and tubulointerstitial fibrosis Abstract Expression of Thymosin beta 4 on renal tissues with mesangial proliferation and tubulointerstitial fibrosis Abstract Objective To investigate the expression and significance of T β4 on children renal tissue with mesangial proliferation, on folic acid induced nephropathy FAN with tubulointerstitial fibrosis. The role and the possible underlying mechanism are also researched in this studyMethods 136 children confirmed by renal biopsy with main historical changes of mesangial proliferation were selected from Children's Hospital Affiliated to Soochow University in the past half a year. They were divided into three groups according to the degree of mesangial proliferation and two groups based on whether or not they had tubulointerstitial fibrosis. Immunohistochemistry stain IHC was used to detect the expression of T β4. Based on the clinical data of mAlb ,UCr ,α-MG, β-MG and 24hUTP ,correlations were discovered among proteinuria, renal pathological changes and T β4. 2)CD1 mouse were randomly assigned to two groups: normal control group and FAN group. The model of interstitial fibrosis was induced with two times of 240mg/kg folic acid FA by intraperitoneal injection. Four mice in each group were sacrificed on the th th 14 and 21 day. Samples of kidneys were processed for hematoxylineosin stain HE, Masson trichrome stain. T β4 was semi-quantified by immunohistochemical stainIHC All data were analyzed with SPSS17.0 by T test, F test and Rank Sum TestResults ( 1 ) The expression of T β 4 between mild & moderate and severemesangial proliferation had significant differenceP0.05The expression of T β4 washigher in tubulointerstitial fibrosis group than non-tubulointerstitial fibrosis groupP0.05The level of mAlb ,α-MG, β-MG and 24hUTP among groups of mild, moderate and severe mesangial proliferation had significant differenceP0.05(2 ) Compared with IIIAbstract Expression of Thymosin beta 4 on renal tissues with mesangial proliferation and tubulointerstitial fibrosis the control group, the expression of T β4 in FAN group was increased at day 14 and day 21 P0.05 , while no significant difference between their time point in FAN groupP0.05Conclusion 1 The expression of T β 4 was upregulated in severe mesangial proliferationT β4 expression was increased with appearance of tubulointerstitial fibrosisAll these indicate that its expression may be responsed to mesangial proliferation and tubulointerstitial fibrosis. 2 The expression of T β4 on renal tissue of tubulointerstitial fibrosis was more dominant than control group in FAN mice. T β4 might play in the process of tubulointerstitial fibrosis.3 The level of mAlb ,α-MG, β-MG and 24hUTP may be indicator for the evaluation of mesangial proliferative Keywords Thymosin β4 ; Mesangial Proliferation ; Tubulointerstitial FibrosisWrittenby: Wang Ying Supervised by: Professor Li Xiaozhong IV 目录 引 言 1 材料和方 法. 3 结 果 8 讨 论. 14 结 论. 19 参考文献 20 综 述. 22 中英文对 照缩略 词表32 攻读学位 期间公 开发表 的论文. 33 致 谢. 34 胸腺 素β4 在 系膜 增生 和肾 小管 间质 纤维 化肾 组织 中的 表达 和 意义 引言 引言 胸腺素最 先于1966 年从牛 胸腺中提 取,根据 胸 腺素等电点的 不同,将 其分为a , β,γ三类,β族胸腺素广泛存在于脊椎动物和无脊椎动物中。已发现的β族胸腺 素有15 种, 在 人 体内 主 要为 三 种表 现 形 式, 即T β4、 胸 腺素 β10、 胸 腺 素β15 ,其 中T β4是分布最广泛、含量最多的。T β4在脯 氨酸寡肽酶Prolyloligopeptidase , POP 的 作 用 下 , 可 以 分 解 为N- 乙 酰 基- 丝氨酰- 天 冬 氨 酰- 赖 氨 酰- 脯 氨 酸N-a-cetyl- Ser-Asp-Lys-Pro ,AcSDKP 。T β4 广 泛 存 在 于 多 种 组 织 中 , 如 心 脏 、 肝 脏 、 肺 脏 、 神经系统、肌肉中含量均很高,它也存在于许多细胞中,在血液循环细胞中含量就 很高,尤其是在血小板、中性粒细胞、巨噬细胞和其他淋巴细胞内有很高的浓度, 血小板 中浓度 最高 ,达2.5 ~3.0g/L , 在损伤 时 可与?a 一 起从血 小板 被释 放,与 纤维 蛋 白 或 纤维 蛋 白 原结 合 ,促 进 伤口 的 凝 血过 程。T β4 在 组织 和 细胞 中 的 广泛 分 布 为 其发挥生物学功能奠定了基础,它在创伤愈合、角膜损伤、神经损伤、心肌修复、 肝脏纤维化、肿瘤转移等诸多方面均发挥作用。 T β4 分布 广泛 ,作 用 强大 ,是 近年 学者 们研 究的 热 点, 但是 国内 外关 于T β4 在 肾 脏 分 布情 况 及 其在 肾 脏生 理 病理 的 作 用却 鲜有 研 究 ,T β4 是 否在 肾 脏 组织 表 达 , 作用又如何? 国外有学 者 在5/6 小 鼠肾切 除肾小 球硬化 模型中 , 证实T β4 在肾脏 中有表 达,并 且 和 肾 小球 硬 化 关系 密 切,T β4 在硬 化 肾小 球中 的 表 达 较正常组明 显 升高 。 国内 有 学 者 在 观 察 T β 4 基 因 沉 默 对 膀 胱 癌 细 胞 上 皮 间 质 转 化 epithelial-mesenchymal transition, EMT 的逆转中发现,T β4 表 达 下 调可 以 逆 转 细 胞 的 间 质 表 型 , 而 向 上 皮 表型转 化,即T β4 对于EMT 有 促进 作用 。EMT 是肾脏 纤维化 的关 键步骤 , 肾 脏通过 EMT 产 生 的 肌 成 纤 维 细 胞 (Myofibroblast ,MyoF )是体内MyoF 的 主 要 来 源 , 我 们 大胆推测,T β4可能也对肾脏EMT 起促进作用 ,影响肾脏纤维化的发生。 肾脏纤维化是各种慢性肾脏病进展到终末期肾 病(ESRD)的共 同途径和主要病 理基础 ,ESRD 患 者 需 要 依 赖 肾 脏 替 代 治 疗 来 维 持 生 命 , 严 重 影 响 患 者 的 生 活 质 量,对患者的家庭及社会也造成一定的压力。 1引言 胸腺 素β4 在 系膜 增生 和肾 小管 间质 纤维 化肾 组织 中的 表达 和 意义 本 文 收 集 儿童 肾 活 检标 本 ,观 察T β4 在肾 组 织的 表 达 情 况; 同 时 建立 小 鼠叶 酸 性 肾 病 肾小 管 间 质纤 维 化模 型 ,观 察T β4和 肾小 管 间 质纤 维 化 的关 系 。目 的 在于 探 讨T β4在 儿童 系膜 增生 肾组 织中 表达 及 意义 ,T β4 在小 鼠叶 酸性 肾病 肾小 管间 质 纤 维 化 模 型中 的 表 达及 其 与纤 维 化的 关 系 ,T β4在 肾 脏 纤 维 化 过 程中 的 作用 及 可能 的 作用机制,完善对T β4 的认识,并为临床肾脏 纤维化的诊治提供理论基础。 2胸腺 素β4 在 系膜 增生 和肾 小管 间质 纤维 化肾 组织 中的 表达 和 意义 材料 和方 法 材料和方法 1. 实验资料与标本 1.1 儿童 临 床肾活检 病理标本 :收集苏州大学 附属儿童医院肾内科 2012 年 9 月 至 2013 年 2 月行肾活检标本 36 例,肾脏病 理以系膜增生为主要表现者入选,以内 皮细胞增生、毛细血管病变等其他病理改变为主要表现者剔除。 在 这 36 例标本中, 男 19 例,女 17 例,年龄 4-15 岁,平均年 龄 10.1 岁;按肾脏病理系膜增生程度划 分 , 轻度系膜增生 21 例,中度系膜增生 11 例,重度系膜增生 4 例; 系膜增生程度 根据 一个系膜区细胞的数量来划分,系膜细胞3 个轻度增生,系膜细胞 3-5 个中度 增生,系膜细胞5 个重 度增生,但 是当切片 厚度较厚时,容 易造成假 阳性结果。在 临 床 工 作 中 , 我 们 可 以 根 据 系 膜 宽 度 与 毛 细 血 管 直 径 的 比 较 来 判 定 系 膜 增 生 的 程 度,当系膜宽度未超过毛细血管直径时,定为轻度增生,此时毛细血管暂未受压; 当 系 膜 增 生 进 一 步 加 重 , 超 过 毛 细 血 管 直 径 时 , 则 为 中 度 增 生 , 毛 细 血 管 已 受 挤 压 ; 当 系 膜 宽 度 破 坏 了 毛 细 血 管 袢 , 导 致 相 邻 毛 细 血 管 消 失 时 , 称 重 度 系 膜 增 生 [1] 。按有无肾小管间质纤维化划分,存在肾小管间质纤维化者 4 例(2 例伴炎细胞浸 润), 无肾小管间质 纤维化 者 32 例;按病种 划分,紫癜性肾炎 17 例,急慢性肾炎 12 例,狼疮性肾炎 3 例,IgA 肾病 3 例,Evans 综合症 1 例;临床诊断均由肾内科主 任 医 师 完 成 , 病 理 分 类 参 考 病 理 科 报 告 单 。 收 集 临 床 尿 微 量 白 蛋 白 、 尿 肌 酐 、 α1 微球蛋白、β2 微球蛋白、24 小时尿蛋白定量 资料,观察尿蛋白和 T β4 的表达、肾 脏病理的关系。 1.2 小鼠叶酸性肾病肾小管间质纤维化模型 1.2.1 实验动物模型的制备:取 16 只 CD1 健康小鼠做动物实验,5 周龄,体重 20-23g/ 只,随机分为实验组和对照组 。 叶 酸 组(8 只):分别于第一天、第七天腹 腔注射叶酸 240mg/Kg ;对照组(8 只):分别于第一天、第七天腹腔注射 NAHCO3 0.1ml/10g 。 1.2.2 动 物 处 理 及 取 材 : 两 组 小 鼠 均 于 第14 、21 天各处死4 只 小 鼠 。 小 鼠 以 40mg/kg 戊巴比妥钠腹腔 注射麻醉,立刻摘取 肾脏,放入生理盐水漂洗,除去包膜、 3材料 和方 法 胸腺 素β4 在 系膜 增生 和肾 小管 间质 纤维 化肾 组织 中的 表达 和 意义 肾门结缔组织及血 管,存放于福 尔马林固定以 制作病理学切片做HE 染 色、MASSON 染色、免疫组化染色。 2 主要仪器和试剂 BMJ- ? 型包埋机(常州中威电子仪器厂) BMJ- ? 型病理组织包埋冷冻台(常州中威电子 仪器厂) PHY- ? 型病理组织漂烘仪(常州中威电子仪器厂) YL3-A 型回转式切片机(上海仪表厂) 防脱玻片(世泰标准级显微镜载玻片) 恒温鼓风干燥 箱(上海琅轩实验器材有限公司) 高压锅(苏泊尔银河星不锈钢压力锅) 37?恒温培养箱 (上海琅轩实验器材有限公司) 数显恒温水浴锅 (国华电器有限公司) 雄性 CD1 小鼠(上海苏尚生物科技有限公司 ) ?抗(北京博奥森生物技术有限公司) 小牛血清( 北京博奥森生物技术有限公司) DAB (基因科技(上海)有限公司) 叶酸(Sigma 公司,美国) 二 甲 苯 、梯 度 乙醇 、 苏木 素 、伊 红 、过 氧 化氢、PBS 缓 冲液 、 柠檬 酸 缓冲 液 等 试剂由苏州大学南区 实验室提供;Masson 染 色染色液 由苏州大学 附属儿童医院病理 科提供。 3 免疫组织化学 染色原理 免 疫 组 织 化学immunohistochemistry, IHC 是 应用 免 疫 学 抗原 抗 体 结合 的 原 理 , 通过化学反应使标记抗体的显色剂显色,来研究组织、细胞内抗原的分布与含量。 一般先将组织或细胞中的某些物质提取出来,作为抗原或半抗原去免疫小鼠、兔等 实验动物,制备特异性抗体(即?抗),再用某种酶或生物素对?抗进行标记。抗 原抗体复合物是无色的,因此,常与呈色反应相结合(如用 DAB 显色),这样 通过 显微镜可清晰看见 细胞内发生 的抗原抗体 反 应产物。现在多采 用 SP streptavidin- perosidase 法, 即链霉菌抗生物素蛋白- 过氧化物酶连结法。 4 免疫组织化学染色方法 4胸腺 素β4 在 系膜 增生 和肾 小管 间质 纤维 化肾 组织 中的 表达 和 意义 材料 和方 法 1 切片、贴片与烤 片:肾组 织标本经 洗涤、脱 水、浸蜡、包 埋后,厚 度为 3um 切 片 。 将 组 织 置 于 冷 水 , 平 摊 于 水 面 , 裱 于 防 脱 玻 片 上 , 置 于 温 水 (50 ? ) 中 展 平,捞至载玻片上铺平,将其放入 50?温箱中干燥 6h 。 2 脱蜡与水化: 70 ?烤片 1 小时,置于二甲 苯中脱蜡 15min ,更换二甲苯后再 浸泡 10min ,无水乙醇浸泡 5min ,90% 乙醇浸 泡 5min ,75% 乙醇浸泡 5min ,蒸馏水 浸泡 5min 。 3 抗 原 修 复 : 高 压 锅 中 加 热0.01mol/L 柠檬 酸 缓 冲 液 (PH6.0 ) 至 沸 腾 , 将 组 织 切片放入,继续加热 至冒气后2分钟 ,断电, 自然冷却后打开锅盖 ,取出切片,流水 冲洗3-5min ,PBS 冲洗 5minX3 次。 4 灭活内源性过氧化物酶活性 :甩干擦净周围 水,滴加3% 过氧化氢,室 温放置 15min ,PBS 冲洗5minX3 次。 5 血清封闭:滴加10% 小牛血清37?封闭0.5 小 时,防止交叉反应,倾去勿洗。 6 加?抗:滴加1:50 稀释的HRP 标 记 的 兔T β4 抗体,4 ?孵育过夜,PBS 冲洗 5minX3 次。 7 显 色: 滴 加新 鲜配 制的 DAB 溶液(C:B1:50 ), 显色 数秒 至数 分钟 ,在 显 微 镜下掌握显色程度,出现浅棕色本底时,即可流水冲洗。 8 复 染 、 脱 水、 封 片 : 苏 木 素 核 染1-5min , 流 水 冲 洗 ,56 ?电热恒温水浴箱返 蓝1min ,无水乙醇脱水两次,中性树胶封片, 自然干燥。 5 免疫组化结果的测量 免疫组织化学染色阳性结果为棕褐色或棕黄色,在同一拍摄条件下,每张切片 在400 倍视野下随机取10 个不重叠区域视野,拍摄数字图像。运用 Image-Pro Plus 6.0 病理图文分析系统,计算每张图片的阳性区域的平均光密度(阳性区域的总体光密 度/ 阳 性区 域的 总体 面积) 。因 系统 默认 数值 的是灰 度值 ,而 灰 度 值与 阳性表 达负相 关,故在分析之前先进行灰度值校正,将灰度值变成光密度值,平均光密度值的范 围为0 ~2 , 平 均 光密 度 值 越 接 近0 , 灰 度 值 越接 近255 , 免 疫 组 化 染色 越 浅 , 阳 性 表 达越低;反之,平均光密度值越高,阳性表达也越高 。 校 正 后 阳 性 表 达与 平 均 光 密 度正相关,得到的平均光密度值可以直观反应阳性表达情况。 6 动物肾组织 HE 染色、MASSON 染色及免疫 组织化学染色 6.1 肾 组 织 HE 染 色 : 小 鼠 肾 组 织 福 尔 马 林 固 定 后 常 规 行 HE 染 色 , 具 体 步 骤 如 下 : 5材料 和方 法 胸腺 素β4 在 系膜 增生 和肾 小管 间质 纤维 化肾 组织 中的 表达 和 意义 1 切片、贴片与烤片:标本经洗涤、脱水、浸 蜡、包埋后 ,厚度为 3um 切片。 将组织置于冷水,平摊于水面,贴于载玻片上,置于温水(50 ? ) 中 展平 , 捞 至 载 玻片上铺平,将其放入 50?温箱中干燥 6h 。 2 脱 蜡及 水 化 : 切片 用 二 甲 苯脱 蜡 10minx2 次 , 无 水 乙 醇 洗去 二 甲 苯 2minx2 次;然后移入 100%、95%、90%、85%、70 %酒精,各为 3min , 然后用蒸馏水洗 2min 。 3 HE 染 色 : 苏 木 精 (Hematoxylin )染色 5min ,流水冲洗 5min ,1% 伊红 (Eosin )染色 5min 。 4 切片脱水、透明及封片:切片依次经 70%、85 %、90%、95%、100 %酒精 脱水,各为 3min ,然后经二甲苯透 明 2minx2 次,最后用中性树胶封片。 6.2 MASSON 染色:小鼠肾组织福尔马林固定后行 MASSON 染色,观察肾脏损 伤化情况。具体步骤如下: 1 上述方法切片后脱蜡至水。 2Masson 复合染色液(酸性复红 1g, 丽春红 2g, 橘黄 G2g, 0.25% 醋酸 300ml )染 色 5 分钟。 30.2% 醋 酸 水 溶 液 洗 后 5% 磷 钨 酸 放 置 8 分 钟 , 再 放 入 0.2% 醋 酸 水 溶 液 浸 洗 2 次。 4 亮绿染色液(高绿 SF 0.1g, 0.2% 醋酸 100ml )染色 5 分钟,0.2% 醋酸水溶液 洗 2 次。 5 无水乙醇脱水两次,各 2min ,二甲苯透明, 中性树胶封片。 6 MASSON 染色后,400 倍光镜下每张切片 随机选择 5 个不重复的视野,根据 小管扩张或萎缩、肾小管间质细胞浸润情况、间质纤维化范围等对肾小管间质损伤 程度进行评分,分 0 、1 、2 、3 四个等级:肾脏病理正常或肾小管无明显改变为 0 分;肾小管上皮细胞轻度萎缩,少量炎性 细胞浸润,纤维组织轻度增生,范围 25% ,评定为 1 分 ; 肾 小 管 上 皮 细 胞 中 度 萎 缩 变 性 、 轻 度 坏 死 , 炎 性 细 胞 浸 润 较 多,纤维组织中度增生,病变范围 25%-50% , 评定为 2 分;肾小管上皮细 胞严重萎 缩、坏死,大量炎性细胞浸润,纤维组织重度增生,范围50%, 评定为 3 分。每张切 片的 5 个区域的分数取平均数进行统计。 6.3 动物肾组织免疫组织化学染色方法同前, 阳性结果的测量方法同前。 7 统计学处理 6胸腺 素β4 在 系膜 增生 和肾 小管 间质 纤维 化肾 组织 中的 表达 和 意义 材料 和方 法 _ 运用 SPSS17.0 统计软件进行统计分析,数据 计量资料以 x?s 表示,两样本均 数比较符合正态分布及方差齐性采用独立样本 t 检验或配对样 本 t 检验;多样本均数 比较符合正态分布及方差齐性采用 F 检验,进 一步进 行两两比较时采用 q 检验;不 符合正态分布及方差齐性多样本比较采用秩和检验,P0.05 认为有统计学意 义。 7结果 胸腺 素β4 在 系膜 增生 和肾 小管 间质 纤维 化肾 组织 中的 表达 和 意义 结果 1.36 例肾活检儿童的部分资料 入选的 36 例儿童,病种以紫癜性肾炎居多;病理以轻度系膜增生为主,其中 4 例伴肾小管间质纤维化,余 32 例肾小管间质无异常。(见表 1) 表 1 36 例肾活检儿童病理及病种情况 紫癜性 Evans 综 组别 急慢性肾炎 狼疮性肾炎 IgA 肾病 合计 肾炎 合症 轻度系膜增 殖 11 8 1 1 0 21 中 度 系膜 增 殖( 小 管 5 (1) 3(2) 1 2 0 11 间质纤维化 ) 重 度 系膜 增 殖( 小 管 1 (1) 1 1 0 1 4 间质纤维化 ) 合计 17 12 3 3 1 36 2.T β4 的表达与儿童系膜增生程度的关系: 在以系膜增生为主要病 理表现的儿童肾 组织中 ,T β4 主要在肾小管上 皮细 胞表 达, 亦在肾小球 上弱表达。用平均光密度的数值来代表 T β4 在肾脏免疫组织化学染 色的阳性结果 。显示 平 均光 密 度 在 轻 、 中 、重度 系 膜 增 生 三 组 间 差 异 有统 计 学 意 义 (P0.05 ),进一步 行两两比 较,平均 光密度 在 轻/ 重、中/ 重度系 膜增生 组间差异有 统计学意义 (P0.05 ),在 轻/ 中 度 系 膜 增 生组 间 差 异无统计学意义 (P0.05 ), 即 T β4 在系膜增生肾组织上调 表达。(见 表 2, 图 1) 表 2 儿童不同程度系膜增生肾 组织 T β4 的表达 组别 平均光密度 轻度系膜增 生 0.41 ?0.37 中度系膜增 生 0.43 ?0.32 重度系膜增 生 0.48 ?0.26 8胸腺 素β4 在 系膜 增生 和肾 小管 间质 纤维 化肾 组织 中的 表达 和 意义 结果 A 轻度系膜增生 B 中 度系膜 增生C 重度度系膜增生 图 1 儿童不同程度系膜增生肾 组织 T β4 的免疫组 织化学染色结果 3.T β4 的表达与儿童肾小管间质纤维化的关 系 在 36 例儿童肾活检标本中,有 4 例存在肾小管间质纤维化,32 例无肾小管间 质 纤维化 。在无 肾小管间 质 纤维化组 ,T β4 主 要在肾小管上皮细胞表 达;在肾小管间 质纤维化组,可见肾小 管间质局灶性纤维 化及 散在炎细胞浸润,T β4 主要 在肾小管 上皮细胞及肾小管间质纤维化区表达。肾小 管间质纤维化组平均光密度为 0.45 ? 0.03 ,与 无 肾 小 管 间 质 纤 维 化 组 ( 0.40 ? 0.42 ) 相 比 , 差 异 有 统 计 学 意 义 (P0.05 ),即 T β4 在肾小管间质纤维化肾组 织中的 上调 表达。(见图 2) 9结果 胸腺 素β4 在 系膜 增生 和肾 小管 间质 纤维 化肾 组织 中的 表达 和 意义 A 无肾小管 间质纤维化组B 肾小管间质纤维化组 图 2 两组儿童肾组织 T β4 的免疫组织化学染色结 果 4. 儿童系膜增生程度与临床尿蛋白水平的关系 收集临床尿微量白蛋白、尿肌酐、α1 微球蛋白、β2 微球蛋白、24 小时尿蛋白 定量资料。尿微量白蛋白/ 肌 酐 在 轻 、 中 、 重 度 系 膜 增 生 三 组 间 差 异 有 统 计 学 意 义 (P0.05 ),在轻/ 中、轻/ 重、中/ 重系膜增生组间差异有统计学意义 (P0.05 )。α 1 微球蛋白/ 肌 酐在 轻 、 中 、 重度 系 膜 增 生三组 间 差 异 有 统 计 学意 义 (P0.05 ) ,在 轻/ 中、轻/ 重、中/ 重系膜增生组间差异有统计学意义 (P0.05 )。 β2 微球蛋白/ 肌 酐 在 轻 、中 、 重度 系 膜增 生 三 组间 差 异有 统 计学 意 义 (P0.05 ),在轻/ 中 度系 膜 增 生组间差异 无统计学 意义 (P0.05 ), 在轻/ 中 、中/ 重系膜 增生组 间差异有 统计学意 义 (P0.05 )。24 小 时尿 蛋白 定量 经检 验三 组数 据 不服 从正 态分 布及 方差 齐性 , 采 用多个独立样本比较的秩和检验,显示三组间差异有统计学意义,进一步进行两两 比较,为防止第一类错误扩大,α采用校正值 0.017 (0.05/3 ),显 示 24 小时尿蛋白 定 量 在轻/中、轻/ 重、 中/ 重系 膜 增生 组间 差 异有 统 计学 意义 (P0.017 ), 结合 表 3 中的数值, 尿微量白蛋白/ 肌酐、α1 微球蛋白/ 肌酐、β2 微球蛋白/ 肌酐、24 小时尿 蛋白定量随着系膜增生程度的加重有增加趋势 。 _ 表 3 36 例肾活检患儿临床尿蛋白的检验( x?s ) 尿微量白蛋 白/ 肌 α1 微球蛋 白/ 肌 24 小时尿 蛋白定量 β2 微球蛋 白/ 肌酐 组别 2 酐mg/g 酐mg/g mg/g (mg/24h/m ) 轻度系膜 215.34?276.63 8.13 ?7.54 0.77 ?2.16 606.62?625.14 增生 中度系膜 426.75?297.87 16.26 ?13.29 1.24 ?1.99 899.16?645.28 增生 重度系膜 905.24?743.04 44.51 ?49.71 3.47 ?5.17 2173.46 ?943.81 增生 10胸腺 素β4 在 系膜 增生 和肾 小管 间质 纤维 化肾 组织 中的 表达 和 意义 结果 4.小鼠叶肾脏 HE 染色及 Masson 染色结果 HE 染色和 Masson 染色显示正常对照组小鼠肾脏基本正常。两周时,叶酸性肾 病肾小管间质纤维化组肾小管间质可见大量中性粒细胞、淋巴细胞浸润,早期 肾小 管上皮细胞肿胀,空泡样变性,肾小管轻度扩张,肾小管间质局灶性纤维化,肾脏 损伤程度评分明显高于正常 对照组(P0.05 ) 。 三 周 时 , 叶 酸 性 肾 病 肾 小 管 间 质 纤 维化组血管壁增厚,肾小管萎缩,肾小管间质纤维化,肾小球局灶性硬化,肾脏损 伤程度评分明显高于正常对 照组(P0.05 ) 。 叶 酸 组 在 两 周 、 三 周 时 , 肾 脏 损 伤 程 度评分均明显高于正常对照组,提示叶酸性肾病肾小管间质纤维化模型建模成功。 叶酸两周组和叶酸三周组之 间肾脏损伤程度评 分差异无统计学意义(P0.05 ),即 两者肾脏损伤程度无明显异常。(见表 3、图 3 及图 4) 表 3 小鼠肾脏损伤程度评分情 况 组别 两周 三周 0.32 ?0.20 0.36?0.17 对照组 (n8 ) 1.70 ?0.44 1.96?0.44 叶酸组 (n8 ) A 对照组(两周) B 对照组(三周) C 叶酸组(两周) D 叶酸组(三周) 图 3 两组小鼠两时间点 HE 染色结果 11结果 胸腺 素β4 在 系膜 增生 和肾 小管 间质 纤维 化肾 组织 中的 表达 和 意义 A 对照组(两周) B 对照组(三周)C 叶酸组(两周) D 叶酸组(三周) 图 4 两组小鼠两时间点 Masson 染色结果 5.小鼠肾脏 T β4 的免疫组织化学染色结果: 在正常对照组,T β4 主要在 肾小管上皮细 胞 表达,在肾小球 少量表 达;在叶酸 性肾病肾小管间质纤维 化组,T β4 主要在肾 小管上皮细胞、肾小管 间质纤维化区表 达,同时在肾小管间质纤维化区还可见大量炎细胞浸润。叶酸性肾病 肾小 管 间 质 纤 维化两周组、三周组 平均光度值 均 较正常对照组升高(P0.05 ),即 T β4 在叶酸性 肾病肾小管间质纤维化组的表达高于正常对照组。叶酸两周组 和 叶 酸 三周 组 平 均 光 密度值的差异无统计学意义(P0.05 ),即 T β4 在叶酸两周组和叶酸三周组的表达 无明显差异。(见 表 4, 图 5) 表 4小鼠肾脏 T β4 的表达 组别 两周 三周 0.36?0.03 0.39?0.07 对照组 (n8 ) 0.45?0.02 0.46?0.03 叶酸组 (n8 ) 12胸腺 素β4 在 系膜 增生 和肾 小管 间质 纤维 化肾 组织 中的 表 达 和 意义 结果 A 对照组(两周) B 对照组(三周) C 叶酸组(两周) D 叶酸组(三周) 图 5 两组小鼠两时间点 T β4 的免疫组织化学染色 结果 13讨论 胸腺 素β4 在 系膜 增生 和肾 小管 间质 纤维 化肾 组织 中的 表达 和 意义 讨论 人 体 内 的 β 组 胸 腺 素 主 要 有 胸 腺 素 β4 (T β4 ) 、 胸 腺 素 β10 、 胸 腺 素 β15 三 种, 而T β4 含量 最高 (70%-80% ),T β4存 在于 肝 脏、 肾脏 、 心肌 、神 经系 统 、 皮 肤 、 毛 囊等 组 织 ,且 在 血液 循 环细 胞 、 神经 细胞 等 多 种细 胞 类 型中 含 量很 高 ,T β4 的 广 泛 分布 为 它 发挥 生 理、 病 理作 用 提 供了 基础 ,T β4 参与 了 纤维 化 、 损伤 修 复 、 细 胞 骨 架的 形 成 、血 管 的构 建 等过 程 。 在细 胞内 ,T β4 是细 胞 骨架 构 建 的主 力 军 , 当 细 胞 将其 分 泌 或细 胞 发生 溶 解、 凋 亡 时,T β4 同 样在 细 胞 外进 行 组织 修 复和 再 生 [2]T β4 有一个含有4 个氨基酸的N- 末端,即Ac-SDKP ,是POP 酶作用下的产物,它 发挥着与T β4 相 反的 抗 纤 维化 作 用, 被 认为 是肾 脏 重 要的 保 护 因子 , 在纤 维 性肾 病 [3] 模 型 中 , 应 用Ac-SDKP 后 , 肾 脏 炎 症 及 肾 间 质 的 纤 维 化 明 显 减 少 。T β4 和Ac- SDKP 是一对矛盾的统一体,相互制约维持机 体的生理平衡。 1.T β4 的表达和系膜增生的关系 肾小球硬化从形态学上,主要包括肾小球细胞的散失和细胞外基质的集聚。维 持正常肾小球结构及功能需要三种肾小球细胞,即系膜细胞、足细胞(肾小球腔上 皮细胞)和内皮细胞,任何一方的缺损都有可能导致 肾小球硬化 的 发 生。 当有代谢 异 常 、 免 疫 损 伤 、 血 流 动 力 学 改 变 时 , 系 膜 细 胞 受 激 活 , 出 现 肥 大 、 增 殖 、 凋 亡 等 , 产 生 大 量 的 促 纤 维 化 因 子 , 如 转 化 生 长 因 子 (transforming growth factor- β, TGF- β ) 、血小板源性生长因子(platelet derived growth factor ,PDGF)、纤溶酶 原激活物抑制因子 (Plasminogen activator inhibitor ,PAI )等,同时 产生 基质蛋 白、 趋化因子,启动信号调节通路和氧化应激通路,造成 系膜细胞表型转化,使细胞外 基质大量积聚并取代肾小球固有细胞,系膜细胞 通过自分泌和旁分泌参与肾小球硬 [4] 化过程 越来越多的学者认识到肾小管损伤及纤维化在肾脏纤维化中 起重要作 用,但是 肾 小 球 损 伤 在 某 些 病 变 中 可 能 是 启 动 因 素 , 进 而 引 起 肾 小 管 损 伤 , 导 致 病 变 进 展 [5] [6] 。Satirapoj B 等 也认 为, 肾小球形 态及功 能的异常会引起肾小 管功能的损伤 ,肾 小球疾病的不断进展必将引起肾小管的损伤,肾小管的损伤程度完全取决于肾小球 14胸腺 素β4 在 系膜 增生 和肾 小管 间质 纤维 化肾 组织 中的 表达 和 意义 讨论 病变的程度。肾小球发生硬化、 新 月 体 改 变等, 引 起 过 滤 功 能 的 障 碍 ,继 发 导 致 肾 小管功能的衰退,故许多肾脏病变多发于肾小球和肾小管交界处。在本实验中,比 较 儿 童 不同 程 度 系膜 增 生组 间T β4的 表 达, 平均 光 密 度在 轻 、 中、 重 度系 膜 增生 三 组间差异有 统计学意 义 (P0.05 ),进 一步行 两两比较, 平均光密 度在 轻/ 重、中/ 重 度 系 膜 增生 组 间差 异 有统 计 学 意义 (P0.05 ), 但 在 轻/ 中 度系 膜 增生 组 间差 异 无 统 计学意义 (P0.05 ),提示 随着系膜增 生程度 加重,平均光密 度有增加趋势 ,即T β 4 的表达随着系膜增 生程度的加重 有增强趋势 ,但这种增强趋势在 轻/ 中系膜增生组 间不明 显 。 我 们 推 测 , 发生 系 膜 增 生 时 , 机体在 一 定 的 程 度 内 可 以 通 过自 我 调 节 来 维 持 平 衡状 态 , 当超 过 某个 限 度, 则 会 产生 大量T β4 等 促纤 维 化因 子 , 使肾 小 管 发 生 损 伤 。综 上 所 诉, 虽 然组 织 学显 示T β4主 要在 肾 小 管上 皮 细 胞表 达 ,但 它 与肾 小 球 系 膜 增生 关 系 密切 ,T β4在 儿 童不 同 程度 系膜 增 生 肾组 织 中 的表 达 不同 , 在重 度 系膜增生组上调表达 , 可能参与肾脏系膜增生过程 。 2.T β4 的表达和纤维化的关系 在肾脏纤维化 过程 中,免疫性和非免疫性因素直接损伤肾小球系膜细胞、内皮 细胞、上皮细胞和肾小管上皮细胞及肾小管管周微血管内皮细胞,导致肾素血管紧 张素 系统和氧自由基系统的激活,肾脏释放致纤维化因子,细胞表型发生转 变,发 生EMT 致 肌成 纤 维细 胞增 多 ,形 成纤 维 化。EMT 过 程中 细 胞表 型的 转变 可 以避 免 细 [7] 胞凋亡,有学者也认为EMT 是 机 体 对 慢 性 损 伤 的 应 激 和 生 理 性 改 变 。肾脏肌成纤 维 细 胞 少 量来 自 于 自身 纤 维 母细 胞 , 大部 分 由上 皮 细 胞 肌成 细 胞 转分 化 而 来。EMT 通 常 是 指 上 皮 细 胞 转 分 化 , 后 来 研 究 认 为 , 肾 小 球 内 皮 细 胞 和 足 细 胞 也 可 以 发 生 [8] EMT 。EMT 发生过程中各个环节紧密联系, 目前认为主要包括以下几个环节: 上皮 细胞粘附功能丧失; α- 平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin ,α-SMA )表达; 肾小 管基底膜破坏; 细胞侵袭和迁移能力增强。 EMT 的信号传导途径有TGF- β/Smad 、integrin/ILK 和Wnt/E-catenin 三条, TGF- β /Smad 占 主 要 作 用 ,Smad 还 分 为 几 条 通 路 ,Smad3 促 进 纤 维 化 和 炎 症 ,Smad2 和 Smad7 抑 制 纤 维 化 及 炎 症 、 具 有 肾 脏 保 护 性 ,Smad4 促 进 纤 维 化 但 抑 制 炎 症 , 以 [9] TGF- β/Smad 信号通路为靶点可以进行试验和临床诊治 。EMT 是最早的也是 最 经 典 的 引起 肾 脏 纤维 化 的 关键 步 骤 ,许 多 细胞 因 子 均 通过 影 响EMT 的 发生 来 影 响 [10] 肾脏纤维化 。促进EMT 的因子有: 转 分 化 生 长 因 子TGF- β1, 血小板衍生因子 15讨论 胸腺 素β4 在 系膜 增生 和肾 小管 间质 纤维 化肾 组织 中的 表达 和 意义 PDGF ,缺氧诱导因子1hypoxia inducible factor-1,HIF-1 ,纤溶酶原激活物抑制因 子(PAI-1 ) 等。TGF- β1 被认为是这一过程 中的核心因子, 发挥始动EMT 的作用, 并且可以调节EMT 的 整 个 过 程 ,TGF- β1 刺 激 肾 脏 合 成 胶 原 纤 维 、 胶 原 蛋 白 , 使 上 皮细胞表型转变,粘附蛋白E- 钙 黏 素 表 达 下 降,α-SMA表达上升,促进细胞表型的 [11] 转变及EMT 的发 生 。PDGF能刺激 肾小 球 毛细 血 管 和肾 小 管管 周 血管 的 内皮 细 胞 发生转化,HIF-1 能 增 加 肾 小 管 上 皮 细 胞 的 转 化 率 ,PAI-1 抑 制 肌 成 纤 维 细 胞 溶 解 , 促进EMT 发 生 。 抑 制EMT 发 生 的 因 子 有 肝 细 胞 生 长 因 子hepatocyte growth factor , HGF ) , 骨 形 态 发 生 蛋 白 (BMP-7),AcSDKP 等 。 肝 细 胞 生 长 因 子 促 进 上 皮 皮 细 胞再生, 阻止 上皮细 胞表型 转换 ,BMP-7 和AcSDKP 均可以 拮抗TGF- β1 的作用 ,阻 止EMT 发生。 [12] 国外学者 Fo