哺乳动物克隆技术的应用探讨

哺乳动物克隆技术的应用探讨 06级生物科学一班 张雪 20065234 摘要:随着克隆技术的发展 ,哺乳动物体细胞克隆在生物学、医学等领域有着越来越重要的价值 ,近年来 ,克隆技术不断完善 ,克隆不断优化 ,取得了很多重要的成果。本文综述了近年来哺乳动物体细胞克隆技术的研究进展 ,为其相关研究提供必要的参考。 关键字:哺乳动物 克隆技术 克隆(clone) 来源于希腊文 ,表示用离体的细枝或小树枝增殖 ,后将其引入园艺学 ,指由一个单细胞或共同的祖先经有丝分裂产生出的细胞或生物体所构成的一个群体 ,其繁殖是无性的。哺乳动物克隆 (mammailian cloning)是哺乳动物已经分化的成体细胞核或胚胎细胞核在卵母细胞质环境中能够重演正常精子和卵子受精形成合子的过程 ,从无性发育到出生、成熟的过程 ,克隆的结果是产生遗传上完全一致的后代。 1996 年,1997 年英国科学家开创性的连续用胚胎成纤维细胞(Campbell 等 ,1996) 、成年动物乳腺上皮细胞 (Wilmut 等 ,1997) 获得了克隆绵羊。苏格兰罗斯林研究所于 1997年 2月报道利用体细胞成功克隆了绵羊“多莉 ”,这是世界第一例成体细胞核移植出生的哺乳动物,是人类在该领域研究中的重大突破。随后的短短几年间多种哺乳动物相继被成功克隆。这项技术的出现为发育生物学、医学、制药工程等领域的研究提供了全新的手段。利用这一技术可以在抢救珍奇濒危动物、复制优良家畜个体、扩大良种动物群体、提高畜群遗传素质和生产性能、提供足量试验动物、推进转基因动物研究、攻克遗传性疾病、研制高水平新药、生产可供人移植的内脏器官等研究中发挥作用。目前,体细胞克隆的成功率依然很低。因而,许多学者从不同方面研究了影响体细胞克隆成功率的因素,如核供体、核受体、供受体间的相互作用及核移植操作过程等,其目的在于提高体细胞克隆的成功率。 1 动物克隆的发展历史 1938 年 ,诺贝尔奖获得者、德国胚胎学家提出了动物克隆的最早设想。经过近百年的发展 ,动物克隆技术已实现并取得了许多突破性的成果。据报道 ,动物克隆研究可分为 3 个主要发展阶段 。 1.1 胚胎细胞克隆阶段 胚胎细胞克隆是指所用供核细胞为发育至不同阶段的胚胎细胞进行克隆的技术。1952 年 ,美国研究所的科学家将分化程度较高的囊胚细胞注入去核的卵中 ,得到重构胚卵裂并发育到蝌蚪 , 后证明经变态变成幼蛙 ,这是较早的成果之一。但直到1983 年 ,美国科学家利用核移植技术结合细胞融合方法获得了克隆小鼠才真正拉开了哺乳动物克隆的序幕。此后 ,其他科学家也相继成功地克隆出小鼠、绵羊、牛、兔等。 1.2 同种体细胞克隆阶段 在此阶段 ,所用供核细胞均属同物种的高度分化的体细胞。1997 年 2 月 ,英国罗斯林研究所用成年羊高度分化的乳腺细胞进行了核移植获得了克隆羊“多莉”。这是第一次用成年体细胞作为供核细胞 ,说明高度分化的成年动物的体细胞可在适当条件下发生逆转恢复全能性 ,是生物技术史上具划时代意义的重大 突破 ,是克隆技术的一个里程碑。我国体细胞克隆山羊、克隆牛、猪和兔也都已经获得成功。在同种体细胞克隆研究中，所用供核体细胞为高度分化的体细胞。 1.3 异种体细胞克隆阶段 异种细胞克隆与同种体细胞克隆的差异在于供核体细胞与受体卵母细胞来源于不同物种。即将一种动物的体细胞核移植到另一种动物的去核(遗传物质)卵母细胞中。濒危物种数量日益减少 ,很难提供用于克隆的卵母细胞和代孕受体 ,促使科学家提出了异种克隆的设想:将一种动物的体细胞核移植到另一种动物的去核(遗传物质)卵母细胞中 ,来得以实现克隆的技术。但此阶段技术还处在实验探究阶段 ,还没有完全成熟。 2 克隆技术及其原理 “克隆”(clone) ,即无性繁殖系(asexual reproduction) 。无性繁殖的手段有多种 ,包括孤雌生殖、卵裂球的分离与培养、胚胎切割和细胞核移植等。而产生克隆动物的方法则称之为动物克隆技术 。 通过显微操作技术把细胞核 (供体) 移入去除遗传物质的成熟卵母细胞 (受体) 中 , 细胞核在移入的细胞质的支持下 , 发生发育程序重编 (reprogramming) , 形成重组胚 , 使得核质重组体与正常受精卵一样 , 经细胞分裂、分化 , 并在母体内发育成一个新的动物个体 , 这称为细胞核移植技术。在高等哺乳动物中, 细胞核移植技术是生产克隆动物最为有效的克隆技术 , 因此 , 动物克隆技术实际上是指细胞核移植技术。 目前 , 哺乳动物体细胞核移植技术形成了一套比较完善的程序 , 主要包括: 核受体胞质的准备、核供体细胞的选择和处理、重构胚构建、重构胚激活以及重构胚培养等。 2.1动物克隆技术的核心 克隆是指由一个细胞或个体以无性方式重复分裂或繁殖体所形成的一群个体。克隆动物即动物的无性繁殖。就是将供体细胞核移入去核的卵母细胞中 ,使后者不经精子穿透等有性过程即可被激活、分裂并发育成个体 ,使得核供体的基因得到完全复制。目前动物克隆的技术的核心就是核移植 ,根据供体的来源不同 ,可以分为胚胎细胞克隆和体细胞克隆 。 2.1.1 胚胎细胞克隆 胚胎干细胞是从早期胚胎内细胞团和附植后原始生殖细胞分离出来的一种细胞 ,它具有全能性或多能性 ,可以发育为任何一种组织或器官的前体细胞 ,再由该前体细胞发育成功能细胞。胚胎干细胞像正常的体细胞一样可以在体外进行增殖、克隆、冷冻、保存而保持不分化。这样就可以为人们提供大量的可利用的胚胎干细胞。1980 年 ,Willadsen 将从绵羊八细胞胚胎中分离的胚胎细胞 ,移入已经去核的同种绵羊卵细胞中 ,经培养获得胚胎 ,再将胚胎植入代理母羊子宫中 ,首次获得了胚胎细胞克隆羊。现在人们可将胚胎干细胞体外培养传至40,60 代而不分化 ,而这样大量的细胞就为我们利用它奠定了基础。胚胎干细胞具有可操作性。在体外人们可以对其进行遗传操作选择 ,如转基因、基因打靶、配合基因诱捕等一系列技术 ,再结合核移植技术 ,生产出人们所希望的动物 。 2.1.2 体细胞克隆 对于体细胞克隆来说 ,在细胞分化过程中 ,细胞核全能性的潜能受到限制。尽管细胞核内的 DNA 序列没有改变 ,但基因在特定的细胞内所表达的蛋白质成分有限。这主要是由于染色体组织改变和稳定阻遏核蛋白复合体阻遏以及相应转录激活的缘故。对于成功的核移植来说 ,供体核必须像正常受精卵细胞核一样进行细胞周期活动 ,才能发育成新个体 ,那么作为受体的细胞质就必须有再程序化供体核的能力。在启动供体核的再程序化过程中 ,Ca 起到了至关重要的作用 ,细胞周期调节因子(如 MPF) 也有着重要作用 。此外 ,一些无机离子、DNA 的甲基化以及核质互作都会影响到细胞全能性的发挥 。 3 动物克隆的实践意义 3.1 繁育优良品种及生产实验动物 在畜牧业生产中 ,动物克隆技术的应用可以准确繁殖大量的优良品种。哺乳动物的克隆技术费时少 ,选育的种畜性状稳定 ,通过克隆胚胎的方法能大量繁殖畜群中特别优秀的个体 ,而且易于优良性状的保存 ,克服了某些动物(如牛、羊)世代间隔长、繁育率低的问题 。在育种方面 ,动物克隆技术可以避免在自然条件下受动物育种周期和生育效率的限制 ,可缩短育种年限 ,提高育种效率。同时 ,由于克隆是从细胞开始的 ,这将使不同地区之间的物种交流很便利 ,因此通过克降 ,可迅速对优良畜禽的基因进行整合 ,培养出优良的畜种 。在动物资源的保存方面 ,可以用较少的保存数量获得很好的保存效果 。此外 ,通过动物克隆技术可以建立数目可观的具有相同遗传背景的与基因病相关的实验动物 ,用于医学及药理学研究。 3.2 保护珍稀濒危动物及创造新物种 珍稀濒危动物一般都是由于受环境或内在因素影响繁殖力 ,因此个体数减少 ,但随着克隆技术的发展 ,将突破这些限制 ,大量无性繁殖个体将有利于它们种群的壮大和延续 。在我国 ,被有关国际组织列为世界 20 大濒危灭绝物种之一的大熊猫 ,以及现存数量也不多的金丝猴、东北虎、扬子鳄等国宝级保护动物 ,均有希望通过动物克隆技术得到挽救和保护 。中国科学院动物研究所陈大元研究员提出并研究用异种动物克隆技术来拯救大熊猫 ,如果这项工作能成功 ,将十分有利于繁殖能力低的濒危动物的保护。此外 ,用异种动物细胞核移植和异种动物胚胎嵌合的方法可以获得具有新性状的克隆动物或异种动物的嵌合体 ,这样就能克服种间繁殖障碍 ,创造出新物种 ,获得用传统交配方法无法得到的新性状 。 3.3 应用于器官移植 据报道 ,全世界每天每 l8 分钟就会增加一个等待器官移植的新病人 ,虽然现代医学几乎能对所有人类器官和组织实施移植术 ,但排斥反应和供体缺乏仍是难题。排斥反应的原因是 HLA的多态性导致组织相容性差 ,而动物克隆技术与基因工程技术相结合 ,可以通过改变动物器官组织相容性基因属性 ,从而降低由动物提供的供体器官与人类免疫系统的排斥反应 。也可以考虑用患者本人体细胞核作供体克隆出新的“订做”的组织、器官 ,用于治疗糖尿病、癌症、老年痴呆以及肌肉等组织的损伤和疾病 。目前这一领域的研究与开发正处于起步阶段 ,现已有两家美国公司开始研究利用克隆技术培育人胚胎 ,希望能大批 量生产出治疗疾病的干细胞 。 3.4 生产药物 通过转基因技术和动物克隆技术相结合 ,可以获得表达任何特异性基因的细胞类型 ,生产预期的药物蛋白。目前 ,已经成功实现转基因克隆动物生产药用蛋白。DNX公司(1988)通过将人的血红蛋白基因转入猪细胞 ,实现转基因猪生产人血红蛋白;Kerr(1996)等在转基因小鼠的尿液中表达出人的生长激素;英国鲁斯林 (Roslin) 研究所Wilmut 等与英国 PPL 公司的科学家 Schnieke 等合作(1997) ,用体细胞基因转移克隆技术 ,获得转人凝血因子 IX基因克隆羊 ,这种羊细胞内带有外源的目的基因 ,科学家们从其奶汁中获取了重组药用蛋白 。 4 动物克隆技术上的问题 动物克隆技术取得了一定的进展 , 获得了多种克隆动物 , 但体细胞核移植技术与实际应用之间还有相当大的距离。 4.1 动物克隆技术上的问题 4.1.1 动物克隆的成功率 在实践中 ,克隆动物的成功率还很低 ,维尔穆特研究组在培育“Dolly”的实验中 ,融合了 277 枚移植核的卵细胞 ,仅获得了“Dolly”这一头成活羔羊 ,成功率只有 0.36 %,同时进行的胎儿成纤维细胞和胚胎细胞的克隆实验的成功率也分别只有 1.7 %和 1.1 %,即使是使用 “檀香山”技术 ,以分化程度较低的卵丘细胞为核供体 ,其成功率也只有百分之几 。动物体细胞克隆的成功率很低 ,目前公认成功率为 1 %,3 % 。 4.1.2 生理或免疫缺陷问题 目前大多数研究发现体细胞克隆动物有半数多有严重缺陷或是畸形 ,包括心脏、肺等器官携有罕见的缺陷 ,其中许多未出生就胎死腹中 ,或出生后不久突然死亡 (Gurdon ,l962) 。日本全国已有121 头克隆牛诞生 ,但是存活的只有 64 头 。虽然从理论上讲 ,机体中的每一个细胞都是从受精卵分裂分化而来 ,但从一个受精卵到机体的亿万个细胞 ,有些细胞的个别基因不可避免地会发生不可逆的重组或丢失。分化细胞核内遗传信息在结构上的这种不可逆的改变 ,使它不可能再指导一些独特类型细胞的分化 ,致使发育失败。这样的细胞就不具备了发育的全能性。这一点可能是核移植动物发生高比率的胚胎吸收、流产、出生后死亡或异常的原因之一 。 4.1.3 受体细胞质与供体细胞核周期相容性问题 许多动物克隆未成功的原因就是受体细胞质与供体细胞核之间周期不相容 ,而克隆羊“Dolly”之所以成功 ,关键就在于 Willmut 等找到了一种使供体细胞核和受体卵母细胞更相容的方法 ,供体细胞核在DNA复制时间上与受体卵母细胞基本同步(Gurdon等 ,1997) 。 4.1.4 早衰问题 即使克隆的动物成功地出生了 ,并且没有先天性疾病 ,可是它们仍然面临着一个严重的问题就是早衰 ,即使是正常发育的“Dolly”,也被发现有早衰迹象。但是可以肯定的是早衰现象不一定是与染色体的端粒长度联系在一起的 。 4.2 破坏了自然界的多态性 因为动物克隆技术培育出来的动物都具有同样的基因型 ,这就导致了个体 间没有差异 ,使动物之间失去了遗传的多样性 ,最终破坏了自然界的多态性。 4.3 动物克隆所产生的伦理问题 若将克隆动物应用于人类 ,将会导致各种各样的伦理、法律问题。世界卫生 组织于第五十次年会中做出决议 ,明确指出利用克隆技术复制人类个体在理论 上是不可接受的 ,这一行为同人类的诚实和道德背道而驰 。 5 结束语 克隆技术在农业、生物制药和医学研究及生物学基础方面有巨大的发展潜 力 , 特别是在异种器官移植、生产药物蛋白和研究分子发育机理方面有积极的 现实意义。克隆技术今后要在核移植原理指导下 , 围绕核质关系和调控机理及 核移植胚胎发育过程中的基因表达和分子机理 , 与医学临床紧密联系 , 走畜 牧业的理论结合实际的道路 , 进行生殖机理、生理调控、发育机制和动物克隆 等方面的实验胚胎学研究 , 不断地解决克隆技术在生产实践中出现的问题 , 以期完善克隆技术理论体系 , 提高克隆效率 , 促进体细胞核移植为核心的克 隆技术的转基因动物和干细胞工程及治疗性克隆研究的发展 , 为医学研究和临 床实践做好铺垫工作 , 运用克隆技术造福人类。 参考文献: [1] 曹宏楷 动物克隆技术研究进展,J,江西畜牧兽医杂志，2005(4) [2] 程乐平,景乃禾.动物克隆技术的研究进展[J].生命的化学, 2000 ,20(1) [3] 贾 青.动物克隆的机理及其潜在问题[J ]. 当代畜牧,2005 (6) [4] 黄雅琼，杨素芳，农微，等 .动物克隆技术的研究进展、存在问题及应用 前景[J].广西农业生物科学， 2008 27(2) [5] 李 宁,李 青.生物医药中的转基因动物研究与开发[J ].高技术通讯, 2000(11) [6] 李雪峰. 牛卵母细胞孤雌激活与体细胞核移植 [D]. 杨凌: 西北农林科 技大学 , 2001. [7] 石德顺. 动物繁殖生物技术 [M]. 北京: 中国农业出版社 , 2002 [8] 肖红波, 胡亚平. 动物克隆的研究新进展[J ]. 动物科学与动物医 学,2003 , (20) 5 [9] BAGUISI A , BEHBOODI E, MELICAN D T, et al1 Production of goats by somatic cell nuclear transfer [J ]. Nat Biotechnol , 1999 , 17 (5) [10] Kikyo N. ,Wolffe AP. . Reprogramming nuclei :insight from cloningnuclear transfer and heterokaryons[J]. J Cell Sci. ,2000 ,113 :12. [11] Prather RS. , Tao T. ,Machaty Z. . Development of the texhniques for nuclear transfer in pigs[J]. Theriogenology ,1999(51)