采用Percoll密度梯度及免疫磁珠法分离人骨髓巨核细胞_cropped

采用Percoll密度梯度及免疫磁珠法分离人骨髓巨核细胞_cropped 富集巨核细胞 ,采用抗血小板球蛋白 ?b2 ?a 单克隆抗体和免疫磁珠法获得进一步纯化的巨核细胞 ;用台盼蓝活 性测定及 Wright2Giema 染色及抗 Gp ?b/ ?a 组织化学染色确定 。结果 此法可获得的巨核细胞纯度达 90 %以 上 ,结构完整 ,大约 50 %巨核细胞具有生物活性 ,可作短期培养 。结论 免疫磁珠法分离骨髓巨核细胞是一种 有效的纯化分离巨核细胞的方法 。 () ,2004 ,19 5:360 - 361 [ 关键词 ] Percoll 密度梯度法 ;免疫磁珠法 ;巨核细胞 () 文章编号 ] 1003 - 515 X200405 - 0360 - 02 [ [ 中图分类号 ] R725 . 5 [ 文献标识码 ] A () ,光学显微镜下形态学 骨髓巨核细胞在骨髓中含量极低 2010 r/ min,去上清 ,将悬液置于改良 PBS 中备用 。此步骤 1 可使巨核细胞浓集 9 倍 。3 . 免疫磁珠法分离巨核细胞 : 将上 %上可辨认的巨核细胞不到有核细胞 0 . 2 。免疫磁珠法 8 述获 得 的 细 胞 悬 液 按 照 每 1 ×10骨 髓 单 个 细 胞 悬 液 加 入 分离骨髓巨核细胞是目前国际上普遍采用的一种分离技术 , 可简单 、迅 速 获 得 高 纯 度 巨 核 细 胞 。此 技 术 在 国 内 刚 刚 起 μ1 l 血 小 板 球 蛋 白 ?b2 ?a 单 抗 , 充 分 混 匀 。冰 水 孵 育 30 步 ,尚不成 熟 。本 文 采 用 此 方 法 对 骨 髓 中 巨 核 细 胞 进 行 分 min ,轻轻混匀 1 次/ 10 min 。经改良 PBS 彻底洗涤后 ,向经单 离 。现报道如下 。 8 μ抗孵育的每 1 ×10骨髓单个细胞中加入 0 . 5 l 经洗涤的羊 抗鼠 Ig G 免疫磁珠 ,混匀后在冰水中继续孵育 30 min ,轻轻和方法 混匀 1 次/ 10 min ,然后将试管紧贴于磁铁上约 10 min ,将无 ( 磁珠附着的细胞悬液轻轻吸去 注意不要搅动液体 , 以免使 一 、材料 1 . 磁铁 Dynal M PC2L ,挪威 Dynal 公司产品 , ) 与磁珠结合的贴壁细胞落下,用改良 PBS 反复轻轻冲洗 4, 购自北京安 普 生 化 科 技 有 限 公 司 ; 2 . 羊 抗 鼠 Ig G 免 疫 磁 珠 6 次 ,移去磁铁 。保留管底的悬液 ,备用 。4 . 巨核细胞的鉴定 Dynabeads M2450 ,挪威 Dynal 公司 产 品 , 购 自 北 京 安 普 生 化 和活性确定 :巨核细胞的活性通过观察其对台盼蓝拒染而确 ( ) 科技有限 公 司 ; 3 . 抗 血 小 板 球 蛋 白 ?b2 ?a CDW41, 规 格 定 。巨核细胞则通过 Wright2Giemsa 染色和抗 GP ?b/ ?a 单 μ100g ,美国 Kamiya Bio medical Co mpany 生产 ,购自深圳晶美 抗进行免疫组织化学染色确定 。 公司 ; 4 . 羊抗免 Ig G ABC kit 试剂盒 , 美国 L abvisio n 公司产 品 ;5 . 牛血清清蛋白 ,美国 Sigma 公司产品 ; 6 . Percoll 细胞分 离液 ,上海华美公司产品 。 结 果 二 、方法 1 . 骨髓单个细胞悬液制备 : 骨髓来源于肺部 肿瘤患者术中切除肋骨 ,用骨钳将肋骨内的骨髓挤入改良的 经免疫磁珠分离后 , 瑞氏染色光学显微镜下观察 , 形态 ( PBS 中 13 . 6 mmol/ L 枸 橼 酸 钠 , 10 mmol/ L ED TA , 学可辨认的巨核细胞占 90 %以上 ,活性在 50 %以上 ,所有 ) 2 mmol/ L 茶碱 ,1 mmol/ L 腺苷和 3 %牛血清清蛋白,用吸 被分离的巨核细胞均覆有 1,20 个免疫磁珠 ,巨核细胞结构 管轻轻吹打 ,通过 100 目尼龙网 ,以去除黏连组织及血凝块 , 完整 ,胞浆颗粒均匀分布 ,边缘光整 ,可见到各阶段巨核细胞 8 离心后去上清 ,用改良 PBS 调为 1 ×10/ ml 骨髓单个细胞备 及一些淋巴细胞样 ,形态学不易被确认未成熟巨核细胞 。这 用 。2 . Percoll 密度梯度分离骨髓巨核细胞 : 将上述细胞悬液 些细胞对单抗 GP ?b2 ?a 进行免疫组织化学染色均呈阳性 与 Percoll 混合 ,获得密度为 1 . 020 g/ ml ,将 28 ml 该混合液置 反应 。分离的细胞中也可混入少量单核细胞和淋巴细胞 。 ( ) 于 50 ml 塑料离心管内 12 ml ,密度为 1 . 050 g/ mlPercoll 之 ( ) 上 ,室温离心 20 min 2680 r/ min, 将界面以上及界面的液 体 吸 出 , 与 1 . 5 倍 体 积 改 良 PBS 混 合 , 离 心 10 min 讨 论 随着科技发展 ,采用免疫磁珠吸附分离技术纯化造血干 2 ,3 细胞已成为现实。过去对骨髓巨核细胞分离纯化多采用 离心提取法 ,但这些方法操作复杂 、费时 、纯度不高 , 且巨核 4 细胞易遭受机械性损伤 。Tanaka 等首次报道采用单克隆 [ 收稿日期 2003 - 11 - 20 抗体和免疫磁珠分离人骨髓巨核细胞获得成功 。采用此法 ( ) [ 作者简介 ] 黄细莲 1976 - ,女 ,硕士学位 ,研究方向为血液系统疾 且可短期培养 ,故渐成为研究巨核细胞最有效方法 , 近几年 所分离的巨核细胞覆有数量不等的免疫磁铁 ,得到有活性的 国内有学者尝试单用免疫磁珠法对巨核细胞进行分离 ,但未 巨核细胞 50 %左右 。这可能是由于巨核细胞本身易损 、洗 5 涤次数较多及分离过程中磁珠对巨核细胞机械性损伤所致 。 能得到推广应用。 Percoll 密度梯度结合免疫磁珠分离人骨髓 巨 核 细 胞 是 目前国际上认可的 、有效的分离巨核细胞的技术 , 本文采用 [ 参考文献 ] 此方法分离骨髓巨核细胞具有以下优点 : 1 . 巨核细胞以特异 1 张义国 ,董子明 ,赵明耀 ,等. 转输树突细胞疫苗免疫脾淋巴细胞 性方式结合于磁珠上 ,由于与巨核细胞共同孵育的单克隆抗 对小鼠骨髓瘤的继承性免疫防治作用 J . 河南医科大学学报 , 体是特异性的 ;2 . 方法简单 、快速 , 不需特殊贵重仪器 , 可在 ( ) 任何实验室进行 ; 3 . 免疫磁珠不是永磁的 , 磁场移去后免疫 1999 ,34 1:30 - 32 . 徐学聚 ,汪凤兰. 脐血造血干细胞移植研究进展 J . 实用儿科临 磁珠不聚集在一起 ; 在冲洗过程中 , 一部分磁珠可从细胞上 2 ( ) 床杂志 Shiyo ng Er ke Linchuang Zazhi ,1998 ,13 2: 119 - 120 . 刘脱落 ;覆盖 于 巨 核 细 胞 胞 浆 边 缘 的 磁 珠 对 巨 核 细 胞 并 无 毒 + 忠文 ,邹 萍. Fas 配体基因逆转录病毒途经转染骨髓 CD细 胞34 性 ,不影响其生物学活性 ; 4 . 采用此法分离获得的巨核细胞 3 ( ) J . 河南医药信息 ,2002 ,10 18:2 - 3 . 纯度高 ,超微结构保持完整 。这些细胞可作短期培养 , 这就 为巨核细胞的细胞生物学和分子生物学研究提供方便 ,给再 4 Tanaka H , Ishida Y , Kaneko T , et al . Isolation of human megakaryocytes 生障碍性贫血 、免疫性血小板减少性紫癜及与巨核细胞有关 by immunomagnetic beadsJ . Br J Haematol ,1989 ,73 :18 - 22 . 疾病发病机制及治疗方面研究提供方便 。存在的主要问题 : 5 戴碧涛 ,蒋纪恺. 巨核细胞的免疫磁珠分离及生物学鉴定 J . 中 ( ) 华血液学杂志 ,1995 ,3 16:155 - 156 特发性血小板减少性紫癜 T 淋巴细胞 亚群和免疫球蛋白变化 张惠荣 ,宁建英 ,杨 红 ()石河子大学医学院第一附属医院 儿科 ,新疆 石河子 832008 ( ) ( ) [ 摘要 ] 目的 探讨特发性血小板减少性紫癜 I TPT 淋巴细胞 TC亚群和免疫球蛋白的变化 ,为治疗提供 更多方法 。方法 对 I TP 患儿 40 例和对照组 19 例取静脉血进行 TC 亚群和免疫球蛋白检测 。结果 观察组 (() ) ( ) ( ) CD3 为 7 . 84 ?6 . 05%明显低于对照组 62 . 82 ?4 . 88% P < 0 . 01;观察组 CD4 35 . 42 ?3 . 72%明显低于对 照 (( ) ( ) () ) ( ) 组 39 . 00 ?4 . 60% P < 0 . 01;观察组 CD8 27 . 18 ?5 . 91%高于与对照组 23 . 53 ?4 . 50% P < 0 . 05; 观 (( () ) ( ) ) 察组 CD4/ CD8 1 . 29 ?0 . 34明显低于对照组 1 . 58 ?0 . 12P < 0 . 01;观察组 Ig G 为 8 . 83 ?2 . 5g/ L 与对照 组 (( ( ) ) ( ) ) ( 8 . 50 ?3 . 5g/ L 比较无明显变化 P > 0 . 05; 观察组 IgA 0 . 94 ?0 . 23g/ L 明显高于对照组 0 . 82 ?0 . 27g/ L P () () ) ( ) < 0 . 05;观察组 IgM 0 . 81 ?0 . 45g/ L 低于对照组 1 . 02 ?0 . 45g/ L P < 0 . 05。结论 I TP 的血小板 减少与细胞和体液免疫的改变有关 。 () ,2004 ,19 5:361 - 362 [ 关键词 ] 紫癜 ,血小板 ,减少 ; T 淋巴细胞亚群 ;体液免疫 () [ 文章编号 ] 1003 - 515 X200405 - 0361 - 02 [ 中图分类号 ] R725 . 5 [ 文献标识码 ] A 9 ( ) ( ) I TP是 一 种 自 身 免 疫 性 疾 特发性血小板 减 少 性 紫 癜 月,12 岁 。血小板 8 , 78×10/ L 。均为初发或复发住院1 患儿 ,经临床 、血常规 、骨髓分类计数及辅助检查证实 。诊断 病 ,主 要 与 机 体 免 疫 功 能 紊 乱 有 关。当 血 小 板 < 30 × 2 9 符合第 2 届全国血液学会议制定诊断标准。检测前 3 10/ L ,伴重要脏器出血尤其脑出血时可引起死亡 ,应采取积 个月内未输血及未用激素类药物 。2 . 对照组 : 我院保健科健 ( ) 极措施 。本文检测 40 例 I TP 患儿血 T 淋巴细胞 TC亚群 康体检小儿 19 例 ,男 12 例 ,女 7 例 ,年龄 2 个月,12 岁 。免 和免疫球蛋白 。现如下 。 疫球蛋白以《临床检验实用诊断手册》中正常值为标准 。 二 、方法 TC 亚群检测采用 A PAA P 法 ,诊断试剂盒购 材料和方法 自北京军事医学科学院 ;免疫球蛋白检测采用单向琼脂扩散 一 、对象 1 . I TP 组 40 例 ,男 17 例 ,女 23 例 。年龄 2 个 法血清购自上海生物制品研究所 。 结 果 [ 收稿日期 2004 - 02 - 08 ( ) [ 作者简介 ] 张惠荣 1966 - ,女 ,副主任医师 ,在职硕士研究生 。两组 TC 亚群和免疫球蛋白比较 见 1 ,2 。