外周血来源的成体干细胞的体外培养鉴定以及在皮肤创伤修复中作用的研究（可编辑）

外周血来源的成体干细胞的体外培养鉴定以及在皮肤创伤修复中作用的研究（可编辑） 外周血来源的成体干细胞的体外培养鉴定以及在皮肤 创伤修复中作用的研究 分类号 密级 公 开国际十进分类号(UDC) 第四军医大学 学位论文外周血来源的成体干细胞的体外培养鉴定 以及在皮肤创伤修复中的作用研究 (题名和副题名) 刘 鹏 (作者姓名) 金 岩教 授主任医师 指导教师姓名 口腔医学院口腔组织病理学教研室 指导教师单位 博士 口腔基础医学 申请学位级别 专业名称 2008.04 2008.05 论文提交日期 答辩日期 2005年8月至 2008年 4 月 论文起止时间 第四军医大学 学位授予单位 独 创 性 声 明 独 创 性 声 明 秉承学校严谨的学风与优良的科学道德,本人声明所呈交的论文是我 个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知,除了文 中特别加以标注和致谢的地方外,论文中不包含其他人已经发或撰写过 的研究成果,不包含本人或他人已申请学位或其他用途使用过的成果。与 我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明 并表示了致谢。 申请学位论文与资料若有不实之处,本人承担一切相关责任。论文作者签名: 日期: 保 护 知 识 产 权 声 明 保 护 知 识 产 权 声 明本人完全了解第四军医大学有关保护知识产权的 ,即:研究生在 校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属第四军医大学。本人保证毕业 离校后,发表论文或使用论文工作成果时署名单位仍然为第四军医大学。 学校可以公布论文的全部或部分内容(含电子版,保密内容除外),可以采 用影印,缩印或其他复制手段保存论文。学校有权允许论文被查阅和借阅, 并在校园网上提供论文内容的浏览和下载服务。 论文作者签名:导师签名: 日期: 外周血来源的成体干细胞的体外培养鉴定以及在 皮肤创伤修复中的作用研究研 究 生: 刘 鹏 学科专业:口腔基础医学(口腔组织病理学) 所在单位:口腔医学院口腔组织病理学教研室 导 师: 金 岩 教授 辅导教师: 刘 源 博士 资助基金项目:“863 ”组织器官工程重大专项课题号 20060102A1001 2007~2010 关键词:成体干细胞,分化,组织工程,成纤维细胞,创伤修复,动物模型, 干细胞移植 中国人民解放军第四军医大学 2008 年 05 月 第四军医大学博士学位论文 目 录 缩略语表1 中文摘要3 英文摘要7 前 言. 12 文献回顾. 13 一、外周血来源的成体干细胞研究进展 13 1. 细胞来源和定义 13 2. 外周血来源的成体干细胞的功能特点和多向分化潜能. 17 二、外周血来源的成体干细胞与皮肤创伤修复 24 三、外周血来源成体干细胞和皮肤组织细胞的联系和相互影响. 29 正 文. 34 第一部分 外周血来源成体干细胞的体外培养和鉴定. 34 第二部分 外周血来源成体干细胞在体外培养过程中的多向分化能力研究 43 第三部分 体外观察循环成纤维细胞对皮肤组织细胞的作用影响 53 实验一 共培养条件下循环成纤维细胞对皮肤组织细胞的影响 54 实验二 体外观察三维环境下循环成纤维细胞对皮肤组织细胞的影响 63 第四部分 循环成纤维细胞参与裸鼠皮肤创伤修复的实验研究. 67 小 结. 73 参考文献. 75 附 录. 85 个人简历和研究成果 94 致 谢. 95第四军医大学博士学位论文 缩略语表 缩略词 英文全称 中文全称 ES Embryonic stem cell 胚胎干细胞 AS Adult stem cells 成体干细胞 CF Circulating fibrocyte 循环成纤维细胞 循环间充质干细 PBMSC Peripheral blood mesenchymal stem cells 胞 成纤维细胞集落 CFU-F Colony forming unit-fibroblast 形成单位 MSCs Mesenchymal stem cells 间充质干细胞 HSC Hematopoietic stem cells 造血干细胞 骨髓间充质干细 BMSCs Bone marrow stromal stem cells 胞 KCs Keratinocytes 皮肤角阮细胞 FBs Fibroblasts 皮肤成纤维细胞 s-Mφ s-Macrophages 巨噬细胞 f-Macrophagesf-Mφ 纤维样巨噬细胞 人重组巨噬细胞 hM-csf human-Macrophage’s-colony-stimulating-factor 集落刺激因子 EGF Epidermal growth factor 表皮生长因子 NGF Nerve growth factor 神经生长因子 人重组促血小板 hTPO humanThrombopoietin 生成素 -1-第四军医大学博士学位论文 碱性成纤维细胞 bFGF basic fibroblast growth factor 生长因子 FBS Fetal bovine serum 胎牛血清 Reverse transcription - polymerase chain 逆转录聚合酶链 RT-PCR reaction式反应 四甲基偶氮唑盐 3-4,5 - dimethylthiazo; - 2 ? yl -2, MTT 微量酶反应比色 5-diphenytetralium bromide 法 DMSO Dimethyl sulphoxide 二甲基亚砜 神经元中间丝蛋 NF Neurofilament 白 神经元特异性烯 NSE Neuronal specific enolase 醇酶 α-SMA α smooth muscle antibody α平滑肌抗体 Pan-CK Pan-cytokeratin 广谱角蛋白-2-第四军医大学博士学位论文外周 血来源的成体干细胞的体外培养鉴定以 及在皮肤创伤修复中的作用研究 博 士 研 究 生:刘 鹏 导师:金 岩 教授 中文摘要 除了骨髓组织,成人外周血中也存在着如造血干细胞(HSCs)和间充 质干细胞MSCs等多潜能干细胞成分。相对于骨髓的采集,外周血的干细胞 采集具有供体创伤小、来源广泛和自体取材无免疫排斥反应等优点。近年来, 循环间充质干细胞(Peripheral Blood Mesenchymal Stem Cells,PBMSCs) 和 循环成纤维细胞(Circulating Fibrocytes,CF)这两种新型的多潜能成体干 细 胞在人类以及其他哺乳动物外周血中被发现并鉴定,它们在机体组织器官的 正常和非正常功能活动和创伤修复中发挥着重要的作用。 本研究着眼于应用成体干细胞分离技术,在体外分离培养外周血来源的 成体干细胞?循环成纤维细胞,观察它们在体内和体外的细胞增殖、分化、 以及与多种皮肤组织细胞的相互作用;从细胞因子调控等多方面研究其作用 机理,并将其应用于皮肤创伤的修复过程,为组织工程皮肤的研究开辟了新 的思路,更有助于提高组织工程皮肤产品的临床应用效果。 本研究主要分为四个部分 1. 人外周血来源成体干细胞的体外培养和鉴定 -3-第四军医大学博士学位论文目的:通过多种方法分离人外周血单个核细 胞,在不同条件下获得 CF, 研究了其细胞增殖特点和对其进行了详细的鉴定。方法:采用淋巴细胞分离 液Percoll/ Ficoll分离含有外周血单个核细胞的白细胞群,直接体外培养或 磁珠分选法分离单个核细胞进行培养,从而获得 CF 细胞;通过不同细胞因 子促进 CF 细胞增殖,比较效果;培养过程中描画 CF 细胞生长曲线;应用 免疫组织化学方法和流式细胞仪对体外培养的细胞进行鉴定。结果:通过分 离成人外周血单个核细胞的方法可以获得纯度较高的 CF 细胞;在培养过程 中应用 M-csf和 TPO 两种细胞因子可以促进 CF细胞的成熟和增殖;细胞生 长曲线显示经过细胞因子的促进作用,CF 细胞在体外培养过程中增殖速度 加快。其中合适浓度的 TPO 的促进作用更为明显且细胞转化率低,是理想 的促进 CF 细胞体外增殖的作用因子;免疫组织化学鉴定结果显示,本实验 中体外培养获得的贴壁纤维样细胞表达 Collagen ?且有 Collagen ?阳性的 基质分泌。流式细胞仪鉴定结果显示体外培养的细胞其表面标志性抗原的表 达随着时间改变而不断变化,但均符合 CF 细胞的特征。鉴定结果显示获得 的细胞明确属于 CF细胞。 2. 外周血来源成体干细胞在体外培养过程中的多向分化能力研究 目的:探讨 CF 细胞作为一种多潜能成体干细胞其成骨、成脂和向神经 细胞分化的能力。方法:采用与雪旺细胞(Schwann cells,SCs)共培养以 及直接添加细胞因子 NGF的方法,促进 CF细胞向神经细胞分化,通过免疫 组织化学、Western blot 以及 RT-PCR等方法对诱导的细胞进行鉴定;以添加 地塞米松 (dexamethasone,100 nM);β磷酸甘油钠(β-glycerophosphate, 10 mM); 维生素 C/抗坏血酸(Ascorbic acid,50 μM)等试剂的培养基对 CF 细胞进行成骨诱导,通过大体形态和茜素红染色鉴定诱导的细胞;以地 塞米松( dexamethasone, 1 μ M)、0.5 mM 3-异丁基 -1-甲基黄嘌呤 (3-isobutyl-1-methylxanthine,IBMX)、胰岛素(insulin,10 μg/ml)、吲哚美 辛(Indomethacin,100 mM)等试剂为活性成分的成脂诱导液,对体外培养-4-第四军医大学博士学位论文 的 CF细胞进行成脂诱导,通过大体形态和油红 O染色鉴定诱导的细胞。结 果:免疫组织化学染色结果显示在两种诱导条件下 CF 细胞均表达神经标志 物 NSE和 NF-H。western blot 和 RT-PCR结果也显示同样的结果且共培养组 的表达更强。成骨诱导结果细胞茜素红染色显示阳性,显示 CF 细胞在一定 条件下具备成骨分化能力;油红 O 染色结果显示阳性说明 CF细胞可以向脂 肪细胞转化。 3. 体外观察循环成纤维细胞对皮肤组织细胞的作用影响 目的:1)二维环境下通过共培养的方法观察 CF细胞对皮肤组织细胞的 作用影响;2)三维条件下通过体外构建复合 CF细胞的组织工程人工皮肤, 观察 CF 细胞对皮肤组织细胞的作用影响。方法:1)以丝裂霉素 C 处理体 外培养的原代 CF 细胞,使其成为类滋养层细胞;将体外分离培养的真皮成 纤维细胞(Fibroblasts,FBs)和皮肤角阮细胞(Keratinocytes,KCs)与制 备的类滋养层 CF直接接触共培养,通过直接光镜观察、 MTT法、 BrdU-ELISA 掺入法、流式细胞仪分析细胞周期以及细胞运动(划痕)实验(Scratch assay) 等手段观察两种皮肤组织细胞在体外的形态和增殖变化。2) 体外构建具有 复合 CF细胞的真皮层的组织工程人工皮肤,通过大体观察,HE染色组织学 观察, Pan-CK免疫组织化学染色等手段研究三维环境下 CF细胞对皮肤组织 细胞的作用影响。结果:1)丝裂霉素 C 处理后的 CF 细胞多次传代后基本 停止增殖,经过与皮肤组织细胞的共培养后逐渐死亡;与类滋养层 CF 细胞 共培养的 FBs 细胞形态基本没有明显变化,而 KCs 则形态变化明显,出现 表皮去分化特征性的细胞形态;MTT、BrdU-ELISA 和流式细胞仪分析细胞 周期显示共培养后的 FBs 增殖加快,而 KCs 则增值速度减慢,提示 CF细胞 促进 FBs 的增殖作用和对 KCs 的抑制作用;细胞划痕试验则显示共培养后 的 FBs 细胞移行能力加强,而 KCs 则呈现相反的趋势。2)与具有单纯复合 成纤维细胞真皮的对照组相比,复合有 CF 细胞的真皮层的组织工程皮肤体-5-第四军医大学博士学位论文 外培养过程中体积收缩更为明显,提示成纤维细胞增殖加速;但与正常对照 组相比,其上皮化过程不良,角化层结构较差。 4. 循环成纤维细胞参与裸鼠皮肤创伤修复的实验研究 目的:将体外分离培养获得的人 CF细胞通过循环途径移植入裸鼠体内, 观察其参与皮肤组织创伤修复的效果。方法:建立裸鼠背部全层皮肤创伤模 型;体外以 PKH 荧光染料标记体外培养的人 CF 细胞;鼠尾静脉注射方法 26 将标记好的人 CF 细胞移植入裸鼠创伤模型体内,设立空白对照;大体观察 创面愈合情况,测量各组创面面积计算创面收缩率,3w 左右采用抗人单克 隆抗体(Pan-CK,α-SMA,?等)对创伤部位皮肤组织进行取材免疫组织 化学染色;定期取创面组织进行 HE染色组织学观察,冰冻切片进行荧光显 微镜检测 PKH 阳性细胞。结果:实验组和对照组裸鼠创伤皮肤均出现愈合, 26 通过大体观察和计算创面收缩率结果发现实验组的创面愈合快于对照组;实 验组愈合创面的上皮化较对照组好,血管生成更丰富;实验组和对照组在各 时间段均未在创面区域组织内发现 PKH 阳性的细胞;抗人单抗免疫组织化 26 学染色结果显示实验组创面区域在 3w 后各抗体均有表达,提示迁移至裸鼠 皮肤创面参与修复的细胞可能来源于移植的人 CF细胞。 综上所述,CF 细胞在体外来源广泛,体外较易分离培养,通过某些细 胞因子的作用可以有效促进其增殖。CF 细胞作为一种创伤修复过程中的重 要效应细胞,能有效促进 FBs 的增殖和提高其迁移能力,但其对 KCs 细胞 是否在体内和体外作用一致还需要进一步研究;作为一种 AS细胞,CF细胞 在体外一定条件下可向多个方向进行分化,在干细胞移植治疗应用中具有重 要研究和应用价值;通过体内移植 CF 细胞可以有效促进皮肤创面的愈合, 在急慢性以及大面积皮肤创伤的治疗上具有良好应用前景 关键词:成体干细胞,分化,组织工程,成纤维细胞,创伤修复,动物模型, 干细胞移植 -6-第四军医大学博士学位论文 Abstract Adult stem cells from peripheral blood ? cell culture, identification and their applications in skin repair Candidate for doctor: Peng Liu Supervisor: Prof. Yan Jin Department of Oral Histo-pathology, Stomatology College, Fourth Military Medical University, Xi’an 710032, China As in bone marrow, there are two kinds of multipotential stem cells in adult peripheral blood, including haemopoietic stem cells HSCs and mesenchymal stem cells MSCs,which have more abundant source and are easier to be separate in vitro. They also have the predominance of autoallergic origin without immunological rejection and minimal trauma of donator. For the past few years, as two new types of multipotential adult stem cells, peripheral blood mesenchymal stem cellsPBMSCs and circulating fibrocytesCF were found and identified in peripheral blood of human and other mammalian. These cells play their important roles in normal and abnormal functions of organism and the repair of defects In this research, we try to isolate circulating fibrocytes from human peripheral blood by a adult stem cell tech in vitro, and observe the cell proliferation and differentiation of CF and their influence upon multiple skin tissue cells. We also apply them to the repair of skin defects. The results develop a new path of -7-第四军医大学博士学位论文 application in tissue engineering skin and increase their possibility for clinic applicationsThere are four parts in this research as follows Part 1:Culture and identification of an adult stem cell from human peripheral blood in vitro: Objective: To isolate mononuclear cells from human peripheral blood by different methods and investigate the cell proliferation and identification of CFMethods: Human mononuclear cells were separated by Percoll/Ficoll for direct culture or immunomagnetic magnetic beads sorting(MAC) in vitro. The CF cells were derived at last; Multiple cytokines were used to stimulate the proliferation of CF and growth curve of cultured cells was drawn; Immunohistochemistry and flow cytometry were utilized for identification of CF. Results: High purity of CF cells were cultured by mean of mononuclear cells separation from peripheral blood; M-csf and TPO both stimulated the cell proliferation of CF in vitro; Growth curve of cultured cells indicate that TPO performs a oppressive role in stimulating of cell proliferation and exhibited lower transdifferentiation efficiency between two kinds of cytokines. So we conclude that TPO is a ideal cytokine for amplification of CF cells; Immunohistochemistry results indicated that cultured cells and their ECM express Collagen ?; Flow cytometry indicate that the level of specified surface markers like CD34 and CD14 did change time to time. And this phenomenon does accord with the specification of CF cells in vitroPart 2: Mutiple differentiation potency of an adult stem cell from peripheral blood Objective: To investigate the multiple differentiation capacity of CF as an adult stem cell. Methods: Nerve growth factor and Co-culture with Schwann -8-第四军医大学博士学位论文 cells SCs were applied for neural induction of CF. Immunohistochemistry, western blot and RT-PCR were utilized for identification of differented cells; Dexamethasone100 nM, β-glycerophosphate10 mM and Ascorbic acid50 μM were added in the medium of cultured CF for Osteogenesis induction. The cells were incubated with adipogenic induction medium DMEM containing 10% FBS, 1 _M dexamethasone, 0.5 mM methyl-isobutylxantine, 10μg/ml insulin, and 100 mM indomethacin; all from Sigma. After 72 h, the medium was changed to maintenance medium DMEM containing 10% FBS and 10μg/ml insulin for 24 h. The cells were treated three times with adipogenic induction medium and maintained in the maintenance medium for one additional week; And these cells at last were fixed for Oil-red staining and alizarin red stainingResults: Immunohistochemistry indicated that NSE and NF-H were both expressed after these two neural induction procedures. The alike situation did exist in the results of western blot and RT-PCR. And in latter two procedures ,Co-cultured groups did express a higher level of NSE and NF-H; CF cells treated with the osteogenic and adipogenesis induction procedure under went a change in their morphology from spindle-shaped to cuboidal or bigger and rounder one; Some parts of adherent cells formed calcium deposits, which stained with alizarin red and Oil-red staining Part 3 : Investigation of effects of circulating fibrocytes on skin tissue cells Objective: 1 To investigate the effects of CF cells on skin tissue cells by co-culture them together in 2- dimension in vitro. 2 To investigate the CF effects on skin tissue cells by preparation of tissue engineering skin in vitro. Methods:1 CF cells were exposed to Mitomycin-C for preparation of trophocyte ?like cells; Fibroblasts and keratinocytes were isolated and harvested to co-culture with exposed CF. Skin tissue cells proliferation and migration were investigated -9-第四军医大学博士学位论文 through direct light microscope observation, MTT assay, BrdU-ELISA assay, cell cycle assay and cell scratch assay. 2)Full thickness tissue engineering skin with or without control were prepareded in vitro in the method of our Labs. And these artificial skin films were investigated by macro observation, HE staining and Pan CK staining. Results: 1 CF treated with mitomycin-C did exhibit a trophoblast specification; Co-cultured FBs did change too much in there morphous but the KCs exhibit a dedifferentiation trend; MTT assay, BrdU-ELISA , cell cycle assay, scratch assay and 3-dimension investigation indicated that CFs did simulate the proliferation and migration of FBs but exhibit a inhibited one on KCs in vitroPart 4. An investigation of skin repair in Nude mouse by circulating fibrocytes Objective: To investigate the effect of in vitro harvested and circulating transplanted CF on skin repair of Nude mouse. Methods: Full thickness skin defect module was prepared on the back of Nude mouse as an acute skin injury model. CF labeled with PKH were injected from tail vein of Nude mouse in 26 experimental group, and PBS was for the blank control. Macro observation and contraction rate were estimated in the whole period of recoveryImmunohistochemistry Anti human monoclonal Pan-CK, α-SMA,? and HE staining were carried out after 3 weeks. Successive fluorescence microscope observation was taken for PKH positive cells in frozen section. Results: Both 26 skin defects in experimental group and blank control recovered, and experimental group exhibit a faster recovery than blank control. PKH positive cells were not 26 observed in both groups. Epithelization procedure and vascularization were more active in experimental group. Anti human monoclonal antibody were detected in every section of experimental group-10-第四军医大学博士学位论文 All of the above, CF is a open derived, easy to be isolated and cultured adult stem cells. They can be proliferated by several cytokins in vivo and in vitro. As an important cell type in repair of tissue defects, it will simulate the proliferation of FBs. But according to the results, we must take a advanced investigation to explain the diverse effect of CF on KCs in vitro and in vivo. In our study, CF can differentiate to different lineage including mesenchymal and non-mesenchymal cells. In transplanting research, we observed that CF can obviously improve the repair of skin defects. These results give us a hint that the application of CF for large dimension skin effects is a perspective one-11-第四军医大学 博士学位论文 前 言 成人及其他哺乳动物外周血中存在多种成体干细胞(Adult stem cells, AS),这些细胞大致可以分为两类,即循环成纤维细胞(Circulating fibrocytes, CF)和循环间充质干细胞(Peripheral blood mesenchymal stem cells, PBMSCs)。这些细胞也具有成体干细胞的基本特征,即一定的自我更新能力 和多向分化潜能,是参与机体不同组织器官的正常功能活动和损伤修复的重 要细胞类型。 各种急、慢性创伤以及慢性疾病所造成的皮肤损伤给人类健康带来了极 大危害,不仅造成了患者的美观问题,而且对患者心理健康也造成很大影响。 着手解决大面积皮肤损伤的治疗也是当前临床上面对的一大难题。机体对于 皮肤损伤的反应是体现在多种细胞、细胞因子和细胞外基质相互作用的复杂 过程。一些细胞特别是成纤维细胞在参与这一过程中,通过在损伤部位增殖、 合成细胞外基质来发挥其重要的生理或病理功能。传统观点认为,在损伤部 位 出现的这些细胞来自于周围的结缔组织,但这也许并不是成纤维细胞的唯一 来源。循环成纤维细胞的发现在一定程度上改变了人们对于皮肤损伤的修复 的理解。它作为组织成纤维细胞的前体细胞和一种多潜能成体干细胞,在皮 肤创伤和愈合的过程中发挥着重要的作用。 应用干细胞技术为皮肤创伤的修复治疗提供了新的手段。组织工程皮肤 产品的出现,使皮肤大面积缺损修复的研究进入新的领域,也进一步带动了 成体干细胞研究的进展。本实验对成人外周血获得的循环成纤维细胞进行体 外培养;经过免疫组织化学和流式细胞仪鉴定其表面标志;通过体外同培养 以及构建复层三维结构的方式观察其对皮肤组织细胞的作用影响;并将该细 胞初步应用于皮肤创伤的修复过程,观察修复效果。为探索外周血来源的成 体干细胞在皮肤损伤治疗中的应用打下了坚实的基础。 -12-第四军医大学博士学位论文 文献回顾 一、外周血来源的成体干细胞研究进展 1. 细胞来源和定义 干细胞是指尚未分化的一类具有自我复制能力的多潜能细胞,在一定的 条件下,可以分化成多种功能细胞。根据其生存阶段,可分为胚胎干细胞和 成体干细胞两大类。与胚胎干细胞不同,成体干细胞在体外具有一定的增殖 扩增能力,并可以在培养过程中保持分化的潜能。研究昀早与昀深入的成体 干细胞是骨髓组织内的造血干细胞(Hematopoietic stem cells,HSC),此外 其他组织内的间充质干细胞(Mesenchymal stem cells, MSCs)也是近年的研 究热点。目前认为,除了上述提到的两个类型,人体中几乎所有的组织和器 官中都含有成体干细胞的成分,如神经干细胞、角膜干细胞、胰腺干细胞、 心肌干细胞等。成体干细胞可以横向分化为其他类型的细胞和组织,是继人 类胚胎干细胞在体外培养成功后又一重大技术突破。 骨髓中除了造血干细胞(Hematopoietic stem cells, HSCs)之外,还存在 着另一种成体干细胞即骨髓间充质干细胞(Bone marrow stromal stem cells, BMSCs),它们能够在体外培养贴壁生长,形状呈成纤维细胞样的一类细胞, 也曾称为成纤维细胞集落形成单位(Colony forming unit-fibroblast, CFU-F)。 它们可以分化为骨髓基质等多种间充质组织,因此又被称为基质干细胞 (Stromal stem cell)或间充质干细胞(Mesenchymal stem cells, MSCs) 。类似 于骨髓的情况,成人外周血中也存在着类似的 CFU-F 样细胞,经过研究发 现它们可能分别属于两类细胞即造血干细胞亚群(Subsets)和其他间充质干 细胞(Mesenchymal stem cells) 。这些细胞可能都是来自于骨髓组织,但可 以分化为不同种类的细胞,参与机体不同组织器官的正常功能活动和损伤修-13-第四军医大学博士学位论文 复。因为骨髓中存在间充质来源的成体干细胞成分,人们一直认为循环血中 也应该存在这一类细胞,且其细胞表型和功能应该和 BMSCs 相一致,但一 直以来,外周血中的间充质干细胞是否真的存在的问题却由于不同研究小组 的结论却不相一致而充满争议,因为在外周血中存在 MSCs 的证据目前仍然 [1] 不是非常充分。 作为外周血中造血干细胞的重要亚群之一,一种新型的成体干细胞?循 环成纤维细胞circulating fibrocytes ,CF受到了广泛的关注。它们是在 1994年 [2] 首次被人发现 ,是从成人外周血中分离得到的新型纤维细胞,在组织损伤、 修 复重建和基因治疗中发挥着重要的功能。这些细胞是一种独特的细胞群,而 且是外周血中 的胶原分泌细胞。实验表明,循环成纤维细胞可能来源于自身 骨髓基质表达CD34的细胞。早期研究显示。成纤维细胞并不表达标记单核 细胞的CD14。然而,有实验发现,将富 含CD14、有黏着性的外周血细胞经 长期培养后,出现一种新成纤维细胞亚型,并伴有CD14标记消失 。进一步 用双层细胞培养皿实验显示,外周血中表达CDI4的前体细胞在向 成纤维细 胞分化过程中,T细胞是不可缺少的。近期,在对烧伤患者的研究中,已证 实成纤维细胞可由表达CD14的细 胞分化而来 。此前的研究也有证据表明, 胶原分泌细胞和类成纤维样细胞均可由外周血中的单核细胞分化而来。这与 以往发现的来自于组织间质中的成纤维细胞完全不同,CF是由骨髓中的干 细 胞成分分化而来,并能够在趋化因子的作用下通过血液循环迅 速迁移到损伤 [3] 组织中,分化为合成胶原等基质成分的主要效应细胞。 循环成纤维细胞能够在体外培养条件下呈CFU-F样贴壁生长,也曾经被 定义为游走成纤维细alitoflbrocytes。尤其它们具有显示它们造血来源 hematopoetic orgin的细 胞表面标记是和先前在骨髓内发现的另一种成体干 细胞?骨髓间充质干细胞(Bone marrow stromal stem cells,BMSCs)完全不 同的。这些细胞定居于外周血的白细胞亚群中,开始曾被叫作“纤维细胞” fibrocytes,然而,这个定义在解剖学术语中可能导致混淆,如在组织学、-14-第四军医大学博士学位论文 病理学中的名词“纤维细胞” fibrocytes指的是“成熟”的成纤维细胞mature fibroblasts。 在内耳的解剖组织名词中也有叫作“fibrocytes”的细胞是指毛 细胞。所以循环成纤维细胞circulating fibrocytes或游走成 纤维细胞 Alitofibrocytes更能强调这些细胞存在于血循环之中的特点。 目前使用的分离和培养外周血中循环成纤维细胞的方法仍以淋巴细胞 分离液分离外周血单个核细胞的体外培养为主,即用生理盐水溶液稀释肝素 浓度为2:1,以抗凝血,运用Ficol1密度梯度 离心法分离出血液中主要含有 白细胞的混合细胞群,冲洗后 重新用含有10% 的热灭活的牛胚胎血清 DMEM悬浮细胞。 再把单细胞悬浮液转移到含有10% 热灭活的牛胚胎血清 的 组织培养皿内生长。 如用fibronectin包被培养皿表面能增 加成纤维 细胞黏 附的数量,并且能更好地维持其生长。近年来有采用磁珠分选法分离外周 血CD14+的单个核细胞,进行体外培养的方法,取得了良好的效果。如果在 原代培养过程中在细胞接种后2-3d吸除培养皿中未黏着细胞,并用磁珠吸 附 法去除T淋巴细胞和B细胞,保留黏着性的细胞继续培养14d,这样可以获得 纯度更好的循环成纤维细胞。 对于另一种可能存在于外周循环血中的成体干细胞?循环间充质干细 胞,相关的体外培养和鉴定文献很少,目前国内外对各篇文献所提及的研究 [4-7] 方法和鉴定指标内容均不一致。近年来的研究 发现,成人外周血可能是 MSCs 的一种新来源,然而血源性 MSCs 的分离方法尚无一致。目前文献 [1,8] 报道血源性 MSCs 的分离方法有三种,分别为全血细胞法 血细胞分离机法 [9] [7] [1,8] 和免疫磁珠分离法 Kuznetsov等 首先报道全血细胞法分离血源性间充 质干细胞,于 1998年首次证实健康成人外周血中亦存在 MSCs,昀近,他们 又区健康成人的外周血进行培养,得到 CFU-F,其细胞表型与骨髓 MSCs 相 似,均表达 CD44、CD106、α-SMA,不表达与造血系相关的 CD14、CD34 和 CD45,且均合成纤维粘连素和?、?型胶原。他们将细胞与羟基磷灰石/ 磷酸三钙陶(Hydroxyapatite/tricalcium phosphate ceramics, HA/TCP) 颗粒复-15-第四军医大学博士学位论文 合植入裸鼠皮下 8周后观察到 12%-50%成骨,用种系特异性 DNA探针进行 原位杂交,结果证明该骨组织内的成骨细胞为供体来源。实验还发现,同一 种系外周血中 MSCs 比骨髓中 MSCs 密度低,人外周血中 MSCs 的克隆形成 [10] 率更小,但仍具有多向分化特性。已知国内昀早有学者报道 幼儿外周血中 的确存在类 MSCs 的细胞,他们取 18 月龄和 6 月龄的健康幼儿外周血,分 离白细胞群,体外进行培养,声称在 6-7d 后即得到 CFU-F。虽然有这些相 关报道的支持,但大多数证据表明,人循环血中的 MSCs 大多只在出生前存 在,即胎儿阶段,它们能偶随着造血干细胞(HSCs)迁移,由卵黄囊向肝 脏、脾脏和骨髓等部位转移,支持造血和其他组织形成功能。另一部分 MSCs [11] 则位于血管外侧,形成各种间充质组织。 而出生后,MSCs 不再参与循环 过程而只在骨髓组织大量存在,在外周血、血管周、疏松结缔组织、骨、软 骨和肌腱等部位只有少数存在。目前只能认为骨髓可能是外周血内间充质干 细胞的来源,PBMSCs 是骨髓 BMSCs 迁移而来。-16-第四军医大学博士学位 论文 2. 外周血来源的成体干细胞的功能特点和多向分化潜能 1)循环成纤维细胞的功能特点和多向分化潜能 关于循环成纤维细胞功能的实验研究昀早在组织创伤的实验模型中进 行。成纤维细胞主要在创伤修复的增殖期起作用,但因成纤维细胞早期出现 在创伤区并具有呈递抗原的能力,它们很可能在创伤修复的第一期炎症期 inflammatory phase也发挥作用。循环成纤维细胞能被TGF-β诱导表达 SMA,而α-SMA是肌成纤维细胞的特殊标记,并且它们与胶原生成关系密 切。昀近有证据表明,在哮喘患者的肺支气管组织中同样发现有α -SMA表 [12] 达增强,这可能与慢性哮喘中组织发生纤维化有关 。 同时循环成纤维细 胞能合成分泌血管生成因子 angiogenic factors,极大地促进新血管的形 成 。循环成纤维细胞能表达基质金属蛋白酶-9matrix metalop