黑曲霉粗酶液对苦杏仁苷的生物转化研究

黑曲霉粗酶液对苦杏仁苷的生物转化研究 黑曲霉粗酶液对苦杏仁苷的生物转化研究 摘要:为筛选到新型具有抗肿瘤活性转化产物，采用酶催化转化的方法对苦杏仁苷进行了生物转化研究。,,,;分析明，苦杏仁苷在黑曲霉(,,,,,,,,,,, ,,,,,)全细胞酶的作用下生成了,个产物，并采用,,和,,,法对产物的结构进行了鉴定。 关键词:黑曲霉;苦杏仁苷;生物转化;结构鉴定 ,,,,, ,, ,,, ,,,,,,,,,,,,,,,,, ,, ,,,,,,,,, ,,,, ,,, c,,,, e,,,,, e,,,,;, ,,,, ,,,,,,,,,,, ,,,,, ;,,,, ,,, (,;,,,, ,, ,,,, ,;,,,;,， ,,,,,,, ,;,,,;, , ,,;,,,,,,, ,,,,,, ,,,,,,,,,,， ,,,;,,,, ,,,,,,， ;,,,,) ,,,,,,;,: ,, ,;,,,, ,,,, ,,, ,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,, ,,,, ,,,,,,,,,,, ,, ,,,,,,,,,， ,,,,,,,,, ,,, ,,,,,,, ,,,, ,,, ;,,,, ,,,,,, ,,,,,;, ,,,, ,,,,,,,,,,,, ,,,,,( ,,, ,,,; ,,,,,,, ,,,,,, ,,,, ,,,,,,,,, ,,, ,,,,,,,,,,, ,,,, ,,,, ,,,,,;,, ,,, ,,,,, ,,,,;,,,,, ,,,, ,,,,,,,,,, ,,,, ,, ,,, ,,,( ,,, ,,,,,: ,,,,,,,,,,, ,,,,,; ,,,,,,,,,; ,,,,,,,,,,,,,,,,,; ,,,,;,,,, ,,,,,,,,;,,,,, 苦杏仁苷(,,,,,,,,,)属苯乙醇腈的β,龙胆二糖苷，是苦杏仁中的主要有效成分之一，其结构见图,。苦杏仁苷广泛存在于杏、桃、李等多种蔷薇科植物果实的种子中，具有良好的抗肿瘤,,,、抗氧化,,,、调节免疫功能,,,及镇咳平喘的作用,,,。研究表明，由于苦杏仁苷在微生物、葡萄糖苷酶、酸或碱作用下水解产生的氢氰酸,,,可通过抑制线粒体电子传递链的终端酶——细胞色素氧化酶中断,,,的合成，导致肿瘤细胞死亡,,,，但另一方面，苦杏仁苷中的糖苷键在微生物发酵液、酸或碱性条件下极易降解为氢氰酸和苯甲醇，难以控制，所以通过黑曲霉粗酶液对苦杏仁苷进行了催化转化，以期找到具有抗癌活性的新物质。 , 材料与方法 ,(, 材料 苦杏仁苷由苦杏仁中分离纯化得到，纯度,,,,，杏仁腈、苯由酸、野樱苷均购自,,,,,公司，纯度,,,,。色谱纯甲醇购于,,,,,,公司，其他均为分析纯试剂。 ,(, 微生物菌株 黑曲霉为笔者所在实验室保藏菌株，分离于土壤，, ?保存于,,,斜面上，每两月转接,次保持其活力。 ,(, 黑曲霉粗酶制备 黑曲霉液体培养基含, ,,,葡萄糖，, ,,,蛋白胨，, ,,,酵母膏， , ,,, ,,,,,,， , ,,, ,,;,， , ,,, ,,,,, ?,,,,，, ,,, ,,,,,?,,,,，,, ,(,。黑曲霉孢子(,,,个,,,)接入无菌培养基后，置于,, ?，,,, ,,,,,振摇培养, ,。收集发酵液，过滤，弃去菌丝体，上清液用饱和硫酸铵, ?下盐析,, ,，以,, ,,, ,,,,,、,?离心,, ,,,，取沉淀。沉淀用少量去离子水溶解，脱盐，冷冻干燥得粗酶，, ?冰箱保存备用。 ,(4 苦杏仁苷催化转化 取,(, ,,的,, ,,,,,苦杏仁苷溶液于, ,,的,, ,,,,(以β,葡萄糖苷酶活性计)的粗酶水溶液中，,, ?保温反应, ,。 ,(5 ,,,;分析 安捷伦,,,,液相色谱系统，;,,反相色谱柱(,,, ,, × ,(, ,,)，柱温,, ?，流动相为体积分数为,,,的甲醇,水溶液，检测波长,,, ,,，进样量,, μ,。对照品配制成浓度为, ,,,,,，其他检测条件相同。 ,(6 酶解产物的分离和纯化 反应完成后，先用等体积石油醚萃取酶解液,次，再用等体积氯仿萃取,次，收集氯仿萃取液，浓缩干燥，残留物用甲醇溶解，再依次用大孔树脂和硅胶柱进一步纯化，大孔树脂的洗脱液为氯仿,甲醇溶液，按照体积比,?,,,?,进行梯度洗脱，硅胶柱的洗脱液为甲醇,水溶液，按照体积比,?,,,?,进行梯度洗脱，收集组分后，冷冻干燥备用。 , 结果与分析 ,(, 催化转化结果 图,为各种样品的,,,;图谱。对比图,-,、图,-,和图,-;可知，酶解反应, ,后，在,(,,, ,,,处没有苦杏仁苷峰(图,-,)，这表明，苦杏仁苷发生了水解，而且在图,-,中还出现了,个新峰，说明苦杏仁苷经水解后，产生了,个转化产物。经过与杏仁腈、苯甲酸、野樱苷标准品,,,;(谱图未列出)对比，发现产物,、,、,分别与杏仁腈、野樱苷和苯甲酸保留时间相同，因此可初步判断产物,、,、,分别为杏仁腈、野樱苷和苯甲酸。 ,(, 产物分离纯化结果 发酵液经氯仿萃取后，产物,主要存在于氯仿层中，上层水溶液中仅有少量产物,。将氯仿层合并、旋转蒸发浓缩，大孔树脂洗脱，分析表明，产物,主要集中在氯仿,甲醇体积比为,?,的洗脱组分中。收集该洗脱液，浓缩，并用硅胶柱洗脱，浓缩、干燥，产物 ,的纯度达到,,,。该物质的理化鉴定结果如下:白色针状结晶(;,;,,,,,,,)，,,:,,,,,,,?， ,α,,,, ,,,(,(; ,(,,，;,,;,;,,)(,,,,: , ,,, ;,,,; ,,,,,, ,/,:,,,(,,, ,,,，,,，， ,,;,,,, (;,;,;,,，,,, ,,,):δ; ,,,(,(;,,’)，,,(, (;,,’)，,,,(,(;,,’)，,,,(,(;,,’)，,,,(,(;,,’)， ,,,(,(;,,’)(,,,,,,(;,;,;,,， ,,,,,,):δ, ,(,,(,,，,，,,,，,)，,(,,(,,，,，,,,，,);δ, ,(,, (,,，,，,,,)，δ, ,(,,(,,，,，,,,(,,,， ,,,’)。经与文献,,,对比后发现，产物,比野樱苷在;,,上多了1个羟基，其化学结构式见图,。 , 讨论 苦杏仁苷属苯乙醇腈的β,龙胆二糖苷类化合物，在酸、碱性条件下不稳定。在分离苦杏仁苷的过程中，也会发生少量的降解。现有的苦杏仁苷相关研究主要集中在栽培、分离、毒性,,,及检测,,，,,,等方面。描述苦杏仁苷具有肿瘤活性的报道称，其活性主要由其降解产物氢氰酸对电子传递链的毒性导致肿瘤细胞死亡而实现。然而，也有报道称苦杏仁苷并不具有抗肿瘤效果,,,,。因此，对苦杏仁苷的抗肿瘤活性及其相关机理还需要进一步研究。 本课题组在苦杏仁苷的生物转化研究中发现，黑曲霉发酵液的酸 性环境会影响苦杏仁苷的稳定性，为了降低酸性环境对苦杏仁苷的不利影响，应用黑曲霉粗酶提取液对苦杏仁苷进行了催化，结果表明，当排除酸性发酵环境的影响后，苦杏仁苷生成了新的产物,,,,,野樱苷，其反应机制可能是苦杏仁苷在β,葡萄糖苷酶的作用下水解成苷元(野樱苷)，生成的苷元很容易在环境因素或其他酶的作用下进一步降解成杏仁腈和苯甲酸，如果能排除环境因素对苷元稳定性的影响，苷元能够在羟基化酶的作用下进一步羟基化生成,,,,,野樱苷。,,,,,野樱苷是一新化合物，其抗肿瘤活性还需要进一步研究。 参考文献: ,,, ,,,,,,, , ,( ,,,,, ,,,,,,, ;,,;,,: ,,, ,,,,, ,, ,,,,,,, ,,,(,,m,( thousand oaks:american media，,,,,.,,,,,,,( ,,, 董 捷，尹 策，张红城，等( 杏花花粉中苦杏仁苷的抗氧化性研究,,,( 食品科学， ,,,,，,,(,):,,,,,( ,,, 方伟蓉，李运曼，钟林霖( 苦杏仁苷对佐剂性炎症影响的实验研究,,,( 中国临床药理学与治疗学，,,,,，,(,):,,,,,,,( ,,, 周金黄，王筠默( 中药药理学 ,,,(上海:上海科学 技术出版社，,,,,，,,,( ,,, ,,,,,,, , ,， ,,,,,, , ,(,,, ,,,,,,,,; ,,,,,,,,,, ,, ,,,,,,,,, ,,,( ,,,;,,,,;,, ,,,,,,,， ,,,,，,,,:,,,,,,,( ,,, 连彦军，陈道达，黄 韬，等( β,葡萄糖苷酶激活苦杏仁苷诱导,,,,细胞凋亡及活性对,,,与,;,,,基因表达和;,,,,,,,,的影响,,,( 肿瘤防治杂志，,,,,，,,(,):,,,,,,,( ,,, ,,,,,,, ,， ,,,,, ,， ,,,,,,,, ,( ;,,,,,,,,; ,,,;, ,,,,, ,, ,,,,,, ,, ,,,,,,, ,,, ,,,;,,, ,,,( ,;,,,,,,( ,,,,,;,,,,,,,,，,,,,，,,(,,):,,,,,,,,,( ,,, ,,,, , ,， ,,,;,, ,， ,,,,,, ,( ,,;,,,,,, ,,,,,,,,, ,, ,,,,,,,,, ,, ,,,,,, ,,,,;,, ,,,,, (,,,,,, ,,,,,,,;,) ,,,( ,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,, ,, ,,,, ,,;,,,,,,,,,，,,,,，,,(,):,,,,,,,( ,,, ,,,,, , ,， ,,,,,,,, , ,， ,,,,,, ,( ,,,,,,,,,,,,, ,, ,,,,,,, ,, ,,, ,,, ,,,,, ,,,,,,,,,, ,,, ,, ,,,,,, ,,, ,,,,, ,, ,,,,,,, ,, ,,,,,,,, ,,？,,, ;,,,,,,,,,,,,,,,,( ,,,,,,;, ,,,,, , ,;,,,;,，,,,,，,(,):,,,,,,,( ,,,, ,, ？， ,,,, ,(， ,, ,( ,, ,,( ,,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,, ,, ,,,,;,, ,,, ,,,,,,,,, ,,,, ,,,,, ,,,,,;,, ,,,,, ,,,, ,,,,,, ;,,,,,,,;,,,,,, ;,,,,,,,,,,,,, ,,,( ,,,,,,, ,, ;,,,,,,,,,,,,, ,， ,,,,，,,,,(,,,):,,,,,( ,,,, ,,,,,,, ,， ,,,,,,, ,， ,,,,, ,( ,,,,,,,, ,,, ;,,;,,: , ,,,,,,,,,; ,,,,,, ,, ,,, ;,,,,;,, ,,,,,,;,,,,( ,,,,,,, ;,,, ;,,;,,，,,,,， ,,(,):,,,,,,,(