【doc】青霉素体外诱导金黄色葡萄球菌耐药的实验研究

【doc】青霉素体外诱导金黄色葡萄球菌耐药的实验研究 青霉素体外诱导金黄色葡萄球菌耐药的实 验研究 ? 662?国际检验医学杂志2010年7月笫31卷第7期IntJLabMed,July2010,Vo1.31,No.7 青霉素体外诱导金黄色葡萄球菌耐药的实验研究 徐继秀,孙明强,刊,立宁,李艳,王洪霞 (山东省潍坊市妇幼保健院261011) ? 论着? 【摘要】目的探讨在实验室条件下青霉素诱导金黄色葡萄球菌产生耐药性所需要的时间及浓度.方法将菌株接种 到含不同浓度青霉素的营养肉汤培养液中,35?孵育,每24h更换1次培养液,每周做1次菌落计数及药敏试验,观察其药敏变 化情况,直至培养生长菌株全部耐苯唑西林为止.结果青霉素对ATCC25923的最低抑菌浓度为0.313g/mL.培养1周后各 青霉素浓度培养液中均有菌株生长,且药敏试验都出现双圈,0.625,20/xg/mI6个青霉素浓度的培养液中分别在2,7周后无 菌生长;0.313,0.156,0.078”g/mI3个青霉素浓度培养液中的生长菌株分别在6,7,3周全部耐苯唑西林.0.156ttg/mL青霉 素浓度诱导的耐药菌株,去除药物进行传代培养5周仍耐药;而 0.3l3,0.078/,g/mI2个浓度诱导的耐药菌株传代3周即恢复了 对青霉素,苯唑西林的敏感性.结论青霉素浓度大于或等于 0.625/~g/mI为杀菌浓度,0.313,0.156,0.078pg/mL3个浓度易 诱导金黄色葡萄球菌产生耐药,0.313及0.078g/mI青霉素浓度诱导 的耐药菌株耐药性不稳定,0.156ptg/mI诱导的耐药菌株 耐药性较稳定. 【关键词】青霉素类;葡萄球菌,金黄色;抗药性,细菌 4130.2010.07.018 D0I:10.3969/j.issn.1673— 中图分类号:R378.11;R969.4文献标识码:A文章编 号:1673—4130(2010)07—0662—03 ThedrugresistanceofStaphylOCOCCUSaureusinducedbyoxacillininvitro XU-『i-xiu,SUNMing—qiang,SUNLining,eta1. (WeifangMaternalandChildCareServiceCentre,Weifang261011,China) [Abstract]0ectiveToresearchtheconcentrationofoxacillinandthetimethatinducedStaphyiococcusaureustogenerate drug-resistanceinvitro.MethodsInoculatedstandardstrainATCC25923tobouillonwhichcontainsdifferentconcentrationofox— acillin,thenincubatedwiththetemperatureof35.C,replacedtheculturesolutionevery24hours,countedcoenobiumsandexperi— mentalizingsusceptibilitytestseveryweek,theexperimentwascompletedwhileallthestrainsgeneratedresistancetooxacillin.Re- suitstheminimuminhibitoryconcentratiOn(MIC)ofoxacillintoATCC25923was0.313txg/m1.Thebacteriagrewunderdifferent concentrationofoxacillinafter1weeksincubation,andtwoannulationswereobservedfromsusceptibilitytests.Therewereno 7weeksscultivationunder6differentculturesoluti growingbacteriaafter2— onofoxacillinfrom0.625—20ptg/ml,.Allthe strainsgenerateddrug-resistanceundertheconcentrationof0.313,0.156,0.078~tg/mloxacillinafter6,7,3weekscultivationre— spectively.Thedrugresistantstrainsinducedby0.156#g/mIoxacillinstillhaddrug—resistanceafter5weeksserialsubcu|tivation whenoxacillinwasremovedfromtheculturesolution.However,thedrugresistantstrainsinducedby0.313and0.078/,g/mLox— acillinrecoveredsensitivetopenicilinandoxacillinafter3weeksserialsubcultivation.ConclusionExceeding0.625/~g/mloxacillin havebactericidaleffectonStaphylococcusaureus.Thedrugresistancecanbeinducedwiththec0ncentrationof0.313,0.156and 0.078~g/mloxacillinforStaphylococcusaureus,butthedrugresistanceofStaphylococcusaureusisunstableinducedbythecon— centrationof0.313and0.078t~g/mloxacillin,however,thedrugresistanceissteadyinducedbytheconcentrationof0.156~g/ml oxacillin. [Keywords]penicillins;staphylococcusaureus;DrugResistance,Bacterial 目前,革兰阳性球菌的耐药性引起全世界的普遍关注,特 别是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillinresistantstaphy— lococcusaureus,MRsA)在全球范围内流行,耐药性强,近年来 感染率,致死率均有所增加【,是由于院内感染及术后药物选 择与用量不当,致使MRsA迅速传播.为此,将质控菌株 金黄色葡萄球菌ATCC25923接种到含不同浓度青霉素的肉 汤培养液中培养,观察其诱导耐药性变化的规律,以便为『临床 用药提供参考. 与方法 1.抗菌药物青霉素钠由潍坊制药厂提供. 2.受试菌株质控标准为菌株金黄色葡萄球菌ATCC 25923. 3.培养基药敏纸片购自北京天坛生物公司,营养肉 汤,M—H琼脂购自杭州天和公司. 4.方法1)菌液制备:取ATCC25923接种含血的M— H琼脂平板35?24h,挑取菌落接种肉汤管中35?4h,凋 整浓度使其相当于0.5个麦氏单位(1_5×10CFU/mI)备 用.2)药物敏感试验:采用K—B法,用含4NaCIM—H琼脂 平板,操作及结果判断按照《全国l临床检验操作规程》第3版进 行.3)将青霉素用注射用水融化后配成浓度2×10/tg/mL备 用.取无菌试管10支,每管加入营养肉汤,第1管1.96mL, 其余每管1ml,然后第1管加人2×10.g/mI的青霉素药液 40L混匀,吸取1mI于第2管中混匀,再从第2管中吸取1 mI于第3管巾,以此类推至第9管吸出lniL弃去,第1O管 为对照管.每管再加入已备好的0.5个麦氏单位菌液1mL, 混匀.各管药物的最终浓度分别为2O,1O,5,2.5,1.25, 0.625,0.313,0.156,0.078,0/~g/ml;35?24h,观察生长情 况(以肉跟观察无菌生长为青霉素最低抑菌浓度).4)换液:将 各管离心弃上清液(菌量太多管弃去部分菌使其最后菌浓度约 国际检验医学杂志2010年7月第31卷第7期IntJLabMed,July2010,Vo1.31,No.7 相当于0.5个麦氏单位浊度);各管再分别加入相应青霉素浓 度的营养肉汤2mI,混匀;35?24h;观察记录各管细菌生长 情况.5)每天重复4)操作,直至l周后,换液前先将各管混匀 分别取10I培养液接种血平板,35C24h,记录生长菌落 数,并挑取菌落进行多种抗生素药敏试验.6)继续重复4)操 作,每隔l周重复4),5)操作1次,卣至出现全部生长菌株耐 苯唑西林为止.7)去除抗生素传代:将培养至耐苯唑西林的菌 株,接种血平板及含有4Na(‘lMH琼脂平板,35C培养2d h传种1次,每传种1周行1次药敏试验;药敏试验用含有4 NaC1M—H琼脂平板,培养48h观察结果. 结果 1.培养24h,ATCC25923青霉素的最低抑菌浓度为 0.313tzg/mI. 2.试验前ATCC25923青霉素药敏抑菌圈直径为35mrFi, 1fg/片苯唑西林抑菌圈直径为21m1711;在有关文献[5]质控标 准菌株预期范围内,培养1周后,1O个青霉素浓度培养液均有 菌株生长,且每个浓度培养液10L生长的菌落数随药物的浓 度减小而增多,0.313,2O/,g/mI7个浓度的菌落数在4,180 个之间,0,O.156”g/mI3个浓度均为400个以上;除对照管 外,生长菌落青霉素药敏均出现内外圈,内圈菌层极薄,直径在 ?663? 22,28Film之间,菌落细小,细菌形态多呈G一,缺边,不成形 的碎片或灰尘状成堆排列,极少数呈G大球,大双球状,外圈 直径在34,36rnm之间,细菌形态与对照培养液中生长菌株 相同,为G较均匀一致的球菌,呈葡萄状排列.苯唑西林抑 菌固直径在2O,22mm之间,与对照菌无明显差异. 3.培养2周后,2O及10txg/mI青霉素浓度培养液中无 菌生长,5及2.5g/m1浓度培养液分别在3,4周后无菌生 长;1.25及0.625/,g/mI浓度培养液7周后无菌生长;并且此 6个浓度培养液在有菌生长时苯唑西林抑菌圈直径在22mm 左右,无内圈. 4.0.3l3,0.156,0.078/~g/mI3个青霉素浓度培养液及 对照培养液培养各周生长菌株的药敏情况见1.从表1可 以看出,2周后,0.156,0.078/xg/mI2个浓度培养液中苯唑西 林药敏出现内外幽,但内层很薄(已出现部分耐甲氧西林菌 株),且随培养时间的延长逐渐增厚,抑菌圈逐渐缩小,0.156 /xg/mI浓度培养液巾菌株培养至第8周,内外圈完全消失; 0.078~,g/mI青霉素浓度培养生长菌株全部青霉素,苯唑西林 耐药时问最短21d.诱导产生的苯唑西林耐药菌株生长缓慢, 菌落细小,细菌形态多呈大小均匀的G小球,小双球,周边有 红色边沿,形态规则的球菌,与对照菌株有较明显的差异. 5.其他l3种抗菌药物的药敏结果见表2. 表1ATCC25923在3个青霉素浓度及对照培养液中培养各周药敏情况 抗菌药物 头孢噻肟 头孢噻肟/克拉维酸 头孢他啶 头孢他啶/克拉维酸 哌拉西林 哌拉西林/他唑巴坦 万古霉素 红霉素 阿米卡星 庆大霉素 亚胺培南 环丙沙星 复方新诺明 8周1o周11周 :!兰竺: 6周7周1o周11周8周l0周11周 202392426/312o16 2】2282525/3o2020 o9o1713/2O1311 89o2012/191211 251127,/3623/372o20/36 — 281427,/3525/362O/36 201917l91818 3231263O3027 — 262625262424 272726272726 17162023】616 —— 303030303028 323230323230 注:”一”表示无测定值. 6.0.313/xg/mI青霉素浓度培养液培养l,5周虽肉眼 观察无菌生长,但接种血平板仍有茼生长,药敏试验(见表1) 苯唑西林敏感,青霉素有内外抑菌圈,内圈菌形态不完整,培养 至第6周管底出现微量白色沉淀,血平板菌落数剧增,多数菌 落细小,且大小不等,挑之发黏,涂片细菌形态较规则,青霉素 药敏内圈明显缩小并增厚,7周后苯唑西林抑菌圈为0.菌落 ?..一”船四 周一67oo6678560o20—2222331抑菌圈直径内圈mm/~b圈ram) 传代培养时0.313/,g/mL0.156/~g/mL0.078/~g/mI 间(周)苯唑西林青霉素苯唑西林青霉素苯唑西林青霉素 讨论 1.本试验结果显示,ATCC25923对青霉素的最低抑菌浓 度为0.313~tg/mL,符合有关文献[5]的预期结果.大于或等 于0.625~g/mL青霉素浓度不易诱导金黄色葡萄球菌产生耐 药,且此青霉素浓度范围杀灭细菌的时间随药物浓度的减低而 延长.青霉素结合蛋白(penicillin--bindingproteins,PBPs)是 细胞壁合成过程中维持其生理功能不可缺少的酶蛋白系,口一内 酰胺类抗生素通过与细菌主要PBPs结合,使细胞壁合成过程 中的交叉连接不能形成,由此影响黏肽的合成,致使细菌不能 合成细胞壁而溶菌死亡_6].实验过程中,0.625,20pg/mL6 个青霉素浓度培养液生长菌株均出现过青霉素药敏呈内外抑 菌圈的现象,内圈菌菌落及细菌形态与外圈菌株及对照管菌株 差异明显,说明经过一段时间的青霉素选择压力已有部分菌被 溶菌死亡,部分菌细胞壁已被破坏仍能存活,但生长缓慢,在不 含抗生素的培养基上能很快恢复正常形态生长繁殖,但此时苯 唑西林仍敏感.随着培养时间的延长,高浓度的青霉素逐渐抑 制了培养菌株生长,最终将其杀死.而0.313,0.156,0.078 >g/mL3个较低青霉素浓度的培养液对培养菌株细胞壁的合成 抑制较弱,不能在一定时间内杀死培养菌株,最终形成耐药菌株 后又恢复了完整形态而继续大量繁殖.这一过程在实验中表现 为抗生素抑菌圈的内圈细菌逐渐增多,直径逐渐缩小,外圈逐渐 消失.形成的耐苯唑西林金黄色葡萄球菌株,生长较慢,菌落 小,涂片染色呈有红色边沿的小球,小双球菌,与对照菌均匀一 致的G球菌差异明显,可能是细菌细胞壁结构发生了改变. 2.由表2可见,受试菌株ATCC25923经青霉素诱导产生 的耐苯唑西林菌株,对其他G一内酰胺类抗生素也产生了耐药 性l_7].但对表2中的其他7种抗生素仍然敏感,与文献[9]所 述MRSA对多种抗菌药物耐药,包括氨基糖甙类,克林霉素, 喹诺酮类抗生素,复方新诺明和四环素类抗生素不符,可能体 外试验与临床用药效果有差异. 表3显示,0.313,0.156,0.078/,g/mL3个青霉素浓度诱 导ATCC25923金黄色葡萄球菌产生的耐苯唑西林菌株.在 除去青霉素进行传代培养后发现,不同浓度青霉素诱导的耐药 菌株耐药的稳定性不同.0.156~tg/mL青霉素浓度诱导的耐 药株传代5周后仍耐药,说明此浓度诱导的耐药菌株耐药性较 稳定,而0.313,0.078Fg/mL2个浓度诱导的耐药株均在3周 后即恢复了对青霉素,苯唑西林的敏感性;说明此2个浓度诱 导的耐甲氧西林菌株耐药性不稳定.此现象可能是由于多次 传代后,在没有抗生素选择压力下,耐药菌株的耐药基因逐渐 失活造成的.不同浓度的抗生素诱导的耐药菌株产生的耐药 稳定性不同的机制有待进一步研究. 参考文献 [1]FariaNA,OliveiraDC,WesthH,eta1.Epidemiologyofe— mergingmethicillin—resistantStaphylococcusaureus (MRSA)inDenmark:Anationwidestudywithlowprev— aleneeofMRSAinfection[J].JClinMicrobiol,2005,43 (4):1836—1842. 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