【doc】金粉蕨素拮抗血管内皮细胞氧化应激损伤及机制

【doc】金粉蕨素拮抗血管内皮细胞氧化应激损伤及机制 金粉蕨素拮抗血管内皮细胞氧化应激损伤 及机制 ?研究原着? ? 381? 中国临床药理学与治疗学 中国药理学会主办 cN34-1206/R.ISSN1009-2501 E-maiheditorys@mail.wh.aI1.cn 2OO3Aug;8(4):381—384 金粉蕨素拮抗血管内皮细胞氧化应激损伤及机制 庹勤慧,廖端芳,朱炳阳,严奉祥 南华大学基础医学院药物药理研究所,衡阳421001,湖南 摘要目的:研究金粉蕨素(onychin,Ony)对血管内 皮细胞氧化应激损伤的影响及可能机制.方法:培 养人脐静脉血管内皮细胞株(ECV304),经Ony处理 后,用过氧化氢(H2()2)对其损伤;用MTr比色法和 乳酸脱氢酶测定法分别损伤组和处理组细胞增 殖活性和功能状态;用Western.Blot法检测磷酸化 ERK1/2和D38,P90RSK蛋白的表达.结果:不同浓 度的Ony(0.3,1,3,10tanol?L)促进HO,损伤的内 皮细胞增殖.减少LDH释放,并呈浓度依赖性.Ony (3tanol?L)抑制H2O2诱导的磷酸化p38表达, 30min时最明显,但并不影响HO,对ERK的激活 以及ERK下游蛋白激酶P90RSK的表达.而阳性对 照药genistein虽可增加内皮细胞增殖活性和减少功 能损伤,但明显抑制H2O诱导的磷酸化ERK表达 及其下游蛋白激酶P90RSK.结论:Ony拮抗血管内 皮细胞氧化应激损伤可能与抑制p38磷酸化有关. 关键词药理学;金粉蕨素;内皮细胞;过氧化氢; ERl(:P38MAPK 中图分类号:R285.5;R287.71 文献标识码:A 文章编号:1009.2501(2003)04.0381-04 金粉蕨素(onychin,Ony)系我室与中科院昆明 植物研究所从中国蕨科金粉蕨属金粉蕨植物中分离 获得的一种新型二氢黄酮苷,与羟基异黄酮化学 结构相似.经离体血管环实验证明,Ony对溶血性 2003-02.21收稿2003-03-0l修回 l卫生部资助课题(/~b981345);湖南省中医药科研基金重点课题 (~2ooooo6);湖南省教委资助课题(No98B100) 庹勤慧.在读硕士研究生. E—mail:qhtuo@sohu.tom. 廖端芳.通讯作者,博士.教授,博士生导师.研究方向:心血管药理 学. Tel:0734—828l3o8E.mail:dfliao@hotmail.tom 磷脂酰胆碱损伤的血管内皮依赖性舒张功能有保护 作用J,其他研究人员还观察到Ony对抗肝脏脂质 过氧化作用bj,充分提示Ony有抗氧化效应.而氧 化应激引起内皮细胞受损是许多心血管疾病的触发 因素,并且异黄酮类物质也可以拮抗氧化应激损 伤H.本实验以异黄酮类药物genistein为阳性对 照,体外观察Ony对过氧化氢(H2O2)损伤血管内皮 细胞的保护作用及其机制,为开发新的药理作用提 供进一步的实验依据. 1材料与方法 1.1药品与试剂H2O2,genistein,二甲基亚砜 (DMSO),四甲基偶氮唑盐[3.(4,5.dimethylthiazo.2. y1).dipheny1.tetrazoliumbromide,I?rI]r],均购自Sigma 公司;DMEM培养基为GIBCO产品;新生牛血清(杭 州四季清产品);兔抗人P.p38,p38,P90RSK单抗,鼠 抗人P.ERK1/2单抗(SantaCruzBiotechnology);BCA 蛋白含量测定试剂,Westem.Blot荧光检测试剂盒 (购自Hyclone.Pierce公司);Ony为本实验室提取并 鉴定(纯度>98%),溶于二甲基亚砜(DMSO),二甲 基亚砜最终浓度<0.01%. 1.2细胞培养及处理自武汉大学细胞馆藏中心 购人脐静脉内皮细胞ECV304,用含有10%新生牛血 清的DMEM培养基,同时加入100U?L链霉素和 100U?L青霉素,在37?,5%CO2饱和湿度的C02 培养箱中培养.实验分5组,空白对照组:弃原培养 液并重新加入含1%新生牛血清的DMEM培养基继 续培养;H2O,损伤组:在含1%新生牛血清的DMEM 培养中加入2mmol?L,H2O2;Ony组:在加入H2O2 前30min分别加入不同浓度Ony(0.1,0.3,1,3, 10tanol?L);溶媒对照组:在含1%新生牛血清的 DMEM培养中加入0.01%DMSO;阳性药物对照组: 在加入H2()2前30min加入100t.tmol?L,genistein. 1.3四甲基偶氮唑盐(MTY)还原实验细胞以2 ? 382? XlO'/rnl的密度铺种于96孔板,待融合后按以上分 组处理,4h后弃原培养液,各孔加入含MrrI1(终浓度 0.5mg?L),1%新生牛血清的DMEM培养基,培养 4h后,弃培养液加入100l的DMSO原液,37qC培 养10min,待结晶完全溶解后,用酶联免疫仪于 570n/n波长处测定吸光度(OD);并根据吸光度,计 算细胞存活率(细胞存活率:给药组吸光度/空白组 吸光度X100%). 1.4细胞培养液中乳酸脱氢酶(LDIt)测定细胞 以2XlO'/rnl的密度铺种于24孔板,待融合后按以 上分组处理,4h后取培养液,应用全自动生化 仪(H1TACHI717)测定LDH含量. 1.5Western.Blot测定蛋白的表达收集不同条件 处理的血管内皮细胞,MBST裂解液裂解细胞(MBST 裂解液:25mmol?L'.MBS,pH6.5,0.15mmol?L NaC12,1%TritonX一100),4000Xg离心15rain,收集 上清,BCA试剂测定蛋白含量,1XSDS凝胶加样缓 冲液调蛋白浓度使各组一致,经10%SDS-聚丙稀酰 胺凝胶电泳,然后将蛋白电转移至PVDF膜上,TBST (20mmol?L'.trisbasepH7.6,50mmol?L,NaC1, 0.1%tween)配制的5%脱脂牛奶,室温封闭1.5, 2h,一抗4qC过夜,TBST洗膜3次,每次10min,二 抗室温孵育1h,TBST洗膜,发光剂孵育,显影.用 Iabworks图像分析系统对Westernblot结果进行灰度 扫描,以对照组的面积灰度值为1.0与实验组进行 比较和半定量分析. 1.6统计方法实验数据以?s表示,组间差异 性比较采用单因素方差分析,由SPSS11.0软件进行 统计分析. 2结果 2.1Ony对H202损伤的内皮细胞的影响H02 孵育4h后,内皮细胞增殖活性明显下降,培养液中 LDH释放由正常时35.0?1.0U?L升高到48.3? 3.1U?L(P<0.O1).不同浓度的Ony(O.1,0.3,1, 3,10tmaol?L)与H0共同孵育内皮细胞4h后, 呈浓度依赖性的增加内皮细胞活性和减少LDH释 放.3tmaol?LOny保护作用最明显,细胞增殖活 性上升到(95?14)%(P<0.O1),LDH释放减少为 38.7?1.5U?L(P<0.O1)(表1).倒置显微镜下 也可观察到Ony对细胞形态也有保护作用. 2.2Ony对内皮细胞P-ERK蛋白表达的影响 H'()'孵育15min后,明显激活磷酸化ERK的表达, ChinJClinP'harmaeolTher2003Aug;8(4) Ony(3m01.L)与H202共同孵育内皮细胞15min, 不影响H0对ERK的激活作用(图1,A),30min 时仍不影响ERK活性(图1,B);但genistein通过抑 制酪氨酸激酶,而抑制H2o2对ERK的磷酸化(图1,A). 表1Ony对H2()2损伤的内皮细胞活性的影响(i?,,l: 4) Ony:金粉蕨素;DNSO:二甲基亚砜;与对照组比较P<0.O1;与 H202比较P<0.05,P<0.0l —??—????? AP-ERKI,~ Hzo2一+++ I~yclain一一+一 t3eIIiste.n一一一+ 15mill30min B—H..?——一P—ERKI,~ HzOz一++++ Onychin一一+一+ 图1Onye~(3Il0I?L)对内皮细胞P-ERK蛋白表达的 影响(,l=3) 2.3ony对内皮细胞I~llSK蛋白表达的影响 P90RSK是ERK的下游蛋白激酶,随ERK的活化而 表达增加.见图2,HO作用15min后,P9ORSK表 达增加,Ony对此没有影响,但genistein与H02共同 孵育内皮细胞15min,P9ORSK表达明显下调.说明 genistein通过抑制ERK的磷酸化而下调了P9ORSK 蛋白表达,对ERK信号通路的作用与Ony有差异, Ony在短时间内并不影响ERK通路,但随时间延 长,于4h后可以促进ERK活化,可能与拮抗内皮细 胞凋亡有关,(文章待发表). 2.4Ony对内皮细胞P.p38MAPK蛋白表达的影 响图3,H02作用15,30min,激活内皮细胞p38 的磷酸化(2.00?0.02,2.20?0.041.00?0.12, P<0.O1),Ony可抑制磷酸化p38的表达,30min时 作用最显着(1.70?0.062.20?0.04,P<0.O1). 中国临床药理学与治疗学2003Aug;8(4) ?—一-P90RsK H2O2一+++ Onychin一一+一 Genistein—-'.—- 图2Onychin(3Itmol?LI1)对内皮细胞Pg0RSK蛋白表达 的影响(n=3) Onychin H:o2 2.5 ?—,'一'—,'_,P-p38 -?-一,_It—p38 —-—- 4-—-4- 一4-4-4-4- 图3Onychin(Ony)对内皮细胞V-p3SMAPK蛋白表达的影 响(n=3) 与对照组比较P<O.01;与H202组比较P<0.01 3讨论 Ony是从蕨科金粉蕨属粟柄金粉蕨植物中提 取,分离的新型二氢黄酮苷单体化合物,结构类似异 黄酮类植物雌激素.异黄酮类植物雌激素如 genistein,daidzein等可显着降低脂质过氧化物的形 成,保护血管内皮细胞,使其不被氧化破坏,有抗动 脉粥样硬化的作用J,药效与雌二醇相当而没有明 显的毒副作用.以异黄酮类植物雌激素的代表药 genistein为阳性对照,采用体外内皮细胞培养方法, 发现Ony呈浓度依赖性的对抗H2O2造成的血管内 皮细胞损伤,降低内皮细胞乳酸脱氢酶的释放,能够 保护血管内皮细胞,拮抗氧化损伤. MAPK家族信号通路与内皮细胞的增殖和凋亡 关系密切,其中ERK1/2通路又称分裂原激活的 MAPK通路,主要与细胞增殖,分化有关,核糖体s6 激酶(ribosomalS6kinase,RSK)是MAPK的底物, ? 383? 激活的ERK和RSK能转入核中,通过使一些转录因 子的磷酸化,促进细胞增殖,MEK阻断剂PD98095 能共同抑制ERK和P90PSK的活化J.p38MAPK 为应激激活的MAPK通路之一,与内皮细胞损伤,凋 亡联系密切,如氧自由基,Adenosine_1..等都可通过 激活p38MAPK激酶而诱导内皮细胞损伤或凋亡. 在细胞内维持p38MAPK与ERK通路平衡可保护内 皮?,协调内皮凋亡与增殖.()2是体内氧化代谢 的中间产物,同时又是一种活性氧,能够诱导磷酸化 ERK和p38的表达,这种促进作用在l0,30min达 高峰?引,并且p38MAPK活化是()'增加内皮细胞 渗透性,损伤内皮的主要原因. 本实验观察到()'孵育内皮细胞15min,明显 激活ERK及下游蛋白激酶P90RSK,Ony对此无影 响,而genistein为酪氨酸激酶抑制剂,抑制ERK的 活化,与文献报道一致?引,相应下调P90RSK蛋白表 达.在30min时,Ony仍不影响H2O2激活ERK,提 示Ony对氧化应激暂时诱导的ERK磷酸化没有影 响,与genistein作用环节有差异.H'O'也明显促进 p38MAPK磷酸化,而Ony能抑制p38MAPK的活化, 在30min时最明显.说明Ony拮抗血管内皮细胞 氧化应激损伤与抑制p38MAPK活化有关. 参考文献 1许云龙,郑兴,何以能.粟柄金粉蕨素黄酮成分[J].云南 植物研究,1999;15:497—504 2庹勤慧,廖端芳,黄红林,等.金粉蕨素对溶血性磷脂酰胆 碱损伤血管内皮依赖性舒张功能的保护作用及机制[J]. 中国动脉硬化杂志,2001;9:27—30 3严奉祥,朱炳阳,郑兴.金粉蕨素对小白鼠实验性肝损伤 脂质过氧化的保护作用[J].南华大学,2002;30:4— 6 4VedavanamK,SrijayantaS,O'Rei~yJ,eta1.Antioxidantac— tionandpotentialantidiabeticpropertiesofanisoflavonoid-con— tainingsoyabeanphytochemicalextract(SPE)[J].Phytother Res,1999;13:601—8 5WeiH,ZhangX,WangY,eta1.Inhibitionofultraviolet light—inducedoxidativeeven~intheskinandinternalorgansof hairlessmicebyisoflavonegenistein[J].CancerLett,2002; 185:21—9 6KapiotisS,HermannM,HeldI,eta1.Genistein,thedietary— derivedangiogenesisinhibitor,preventsLDLoxidationandpm— tectsendothelialcellsfromdamagebyatherogenicLDUJJ.Ar— teriosclerThrombVaseBiol,1997;17:2868—74 7CarbajalJM.SchaefferRCJr.H202andgenisteindifferentially modulateproteintyrosinephospho~lafion,endothelialmorpholo— gY,andmonolayerbalTierfunction[J].BiochemBiophysRes Commun,1998;249:461—6 0505D00 ? 384? 8YuY,SatoJD.MAPkinases,phosphatidylinositol3一kinase, andp70S6kinasemediatethemitogenicresponseofhumanen— dothelialcellstovaseularendothehalgrowthfactorIJJ.JCeU Phvs.ol,1999;178:235—46 9BaligaRR,PimentalDR,ZhaoYY.NR01一inducedcardio— myocytehypertrophy.RoleofPI.3一kinase,pT0(S6K),and MEK.MAPK.RsK[J].AmJPhysiol,1999;277:2026—37 l0HarringtonEO,SmeglinA,ParksN,eta1.Adenosineinduces endothelialapoptosisbyactivatingproteintyrosinephosphatase: apossibleroleofp38alpha[J].AmJPhysiolLungCellMol Phvsiol,200o;279:733—42 l1WangZ,JiangC,GantherH,eta1.Antimitogenicandpm— apoptoticacti~tiesofmethylseleninicacidinvaseularendotheh— ChinJClinPharmaeolTher20o3Aug;8(4 alceilsandassociatedeffectsonPI3K—AKT,ERK,JNKand p38MAPKsignalinglJ].CancerRes,2001;61:7171—8 12KathrynZ,Guyton,YusenLiu,eta/.Activationofmitogen- activatedproteinkinasebyI-I=02[J].JBiolChem,1996;271: 4138—42 13NiwaK.InanamiO,OhmT.p38MAPKandCa2contribute tohydrogenperoxide-inducedincreaseofpermeabilityinva.~2u— l03endothehalceilsbutERKdoesnot[JJ.FreeRadicRes, 20o1:35:519—27 14FreyRS,SingletaryKW.Genisteinactivatesp38mitogen-aeti— vatedproteinkinase.inactivatesERK1/ERK2anddecreases Cdc25Cexpressioninimmortalizedhumanmmnnmryepithelial ceils[J].JNutr,2003;133:226—31 Protectiveeffectsofonychinonvascularendothelialcellinjuredbyoxida- tivestress TUOQin—Hui,LIAODuan—Fang,ZHUBing—Yang,YANFeng—Xiang InstituteofPharmacy&Pharmacology.NanhuaUniversity,Hengyang421001,Hunan ,China ABSTRACTA?:Tostudytheprotectiveeffectsand mechanismofonychinagainstvascularendothelialcell damageinducedbyoxidativestress.M匝lTHODS:Cu1. turedhumanumbilicalveinendothelialcells(ECV304) andincubatedthemfor30minwitheithervehicle(DM- so),genisteinordifferentconcentrationsofonychin (O.1,O.3,1,3,and10ttmol?L)beforebeingdam— agedwith2l'nn'lo1.L,H2O2.Cellviabilitywasmeasured bytheMTTassayandLDHassay.andcellmorphologic changesweredeterminedundermicroscope.Meanwhile, andthewesternblotwasusedtomeasuretheexpressionof phospho-ERK,P9IoRSK,andphospho-p38ofendothelial cells.REsIJI:Differentdosesofonychinobviously inhibitedcellviabilityandincreasedLDHrelease(P< O.01).Onychin(0.3,1,and3tunol?L)improved thecellproliferationwiththegrowthratefrom73.4%to 82.9%.9O.1%and95.2%.respectively.Onychinal— soattenuatedthereleaseofLDH(H20,.induced)andin— hibitedH202一inducedphosphorylationofp38MAPK(P< O.01).Onychinshowednoeffectonphosphorylationof ERKandP9IoRSK.o0NCIIs】IoN:Onychinprevents H202.inducedendothelialcellinjurybyinhibitingthe phosphorylationofp38MAPK. KEYWORDSpharmacology;onychin;endothelial cells;hydrogenperoxide;p38MAPK;ERK