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双荧光报告基因检测系统简明操作步骤 试剂准备: 磷酸盐缓冲液(PBS) PBS 缓冲液,10X (每升) 11.5g Na2HPO4 2g KH2PO4 80g NaCl 2g KCl 溶于1 升无菌去离子水中。1XPBS的pH应为7.4. 1. 制备被动裂解缓冲液1×PLB:将1 倍体积的5×Passive Lysis Buffer(PLB)加到4 倍体积的蒸馏水中。混合均匀。储存在4℃(≤1 个月)。建议每次使用前配制新鲜的1XPLB。5XPLB 应储存在-20℃。 2.LARⅡ:用Luciferase Assay Buffer Ⅱ溶解冻干粉Luciferase Assay Substrate。存于-20℃(≤1 个月)或-70℃(≤1 年)。 3.Stop & Glo 试剂: a. 取2.1ml 50×Stop & Glo? Substrate 加到105ml的Stop&Glo? Buffer。在提供的棕色Stop&Glo? Reagent 瓶中,振摇10 秒。在-20℃存15 天。 b.若配制少量的1×Stop & Glo? Reagent:将一定量的50×Stop & Glo? Substrate 加入到所需要量的Stop & Glo? Buffer 中,使终浓度成为1 倍浓度。 (例如,加0.2ml的50×Stop & Glo? Substrate到10ml 的Stop & Glo? 缓冲液中,制成1×Stop & Glo? Reagent 溶液。) 细胞裂解 1.除去培养细胞中的培养基。 2.用1×PBS 清洗培养细胞。去掉清洗液。 3.按推荐体积(见下表)将1×PLB 加入到培养孔中。 第3步中使用的1×PLB体积 被动裂解主动裂解 培养板1×PLB 平板大小1×PLB 6 孔500ul 100×200mm 1ml 12 孔250ul 60×15mm 400ul 24 孔100ul 35×12mm 200ul 48 孔65ul 6 孔250ul 96 孔20ul 12 孔100ul 4.被动裂解:在室温轻缓晃动培养板15 分钟,把裂解液 转移到检测试管中。 结果检测 a.检测96孔板中的样品: 开始之前: 设置自动进样器1 和 2 分别分装100ul 的LARII 和Stop&Glo?试剂。 测量时,使用1-2 秒延迟和5-10 秒读数。(在萤光发光仪上(Luminometer)之内) 1、加入≤ 20ul PLB裂解液/孔 2、加入100ul LARII 3、检测萤火虫萤光素酶 4、加入100ul Stop&Glo? 试剂 5、检测海肾萤光素酶的活性 6、其它孔如此循环操作。 b.用手动或配有单自动进样器的萤光发光仪进行检测: 1、事先在检测管中加入100ul LARII 2、转移20ul PLB 裂解液到检测管中,混合。 3、检测萤火虫萤光素酶的活性 4、向检测管中加入100ul Stop&Glo? Reagent 5、检测海肾萤光素酶活性