固定长度的目的片段使用Primer5设计引物的过程

固定长度的目的片段使用Primer5设计引物的过程 固定长度的目的片段使用Primer 5 设计引物的过程 打开软件 复制基因序列 粘贴 选项AS is- OK 点击primer 按钮，弹出菜单后点击search按钮 选择 PCR primer，Sense primer 位置、长度参数，并选择所需PCR产物长度，OK 弹出如下界面 然后继续search 设置anti-sense primer的位置、长度及PCR产物的长度等参数 通过search 来不断调整sense primer及anti-sense primer的位置及长度，直至调整到可以扩 出目的片段全长或近似全长。 进而编辑sense primer及anti-sense primer，适当删减或增加碱基，避开结尾TTT或AAA， 尽量以G结尾，使得TM相近、GC含量适当(45-55%之间)。 点击Anti-primer 和edit之后，弹出界面: 在最后添加碱基T并分析analyze: 此时引物3’端为A，不稳定，删除3’端的A，使之从5’-3’为以G结尾， analyze，OK，为: 此时，引物设计基本完毕sense primer为: Anti-sense primer为: 因为我们要扩增的片段既定的目的片段，所以只考虑所设计引物的长度(与合成准确率有关，长于25bp的引物合成准确率降低)TM(PCR时两端引物退火温度应尽量一致)及GC含量，忽略其形成引物二聚体、发卡结构等。所以虽此次设计的sense primer与anti-sense primer都有飘红现象，忽略之。