细胞
面抗原的定量测定方法
标记免疫分析与l临床2002生箜鲞箜塑 ?
方法研究?
细胞表面抗原的定量测定方法
周春喜
(解放军总医院医学实验测试中心,北京100853) ?
217?
摘要:介绍了用流式细胞仪定量测定细胞表面抗原的方法,测定了淋巴细胞表面
CD4分子的数量.该法操作简
单,结果可靠.
关键词:流式细胞仪:
中图分类号:R318.6
荧光分子定量测定:
文献标识码:A
细胞表面抗原
文章编号:1006
流式细胞仪的应用实践表明,除了
抗原 表达阳性细胞的比例,还有必要检测细胞抗原的
而传统的流式细胞仪测定方法只测定 表达密度.
表达目标抗原的细胞比例,并不能测出细胞所表 达目标抗原量.本文介绍一种用流式细胞仪定量 检测细胞抗原分子数的方法.
材料与方法
1材料
1.1样品献血员外周全血,肝素抗凝.
1.2
品标准化的藻红蛋白(PE)标记的 塑料微球(简称PE微球),由B—D公司提供;共 四种标准PE微球,微球上的PE分子数依次为 1400,14000,36600,182000. 1.3试剂PE标记的鼠抗人CIM抗体(简称 CD4一PE),由B—D公司提供,0.1mol/L磷酸盐 缓冲液(PBS),pH7.4,含0.1%NaN.,0.1%BSA.
2方法
2.1荧光强度一荧光分子数曲线的制作PE 微球用0.6mLPBS溶解,调整好前向角散射光 (FSC),侧向角散射光(ssc)和荧光FL一2等参数 后,用流式细胞仪依次记录四种PE微球的平均荧 光值.以微球的平均荧光值对其PE分子数在双 对数坐标纸上作标准曲线,并求出拟合曲线方程. 2.2细胞表面CD4分子数的测定取50L 抗凝血,加10LCD4一PE,室温避光温育30min,
—10 收稿日期:2001一O5—20:修回日期:2001—08加0.6mL红细胞裂解液(B—D公司提供),温育 8min.在FSC—SSC散点图上对淋巴细胞设门, 用流式细胞仪记录CIM阳性细胞的平均荧光 值n].以CD4阳性细胞的平均荧光值从拟合曲线 方程求出其所结合的PE分子数及其所表达的 CD4分子数.
结果
PE微球分子数和CIM阳性细胞的平均荧光 值及CV值见表1.
表1微球及细胞的平均荧光值
用流式细胞仪测得四种PE微球的平均荧光 值依次为29,12,311.58,835.37,3766.99,所得拟
合曲线方程为Y=1.002x一1.675,r=0999.求 得CIM阳性细胞的平均荧光值为1068.79,其常用 对数值为3.02889,代入拟合曲线方程求得z=4. 6945个CIM—PE分子,而每个CIM抗体分子要 结合两个CIM抗原分子,所以CD4阳性细胞上所 表达的CD4分子数平均值应为98976. 讨论
通过已知数量的荧光分子标记的标准微球,
?
218?
应用流式细胞仪可以测定每个染色细胞上结合的 荧光素分子的数量.根据每个抗体分子所结合的 荧光素分子数可以求出每个细胞上的抗体结合量, 根据抗体与抗原的结合比,又可进一步求出每个 细胞上抗原分子的表达量.荧光及抗原表达量的 定量检测很有实际意义,尤其是当细胞抗原表达 量不一致时,就需要用一个标准方法来检测细胞 标志的表达水平.有些细胞抗原的表达常常表现 为从阴性到强阳性的连续变化,如活化相关抗原 CD38,CD69,HLA—DR,CD25,CD122及CD95 等,它们的表达常用强阳性,弱阳性来表示.但 是,这种定性的结果会随仪器及实验室的不同而 有所变化.而使用细胞荧光分子定量技术测定每 个细胞上荧光分子的绝对数量,再换算为细胞的抗 原表达量,就可以将细胞抗原的检测标准化,从 而统一不同仪器及不同实验室的检测结果. 本文通过淋巴细胞上CD4分子的检测介绍了 荧光分子定时检测技术,这种技术可应用于炎症
反应,中性粒细胞功能,单核细胞功能,树突状细胞 功能,败血病,疫苗和肿瘤治疗等的检测中.例如, 可以检测粒细胞表面的CD64抗体结合量或单核 细胞的HLA—DR抗体结合量,前者是反映感染 和系统性急性炎症反应的一个指标,而后者则是 感染监测的重要指标.除检测抗原外,还可通过 荧光素标记的配体定量检测细胞上相应受体的表 达量.
LabeledImmunoassays&ClinMed,Decewlbet2002.Vo1.9.No.4
荧光分子定量检测技术操作简单,结果准确 客观,适合临床使用.在实验过程中应注意以下 技术
:
(1)要选用PE标记的荧光微球和抗体,因为 PE的荧光非常亮,且不易淬灭,是非常理想的细 胞荧光分子量试剂.其它荧光素如异硫氰酸荧光
,由于激发光谱和发射光谱重叠,容 素(FITC)等
易导致荧光淬灭.FITC对pH值敏感,当pH值 在6.4以下时荧光会显着降低.PerCP在进行激 光检测的过程中会发生蛋白水解,影响定量的准 确性.所以都不适宜做荧光定量标准.
(2)染色细胞应不固定而直接进行检测,以避 免由于固定造成的PE荧光下降.为确保抗体饱 和,染色细胞用缓冲液稀释后应立即测定. (3)在检测过程中要保持仪器参数的一致,特 别是荧光检测器的电流电压与荧光补偿比率. (4)在本实验中,由于淋巴细胞的CD4表达 很强,其所结合的PE荧光也很强,相比之下淋巴 细胞的本底荧光很弱,可以忽略不计.但检测表达 较弱的抗原时,细胞的本底荧光就相对较强,应
考虑从细胞的总荧光值中扣除细胞的本底荧光值,
以免检测结果比实际偏高.
参考文献:
[1]周春喜,梁学颖,李楠,等.流式细胞仪进行干细胞绝对计数的
方法[J].标记免疫分析与临床,2001,8(1):60—61.
QuantitativeDeterminationofCellSurfaceAntigen
ZHOUChun—Xi
(MedicalExperimental&AnalysisCenter,GeneralHospitalofPeoplesLiberationArmy,Beijing100853,China)
Abstract:Themethodwhichcouldquantitativelydeterminethedensityofantigenofthecellsurfacewases—
tablishedbyflowcytometry.ThenumberofCD4moleculesonthesurfaceofhumanlymphocytewas
determined.Themethodissimpleandresaltisraliableandreprode—cible.
Keywords:Flowcytometer;Quantitativedeterminationoffluorescentmolecules;Antigenonthesurface
ofcell
(陈泮藻编委审张增武编辑)