己烯雌酚对鸡受精卵雌性化的影响（可编辑）

己烯雌酚对鸡受精卵雌性化的影响（可编辑） 己烯雌酚对鸡受精卵雌性化的影响 维普资讯 ////0>. . . 第 卷 第 期 科 技 通 报 . , 年 月己烯雌酚对鸡受精卵雌性化的影响 周 敏 ,前田照夫 ,徐世清卜 .苏州大学 生命科学学院,苏州 ; .日本广岛大学 生物生产学部,广岛 ?摘 要:为探讨环境激素的评价方法,研究了己烯雌酚 对鸡胚胎性器官发育的影响 向鸡受精卵 内注射,用 染色体的 标记确认基因型,解剖及切片观察生殖腺确认型,调查雌性化情 况。结果 .以下剂量的注射鸡受精卵,对 龄胚胎的生存率、孵化率没有不良影响 .,实验方法安全。但基因型 的雄性个体精巢退化甚至消失、出现卵巢的雌性化现象,以芝麻油 为溶剂时, .处理的雌性化率为。能够显著导致鸡受精卵的雌性化,鸡或鸟类的 受精卵的雌化率是环境激素的生物学评价的有效和灵敏的指标。 . 关键词:鸡;环境激素;己烯雌酚;雌化 中图分类号: . ; 文献标识码: 文章编号:? . ?? , 。, , ,, ; . , ,, ,: ? :‘‘,,; .,. . ., , , ;., . ,. ? . .. ? ? . ? : ; ; ; 收稿日期:一 ? 基金项目:国家重点基础研究发展计划 作者简介:周敏 一 ,女,江苏苏州,硕士,主要从事环境激素评价方法研究。 强讯作者:徐世清一 ,教授,博士生导师。 ? : . . : 维普资讯 ////. 科 技 通 报 第 卷 外线照射 灭菌。鸡受精卵用 / 乙醇擦 环境激素,即环境内分泌干扰物 拭后,按照文献 方法在卵壳开孔,保, ,是对环境 持卵壳膜完好;再次用乙醇消毒后,用黏合剂把 质量和人类健康影响广泛、危害重大的一类化 硅胶塞覆盖粘附在开孔上。分别用纯乙醇 学物质。 存在于环境中并能干扰人或动 物体内激素的合成、分泌、运输、结合、作用、代 . 、和芝麻油溶解,配制成浓度为./ 、 ./ 和 ./ 的溶 谢或消除等,表现出拟天然激素或抗天然激素 的作用,能够引起中毒或在较低的接触水平下 液,卵后极 钝部 朝下放置, 后,按照文 即对心、肺、肝、肾、性腺等器官产生危害。开展 献 方法用微量注射器往卵黄内注射 . 环境与人类健康关系的基础研究,是环境科学 的溶液,用胶带封好硅胶塞。每个受精卵 注射 . ,每种浓度用受精卵 × 个。把 与医学共同面对的课题,其中选择合适的动物 模型与环境激素的生物快速方法是迫切需 卵放人温度. 。 、 . .的孵卵器内 要解决的问题。 孵化。 己烯雌酚, ,又称乙 . 胚胎生存率和孵化率调查 酚或二乙基乙烯雌酚,是一种人工合成的动物 处理 后,用烛光法 对受精卵 雌性激素,西方国家曾长期作为动物饲料添加 透光检验,观察胚胎的生存率;第时根据破 剂使用,有提高饲料蛋白质转化效率、促进生长 壳情况调查鸡的孵化率。 . 法判定鸡的基因型性别 的作用,医学临床上被广泛用于防止孕妇 流产和妊娠并发症。 年发现其可诱发阴道 鸡的性染色体为 型,只有雌性才具有 染色体。根据鸡 染色体的序列,,合 癌,与月经失调、乳腺癌、宫外孕、早产及不育症 成特异引物,扩增后判断性染色体的配型。 的发生有关;动物实验和人群流行病学研究显. 血液 的提取 示,可干扰暴露者及其子代的内分泌功能 杀死孵化后的幼雏,采血抗凝固处理。取 和生殖功能,且有致癌作用 。目前使用“ 血液用自动核酸抽出装置 已经受到限制。 一 抽出。 鸡受精卵在孵化前注射雌激素. . 扩增 或将其浸在其溶液中,孵化出雏鸡的表现型全 部为雌性 。鱼类、两栖类经过雌激素 ? 反应总体积为 。其中 . 灭菌 处理后,也可引起性别转换 。但目前为 双蒸水、 ./、 倍 止,还没有深入进行对鸡性转化的系统评 缓冲液、 . 聚合酶 、 . /、 “ 引物? 价方法的研究,为了研究利用鸡受精卵进 、 、 “ 引物一 行环境激素评价的可行性,本文利用进行 一 一、 了调查。模板, 一公司 仪进行 扩增。 ?预变性 , ?, ? 与方法 退火, ?延伸 , 个循环后接 ? . 材料。产物在 琼脂糖 缓冲液 凝胶中 白色来杭鸡品种。受精卵保存在温度 电泳 ,经染色后在紫外灯下观察拍照。。 , . .的恒温恒湿环境中, 周内使 用。购自 公司,纯度 。 . 生殖腺观察 . 处理方法 胶带 公司 、硅胶塞 公 通常雄鸡的精巢是左右两侧发育,而雌鸡 司 、剪刀、镊子等实验器材用高温干燥灭菌 的卵巢只有左侧一个发育。本实验中,解剖观 ?,,注射针和黏合剂 东亚合成株 察雏鸡的生殖腺,以此表现型为依据判别鸡的 式会社生产 在实验开始前无菌操作台内用紫 发生性别。拍照后,取出精巢或卵巢,称重。然维普资讯 ////. 第 期 周 敏等.己烯雌酚对鸡受精卵雌性化的影响 后生殖腺用的甲醛固定,经乙醇系列脱水 鸡受精卵对存活率的影响比芝麻油溶剂小;从 后,用石蜡包埋,切片染色后显微观察。 存活率数值看,用乙醇作为的溶剂,最低的 . 区也达到 . ,属于较高的实验存活 率。 . 统计处理 . 对鸡受精卵孵化率的影响 龄胚胎的生存率、第 天的孵化率,以 不同量的注射到鸡受精卵内,对孵化 及雌化率、生殖腺的重量等各项指标的重复调 率的影响因溶剂不同剂量效应有显著差异 表 查数据,进行统计和显著性测定。。以乙醇作为溶剂时, . 以上高剂量与 对照及 . 以下低剂量的注射量之 间,注射卵的孵化率有显著差异 .;但 结果与分析 注射量低于 . 的注射卵与仅注射乙 . 对鸡胚胎生存率的影响 醇溶剂的鸡受精卵的孵化率没有显著差异。以 注射到鸡受精卵内,对孵卵 后胚胎 芝麻油作为溶剂时,虽然各种试验注射剂量之 的生存率影响结果如表 。以乙醇作为溶剂时, 间鸡受精卵的孵化率存在显著差异 ., 虽然. 以上高剂量与 .以下低剂量 但注射量低于 . 的注射卵与仅注射 的注射量之间,鸡受精卵内胚胎的存活率 芝麻油溶剂的鸡受精卵的孵化率没有显著差 有显著差异 .,但各种注射剂量与仅注 异。也就是说,无论用乙醇还是芝麻油作为溶 射乙醇溶剂的卵胚胎存活率之间没有显著差 剂,注射量低于 . ,对孵化率没有显 异。以芝麻油作为溶剂时,虽然 .以上高 著影响。 剂量与 . 以下低剂量的注射量之 . 对鸡受精卵雌化率的影响 间,鸡受精卵内胚胎的存活率有显著差异 正常情况下,基因型和表型一致的鸡雄性 .,但注射量低于 . 的注射卵与 基因型为 型 的个体,有左右两个精巢 图 仅注射芝麻油溶剂的鸡受精卵内胚胎的存活率 ,且精巢的髓质内有较发达的精小管 图 没有显著差异。说明注射对鸡受精卵内胚 ;基因型为雌型 的个体,只存在左侧 一 胎的存活率有一定影响,但 .以下低剂量 个卵巢 图 ,卵巢的髓质内有血管 图 。 注射影响不显著;用乙醇作为 的溶剂注射 表 对鸡受精卵 周龄胚胎生存率的影响注:表中数据为平均值?标准差,同 行上标不同字母表示差异显著 .。 表 对鸡受精卵孵化率的影响注:表中数据为平均值?标准差,同行上标不同字母表示差异显著 .。维普资讯 ////. 科 技 通 报 第 卷 , 曼 瑚 啪 咖 伽 .渤 撇 图 鸡生殖巢的形态. 注: :基因型 、 :基因型 , :生殖腺外观、 :生殖腺切片, :精巢、 :精小管、 :卵巢、 :血管。 : .. .. . . . .利用 特征 标记检测,具有标记检测后确认其基因型为型的部分遗传 染色体的基因型雌型个体,出现一条分子量为 型雄性孵化雏鸡,右侧保留了精巢样的小生殖 的特征性 条带,而 型雄性个体 腺,而左侧有像卵巢样的生殖腺存在 图 则没有任何条带出现 图 。,且组织学检查与卵巢结构一样 图,即部分雌性化;还有部分基因型 型的 遗传型雄性个体,没有精巢存在,只有卵巢样的 小的生殖腺 图 ,组织学检查也确认与卵 巢结构一样 图 ,即完全雌性化。 根据检测基因型为 型 雄性 的个 体,而生殖腺形态检验有右侧精巢退化缩小、左 侧精巢完全退化、变成卵巢的部分雌性化个体, 与两侧精巢都完全退化、左侧出现卵巢的完全 雌性化个体合计计算的雌化率与注入量呈 显著相关性,或者说注射后能够显著地诱 发基因型为 型 雄性 个体的雌性化,其中以 图 鸡性别的特征图谱 芝麻油为溶剂时,注入量 .以上的低. 剂量就能导致雌性化现象出现 .,而 注: :表示分子量标准, 和 :基因型 : . . . 以上的剂量就能导致所有的个体雌性 . 化 . 表 ,用雌化率表示对鸡的 鸡受精卵注射 后, 特征 雌激素作用结果非常明显。维普资讯 ////. 第 期 周 敏等.己烯雌酚对鸡受精卵雌性化的影响 图 处理后雌性化鸡生殖巢的形态变化. 注: :基因型 , :部分生殖腺变化, :整个生殖腺变化 :生殖腺外观、 生殖腺切片, :精巢、 :精小管、 :卵巢、 :血管。 : . . . . . .. . .表 对鸡受精卵雌化率的影响注:表中数据为平均值?标准差,同行上标不同字母表示差异显著 .。 . 注入对鸡生殖腺重量的影响 合成有关的五种酶的一 表 是注入后测定的生殖腺重量的变, ?, 一, ?和? 化结果。孵化出雏鸡雄的个体右侧精巢重 .存在于雌胚左右的生殖腺,左右生殖,雌的个体左侧卵巢重 .。雌化个体左侧 腺产生雌激素 。而雄的胚胎因为缺 生殖腺的重量是 .,显著重于雄的精巢的重 乏合成雌激素的最后两种酶 一 量,而与雌的卵巢重量相比较则无显著差异。 和 ,不能产生雌激素。雌胚的雌激素 的受体 只存在于左侧的生殖腺内, 因此雌激素只对左侧生殖腺起作用,诱导原始 结论与讨论 卵泡的皮质发育。而雄胚虽然有雌激素的受体 鸡胚胎生殖腺形态上的分化从孵卵第 日暂时的存在,但由于没有雌激素, 开始由性激素决定。孵卵第 日,与雌二醇一没有活性,而不能导致类似雌性 的左侧生殖