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聚乙二醇

2017-09-20 15页 doc 88KB 69阅读

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聚乙二醇摘要     越来越多的蛋白质多肽类药物被应用于人类疾病的治疗,与其它合成化学药物相比,它们有易引起机体的免疫反应,体内半衰期短,在体内易水解、变性等缺点。化学修饰作为一种新兴技术,能改善上述不良特性。本文主要优化合成了一种PEG修饰剂——mPEG.NHs,采用牛血清白蛋白BsA和溶菌酶作为模式蛋白对其修饰条件进行了优化,并用层析法分离修饰后蛋白质。 mPEG.NHS的合成主要通过两个反应得到,第一步是mPEG同丁二酸酐之间的酯化反应,得到mPEG—SA,第二步是mPEG—SA同NHS(N.羟基硫代琥珀酰亚胺)反应,在脱水剂...
聚乙二醇
摘要     越来越多的蛋白质多肽类药物被应用于人类疾病的治疗,与其它合成化学药物相比,它们有易引起机体的免疫反应,体内半衰期短,在体内易水解、变性等缺点。化学修饰作为一种新兴技术,能改善上述不良特性。本文主要优化合成了一种PEG修饰剂——mPEG.NHs,采用牛血清白蛋白BsA和溶菌酶作为模式蛋白对其修饰条件进行了优化,并用层析法分离修饰后蛋白质。 mPEG.NHS的合成主要通过两个反应得到,第一步是mPEG同丁二酸酐之间的酯化反应,得到mPEG—SA,第二步是mPEG—SA同NHS(N.羟基硫代琥珀酰亚胺)反应,在脱水剂DCCI(N.N’一二己基碳二亚胺)的催化下得到mPEG.NHS。 通过优化反应条件使得mPEG的转化率和mPEG.NHs的纯度都得到提高。优化后反应条件分别为:n1酯化反应采用毗啶为催化剂,酸醇比为10:I,反应时间3 h;f2)脱水反应时间25h,温度400C反应物摩尔比mPEG.sA:NHS为1:2.5。优化后的两步反应的转化率分别为60.1%和56.O%。   mPEG—NHS修饰蛋白质在不同的反应条件下得到不同修饰率的蛋白质,优化反应条件后能得到更高氨基修饰率的修饰产物。最佳修饰反应条件为:反应时间10min,蛋白质和修饰剂质量比为1:5,采用pH=9.O的硼砂缓冲液,在优化条件下可得到修饰率为47.5%的产物。   由于修饰反应得到的蛋白质溶液中含有连接有修饰剂的蛋白质和未连接修饰剂的蛋白质,可通过层析的方法将它们分离开。溶菌酶修饰产物采用seDhadex G.75凝胶层析和Deae.sepharose CL-6B阳离子交换层析相结合的方法:BsA修饰产物采用sephadex G.100和Q.SeDharose阴离子交换层析相结合的方法。用sDs.PAGE电泳检测分离产物,证明未修饰的蛋白质同被修饰的蛋白质被分离开来。 关键词:PEG修饰 化学修饰 合成 优化 分离 层析 随着生物工程技术的迅速发展,生物技术活性物质不断面世,已有不少生物技术药物应用于I}缶床,国内外已批准上市的约40多种,目前正在研究的则成倍增加,在这些品种中,大量的均为多肽与蛋白质类药物“。蛋白质、多肽类药物(如肿瘤坏死因子、白介素、胰岛素等)以其疗效好、副作用低等突出优点受到了广大医务工作者及患者的青睐。但与其它合成化学药物相比,它们也有易引起机体的免疫反应,体内半衰期短,在体内易水解、变性,不易储藏等缺点。另外,由于多数蛋白质和多肽类药物具有较低的分配系数和很小的扩散性能,使其不易被亲脂性膜所摄取,很难通过生物屏障,因此尽管DNA重组技术已使蛋白质、多肽药物可以大量生产,但由于以上因素从而大大限制了它们在临床上的应用。为此,研究和开发稳定,半衰期长,生物相容性好并且容易吸收的蛋白质、多肽药物体系一直是科学工作者们试图解决的一个迫切课题。 1.聚乙二醇的性质及制备方法 1.1聚乙二醇的性质 聚乙二醇(polyethyleneglycol,简称PEG)是一种能同时溶于水和有机物的具有油水二亲性的高聚物。聚乙二醇同蛋白质相连可改变蛋白质生物化学特性,包括分子大小,疏水性及电荷等,增加蛋白水溶性和稳定性:PEG与药物相连,能够增大药物的相对分子质量,减少肾消除,延长药物的半衰期,增大药物的水溶性,并且PEG链包裹在药物表面,能够遮蔽药物的抗原决定簇,降低药物的免疫原性。PEG化(pegylati。n)技术在药学、人工移植和其它应用方面都有很大用途。1977年Abuchowski等首先应用聚乙二醇修饰BsA01。在这以后的二三十年 里,PEG修饰技术发展迅速,而且很快得到了广泛应用。目前较为常见的被PEG 连接的分子有蛋白质和多肽,特别是一些疏水性的分子。除此之外,PEG与紫杉醇、喜树碱、阿霉素、阿糖胞苷、鬼臼毒素等小分子药物的连接也显示出较好的应用前景“3。高分子量PEG已被FDA批准用于人体。迄今已有7个药物通过FDA批准进入市场“1。 修饰蛋白质等高分子常用的PEG相对分子质量为200~40000,分子量小于1000呈无色透明液体,大于1000在室温下呈白色或米色糊状或固体,微有异臭。PEG易溶于水和多数极性溶剂,不溶于脂肪烃类、苯和矿物油等非极性溶剂。PEG具有很强的吸湿性,随着相对分子质量的增大吸湿性迅速下降。它还具有微弱的表面活性,随着其水溶液浓度的增加,表面张力逐渐减小。相对分子质量较低的PEG水溶液黏度不高,随相对分子质量的增高而上升。 PEG的大鼠口服半致死量LD50分别为:PEG200为28.9ml/kg,PEG400为30.2 ml/kg,PEG4000为599/kg”。。 1.2聚乙二醇的制各方法 聚乙二醇(p01yethylene 91ycol,PEG)是用环氧乙烷与水或乙二醇逐步加成 聚合得到的相对分子质量较低的水溶性聚醚,反应通式如下:                     +H:o—t Ho髑脚1陆H       ^\/。哭7心+茹●啪两脚,陆H  0     氧乙烷开环聚合是离子型聚合反应,用酸或碱作催化剂(常用碱或配位阳离 子作催化剂),用水、乙二醇、乙醇或低相对分子质量聚乙二醇作引发剂,后者 适合制备相对分子质量大于l,ooO的聚合物。聚合方法可采用液相或气相聚合,用脂肪烃和芳烃作液相聚合溶剂,用氢氧化物作催化剂。此反应在150~180。C、 0.3~0.4MPa下进行,反应器中使用稀有气体填充,以防环氧乙烷和空气形成爆炸性化合物。当反应达到预期相对分子质量时应降低压力,中和催化剂,用离子交换树脂除去无机物,冷却过滤即得成品。为避免在修饰过程中发生交联和团聚,常采用mPEG作为修饰剂的合成原料,其结构式为cH,0一(一cH。一cH。O)一H。不同的聚合工艺和不同来源的mPEG的分散性不同,ⅢPEG的分散性高,修饰物的均一性难以保证。另外,由于聚合过程中少量水的存在,111PEG产品中有1~15的PEG二醇(0H—PEG—PEG_OH)杂质。其含量取决于mPEG的分子量,分子量越小,二醇的含量越低。二醇在mPEG的活化过程中会产生交联或团聚。若IIlPEG产品中存在二醇,凝胶过滤色谱图谱上就会出现一个位于主峰前的小峰,分子量恰好是mPEG的2倍;通过峰面积可确定相应的二醇含量”。 1.3聚乙二醇修饰对蛋白质等高分子的影响     大多数蛋白质等高分子经PEG修饰后,其特性在一定程度上发生改变,许多不足之处得到改善。   l、免疫原性与抗原性消除或降低     消除或降低蛋白质等高分子的抗原性效果明显。PEG为一种亲水不带电荷的线性大分子当它与蛋白质的非必需基团共价结合时,可作为一种屏障挡住蛋白质分子表面的抗原决定簇,避免抗体的产生或者阻止抗原与抗体的结合而抑制免疫反应的发生。例如天门冬酰胺酶用PEG修饰后可消除抗原性”“…。   2、热稳定性提高     这是由于PEG共价连接蛋白质等高分子后,其天然构象产生一定的刚性,不易伸展失活,减少了分子内部基团的热振动,从而增加了热稳定性。热稳定性与PEG和蛋白质等高分子之问的交联点数目有关,单点交联并不明显,交联点增多稳定性提高。热稳定性提高的另外一个原因是PEG本身增加了蛋白质等高分子的表面亲水性,使其在水溶液中形成新的氢键和盐桥。     3、抗各类失活因子能力提高     PEG修饰后的蛋白质等高分子抗蛋白水解酶水解、抗抑制剂、抗酸碱和有机溶剂等变性失活能力提高。原因是PEG所产生的空间屏蔽阻挡了失活因子的进攻。此外,蛋白质等高分子中对蛋白水解酶等失活因子敏感基团被修饰,使其能力提高。过氧化氢酶经PEG修饰后,抗胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶水解能力明显提高。     4、体内半衰期延长     许多蛋白质等高分子经PEG修饰后,抗蛋白水解酶、抗抑制剂等失活因子的能力和热稳定性提高,其体内半衰期比天然蛋白质等高分子长,对提高蛋白质等高分子的药用疗效极具意义…。例如天门冬酰胺酶经PEG修饰后,体内半衰期可延长13倍。     5、溶解性增加     药用PEG易溶于水和多数极性溶剂,不溶于脂肪烃类、苯和矿物油等非极性溶剂。随相对分子质量升高,其在极性溶剂中的溶解度逐渐下降。   6、对组织分布能力的改变     一些蛋白质等高分子经PEG修饰后可改变组织的分布能力,能在血液中被靶器官选择性吸收。   7、毒性减少     PEG可使大多数蛋白质等高分子毒性减少,且本身无毒性(相对分子质量>1,000),相对分子质量为4,000的PEG可按每千克体重169的剂量,以10%的溶液安全地注射人鼠、兔、猴等动物体内,不伤害蛋白质和细胞。     8、最适pH改变     有些酶经PEG修饰后,最适pH值改变,这在生理和临床应用上以及工业生产中更好地发挥酶的催化作用方面极具意义””。     9、酶学性质的改变     绝大多数酶经PEG修饰后,最大反应速度无变化,但米氏常数会增大。用PEG还可能改变底物的专一性,如脂肪酶经PEG修饰后,就可溶于有机溶剂并能催化酯合成和酯交换等有机相反应,这将扩大其在科研和生产中的应用范围。这种方法还可用于立体专一性的有机合成中。     10、  动力学性质、等电点、电泳行为等改变     在聚丙烯酰胺凝胶电泳中,PEG修饰蛋白质等高分子的泳动速度明显减慢, 且比按分子增长推算出来的速度还慢,推测与线状PEG分子间的相互缠结有关。 Lys的e—NH2带正电,PEG修饰后,蛋白质等高分子中的正电荷减少,故等电点降低。 2.聚乙二醇修饰技术的发展过程 2.1新型聚乙二醇化技术的发展     1977年Abuchowski等首先应用聚乙二醇修饰BSA““。在这以后的二三十年里,PEG修饰技术发展迅速,而且很快得到了广泛应用。     第一代的PEG的修饰技术如图1.1所示,第一代PEG修饰常用的修饰剂有:单甲氧基聚乙二醇碳酸琥珀酰亚胺酯(mPEG—Sc)等,通过酯键或三嗦环将PEG与蛋 白质分子偶联,这种非特异性的不稳定连接方式使得一个蛋白质分子经常连接上数个PEG分子。如mPEG—ss偶联到Lys残基侧链的e~氨基上,由于蛋白质分子表面一般存在多个e一氨基,加之每个e一氨基的反应活性不同,因此,修饰产物往往是不同修饰程度及不同修饰位点的产物混合物,使用时需要将这些混合物分离开。因此,第一代PEG修饰的蛋白类药物的通常表现出不稳定性、较大的毒性和免疫原性,生物活性、药代动力学的性质与原型药物没有本质的改变。传统方法得到的PEG衍生物已经远远不能满足需求,新一代的PEG衍生物以高分子量,特异性好,纯度高,功能多等优点取代了传统PEG衍生物的应用。表1是新一代PEG衍生物同传统PEG衍生物的对比:                 表l_l新一代PEG衍生物同传统嘲生物性质上的区别       Traditional PEG derivatives          New generation PEG deriVatiVes                                             High  molecular weight  (1—60     Low molecular weight(<12 kDa)                                                        kDa)         High percentage of dyad            Low percentage of dyad sy啪etry         symmetry(10一15%)                              (<2%)       Non—specific modification                Specific modification     Each drug molecule is modified        Each drug m01ecule  is modified   by several PEGs molecules:The        by sin91e PEGs molecule:The activity   activity of the drug is  10w                of  the drug  is high.         Instable in the physical                Stable  in the physical                               enviromnent                            envirOment                                                     New types of PEG                                       derivatives.such as multi—arm PEGs:                                  heterobifunctional PEGs 2.2特异性PEG修饰     蛋白质或肽类分子上的反应性官能团多呈亲核性,其亲核活性通常按下列顺 序依次递减:巯基>a一氨基>e~氨基>羧基>羟基。巯基通常存在于蛋白质的二硫键和活性位点上。而羧基若不与蛋白质上的氨基发生分子问或分子内中和反应,电很难活化。因此,蛋白质或多肽分子最容易与修饰剂发生作用的位点是分子表面赖氨酸残基上的e一氨基。传统的PEG随机修饰蛋白质多以赖氨酸的e一氨基为修饰目标。当PEG没有选择性的同蛋白质或者其它目的分子反应时,这些同PEG 连接的氨基酸可能处于这些生物活性物质的活性中心,一旦PEG连接上去就会极大降低活性或者完全使之失活““。另外在蛋白质类分子表面往往有无数个lys残基,当PEG衍生物无选择性的和£一氨基反应时,不同个数的PEG同蛋白质的连接物就会有一系列不同的分子量。而且在很多情况下,PEG的功能基团既能同1ys上的e一氨基反应,又能同his上的一NH-和cys上的SH一反应,这样形成的PEG复合物将是一个很复杂的混合物“”。为了得到分子量单一,保持生物活性的PEG复合物,一些新的PEG衍生物应运而生了。这就是能同蛋白质的某些特定位点特异性结合的第二代PEG衍生物,例如,特异性同his,cys或者氨基末端反应““。下面分别对它们的修饰特性作详细的介绍。     1、巯基修饰     此类PEG偶联剂主要有:①PEG一马来酰亚胺(PEG—maleimide)““:②PEG一邻一吡啶一二硫醚(PEG—ortho—pyridy卜disulphide);③PEG一乙烯基砜 (PEG—vinyl su]fone):④PEG一碘乙酰胺(PEG—idoacetaIIlide)。其中,PEG一马来酰亚胺应用较多,但在水中不够稳定,容易发生开环反应“”。winslow等在PEG与马来酰亚胺之间添加芳香环作spacer,并用来修饰血红蛋白质,取得了更佳的修饰专一性“”。对于缺少巯基的蛋白质,可以通过基因工程在蛋白质的合适位置引入巯基,再用相应PEG偶联剂进行修饰。常用的引入位置有,糖基化蛋白质的糖基化位置、蛋白质的抗原决定簇、蛋白质末端等。一个成功的例子是白细胞介素2的PEG化,普通的白细胞介素在3的位置上为一个糖基化苏氨酸,突变后将其变成半胱氨酸,然后同maleimied—PEG反应,得到一个完全保留生物活性的修饰物,而修饰后白细胞介素在血清中的清除速率降低了4倍““。除了采用基因工程,还可用Traut试剂处理蛋白质引入巯基。此方法的主要特点是方便可靠,目前应用最为广泛。缺点主要是半胱氨酸在蛋白质内多为重要活性基团,因此修饰有可能影响活性。     2、N一末端氨基修饰     比较有效的一种方法是利用蛋白质N一末端氨基的高反应活性。通常,蛋白质N末端氨基pKa(7.6—8.O)小于蛋白质其他的氨基酸,如赖氨酸的pKa  (10.O一10.2)。在低pH值(如pH5.O)溶液中,PEG一醛与N末端氨基反应的机率远远大于与赖氨酸上的£一NH2,PEG主要与蛋白质N一末端氨基相连。Lee…3用PEG—丙醛修饰表皮生长因子(EGF),与随机修饰的产物相比,两者半衰期都延长了4—6倍,但定向修饰的产物基本保持原活性,而随机修饰则造成活性几乎完全丧失。N一末端氨基修饰具有简单易行,修饰产品质量容易控制的特点。Amgen公司采用此方法生产的PEG-filgrastim在2002年通过FDA批准进入市场,成为已经上市的第一个采用PEG定向修饰技术的药物。此外,AⅡlgen公司采用此法修饰肿瘤坏死因子受体1(TNFR—I),也处于II期临床研究阶段。另外一种N末端氨基修饰方法利用了基因工程技术。一般蛋白质中的氨基主要来自赖氨酸和N末端,利用基因工程技术,将蛋白质中的赖氨酸用其他氨基酸取代,再用与q一氨基特异性反应的PEG 偶联剂与蛋白质反应,能够达到很好的N末端修饰。     3、羰基修饰     对于N末端为丝氨酸和苏氨酸的蛋白质,用高碘酸钠氧化形成醛基,与 PEG—oNH2偶联剂发生特异性反应生成肟。而末端非丝氨酸和苏氨酸的蛋白质,可 以先通过转氨反应生成酮,或者用氨肽酶水解生成丝氨酸或苏氨酸,然后再与 PEG_0NH,偶联剂反应。此方法的主要缺点是适用的蛋白质数量较少,而且某些蛋白质经过处理活性有可能损失。     4、定点突变引入非常见氨基酸     用cys或者lys的氨基同PEG衍生物反应有很多缺点,例如,某些复合物不稳定很容易分解,有些复合物稳定但是容易水解,所以常常在同蛋白质连接上之前就水解掉了;有些没有选择性的连接很容易使得活性物质失活,而且重复性不好;有些连接反应速度太慢;有些复合物是有毒性的。为了得到稳定性好的高特异性PEG修饰产物,研究者使用了一些新的方法来克服前面的那些缺点。其中一种方法就是用基因突变的方法在E.Coli或酵母表达出的蛋白产物中引入一种新的非常见氨基酸成分。…,并且这些氨基酸在E.Colj和酵母中的表达有高度的忠实性 。。。”。3“2…。这种方法能够在表达蛋白中引入新的化学功能基团,例如炔基和叠氮化物,酮类侧链,糖基化基团,氧化还原活性基团,光交联反应基团等。这些引入的活性基团不会同20种常见的氨基酸反应,却能同PEG活化剂形成稳定的共价键结合在一起。例如在蛋白质中引入带有叠氮基的氨基酸,就能同含有炔基的PEG衍生物在水溶液中发生Huisgen[3+2]环加成反应。”。…。这个反应条件温而且形成一种稳定的环加成化合物。在生理条件下,炔基也不同没有叠氮基的氨基酸中反应。这样的例子有SOD的PEG修饰o”。选择SOD氨基酸链上位置为33的trp作为突变对象,将其对应的密码子突变为TAG,得到碳末端含叠氮基的氨基酸。突变后的蛋白同含有炔基的PEG衍生物在铜离子存在的条件下反应,得到的修饰后蛋 白具有单一的分子量,并且SOD的活性没有任何损失。另一个例子是人生长因子hGH的PEG修饰…1。hGH有11个1ys可被PEG修饰,但是采用lys修饰的方法只能得到分子量不同的混合物。2005年美国化学年会上,Ho Sung Cho报道了一种通过突变在hGH中引进乙酰苯丙氨酸的方法对hGH进行精确的PEG修饰。乙酰苯丙氨酸是一种含有酮基的非常见氨基酸。他们构建了20种分别在蛋白质不同位置插入了乙酰苯丙氨酸的hGH,这些改造后的hGH同PEG修饰剂反应都能得到分子量单一的修饰产物,其中几种修饰后仍然保存有生物活性,在实验动物体内表现出更长的药 物半衰期。可见用这种方法可以得到高纯度,活性保留的修饰蛋白。 5.枝形PEG(Branched—PEG)     枝形PEG因为特性上一些优点得到了广泛应用。目前应用最广泛的枝形PEG是mPEG2一NHS(N—hydroxysucinimid),该化合物由Y锄asaki等以赖氨酸为连接物合成。常用的枝形PEG还有,修饰巯基的IⅡPEG2一MAL(Maleimide)和修饰N一末端氨基的mPEG2一ALD(aldehyde)等。枝形PEG有不同的形状例如叉形,星形等。与链形PEG相比,枝形PEG修饰药物的优点主要在于…:①枝形PEG修饰的产物对酶降解抵抗性更强,并且能够更好的遮蔽药物的抗原决定簇;②一般情况下,相同分子量的枝形PEG比链形PEG修饰的产物有效分子量更大,有效半径也更大;③制备高修饰度的链形PEG时存在“二醇”问题,而更高分子量(>30 000)的PEG主要为枝形;④枝形PEG的空间位阻较大,不太容易进入药物的活性部位,对药物活性的影响相对较小;⑤由于具有较大的空间位阻,一般枝形PEG的反应活性要低 于链形PEG,因此所得修饰产物相对更为均一。架提供了霹溶性、生物降解髓、浆顺性帮连接单元x稻Y斡一定自由度,这样的异端双功能赫pEG衍生物可用作避接两个分子的亲水、嫩物相容的间隔物。弊端双功能基PEGW以用于多种场合,如免疫分析,生物传感,药物靶向,液相多肽合戏等合成异端双功能基的PEG错缴穆的方法己得到较必迅速的发展,蕾选的端基有K珏s蘸、麓来酝亚藏、乙灞孤、懿淀薹二褒纯翡、簸基稻羧酸。爨磐与P鹚一S双具有相近反应活性的Fluorescein~PEG—NHs,一端为荧光素部分,另一端为NHs 活泼酯.与灏白质和含氨基的分子偶联后,可借助荧光分析方便地检测偶联物。“NHs—PEG一生物索的一端为NHs活泼酯。“,用于和生物滋性分子偶联;另一端为生物素,露与豢蠢亲露素豹嚣蒜逶缓,在靼自绘药磅突中经零笈矮潲。 2.3聚乙二醇修饰技术的应用 2.3.1聚如=醇修饰蛋白质多肽类药物的最新发展状况     自1991年第一种用PEG修馋的蟹自药物PEG—ADA被FDA批准上市后,~楚豳际翔窆翻药公瓣舞:&z∞、Ro葫e、Sehering—Plou秘、A晖en、Ph村辩ci氇等辍毂推进PEG修饰药物蛋白的技术,融黼有七种蛋自类药物已经通过FDA认证(袋l。2)。有多种蛋白类药物正处于临床骏证时期,例如PEG化精氨酸脱亚氨酸(ADI—PEG)㈨,PEG化门冬酰氨酶(PEG—Asparaginase)和PEG化重组尿陂酶 (PEG—uriease)…曩翦燕子二嬲鼷庆试验酚段,                    p黼纯甍萄薤萤蘸酶 (PES—Glueoeerebrosi如se)…已经完成了一期临床试验,PEG位哥溶慷齄瘤坏 死因子受体(PEG sTNF_RI)已缀完成了二期临床试验。 2.3.2 PEG修饰蛋白质多肽类药物的应用举例     1、腺苷脱氨酶(ADA)     一些儿童由于先天遗传的原因而缺乏ADA,这种酶的缺乏可导致严重联合免疫缺陷症。治疗的方法有骨髓移植和摄入ADA。PEG修饰的ADA(Pegademase)于1990 年获美国FDA批准用于联合免疫缺陷症,同时又可为无法进行骨髓移植的患者用作替代疗法,也常作为对ADA缺乏症患者进行体细胞基因治疗时的~种重要的辅助治疗手段。Pegademase是最早也是最为成熟的PEG修饰药物,它是将牛ADA共价连接了多条平均分子量为5kDa的直链mPEG,半衰期显著延长(由原来的几分钟延 长到大约24小时),免疫原性减弱。Hershfield首先用PegadeⅢase治疗ADA缺乏症患者,Pegademase几乎能完全纠正患者体内的代谢异常状况,使患者的免疫功能得到不同程度的恢复,而且患者的耐受性好,没有过敏反应。在十多年的应用中,没有与PEG有关的副反应发生““。     2、超氧化物歧化酶(superoxid dismutase.SOD)     SoD是相对分子质量为32,000~80,000的高分子物质。SoD能专一清除超氧阴离子自由基,故引起国内外生化界和医药界的极大关注。多数氧自由基在头部创伤部位的脑血管壁处存积时可造成神经元损伤、局部缺血性神经元损伤和血管损伤,导致血管痉挛。soD是催化超氧阴离子歧化反应的金属酶,对抗脑或心脏由 于缺血后再灌注造成的损伤是一种非常有前途的药用高分子。SOD大多用于治疗 自身免疫性疾病如类风湿关节炎、肺气肿、皮肌炎、红斑性狼疮等,也用于治疗氧中毒、心肌缺氧、抗肿瘤、抗辐射、缺血再灌输综合症及一些心m管疾病,但存在生物半衰期短,由于不稳定而极易失活,异体蛋白免疫原性和患者不易吸收 利用等缺点,限制了临床应用,而用PEG共价修饰就能解决这些问题。经适当修饰后,sOD的抗炎活性增强,抗原性降低,明显提高了耐温、耐酸碱等性质。Enzon 公司治疗脑损伤的药物己进入终审。采用氰脲酰氯法先对聚乙二醇6000进行化,再以活化后的聚乙二醇对牛血s0D冻干粉进行化学修饰,制得PEG—sOD。将天然soD 与PEG—sOD分别进行热稳定性、酸碱稳定性及蛋白酶稳定性实验。得出如下结果: PEG—sOD活性保留率在70℃和80。c的水浴中均比天然SoD高10%~20%,在不同pH下,PEG—SOD活性保留率均比天然SoD高lO%~40%,在胃蛋白酶和胰蛋白酶中PEG—SoD活性保留率均比天然SOD高9%~11%。实验证明,PEG—SoD在2h后的活性保留率仍达95%以上,比天然SOD活性保留率高30%以上。在pH2.5的强酸条下,天然牛血s0D的活性保留率随着时问的延长显著下降,而PEG—soD于2h后的活 性保留率仍在70%以上,高出天然soD近40%。s0D经修饰后虽然在结构和理化性 质等方面稳定性提高。但温度、酸碱度和蛋白酶对PEG—soD的活性仍有影响,特别是胃蛋白酶和强酸可大大降低SoD的活性。将PEG—soD的冻干粉制成口服肠溶胶囊,可避免胃蛋白酶和胃酸的破坏,从而延缓s0D的释放。John Bullock等报道,PEG—s0D与天然soD相比,在耐热、耐酸碱和耐酶解方面都有明显提高。其中,耐碱性强于耐酸性,抗胰蛋白酶能力强于抗胃蛋白酶能力。主要原因是PEG作为一 种修饰剂与soD相连,在其外围形成保护膜,使稳定酶分子构象的次级链得以保护,所以增强了对热、酸、碱和酶的耐受性而使稳定性显著提高“”“… 3.PEG衍生物的合成和条件优化 3.1  mPEG—NHs的合成 3.1.1实验试剂和设备   (1)主要试剂     单甲氧基聚乙二醇(mPEG5000)、2,4,6一三硝基苯磺酸 (2,4,6一Trinitrobenzene sulfonic acid,TNBs)为sigma试剂;N一羟基琥珀酰亚胺(N—hydroxysnccinimide,NHS)为Aldrich试剂;十二烷基磺酸钠(sodiu【Il dodecyl sulfate,sDs)为德国默克公司进口分装;N,N一二甲基甲酸胺、丁二酸酐 (succinic anhydric,SA)、二环己基碳二亚胺(Dicylohexylcarbodiimide,DCCI)、甘氨酸(G1y)、乙醚均为国产分析纯试剂。   (2)实验设备   名称                          厂家                      用途 DYY一Ⅲ型电泳仪                    北京六一仪器厂                    蛋白质电泳 uV一9100型分光光度计                北京瑞利分析仪器公司                光吸收值测定 ALl04电子天平                    METTLER TOLED0            精确称量 超级恒温器                        上海市实验仪器厂                  恒温 50,200,1000u1可调式移液  热电(上海)仪器有限公                          精确吸取液体 器                            司 ZK-82B真空干燥箱                  上海市实验仪器总厂                  低压干燥 PHS一3c精密PH计                  上海雷磁仪器厂                    测量pH值 3.1.2实验方法     mPEG—NHS是一种广泛使用的PEG修饰剂,因其具有修饰条件温和,快速,修饰率较高等特点被应用于多种多肽蛋白质药物的修饰。活化后的IIlPEG分子连接有NHs基团能与蛋白质表面的游离氨基反应。其合成反应和修饰反应如下:郦嘲脚∞+mt出——唧酬』  0I               i            o                        l:。。.                                                                              ,_.≯i                                                  。厂]             .j:。。:ij.-≯_。|_.i                                                                                                                。i.i?ii.o久N公o m争j:E晦A菇;j羹i;i菇i蘸ji。照≯鞴萄交筠荽、                                                                                                                                                                                .(!一活化PEG的流程图如下:                 将mPEG—sA与N一羟基琥珀酰亚胺(N}Is)(摩尔比为             mPEG—sA:NI{s=1:2.25)置于3mL N,卜二甲基甲酰胺中加热                                         溶解         将反应物在40c下过滤,向滤液中滴加预冷的无水乙醚沉淀,将得到           白色的沉淀过滤收集,用无水乙醚洗涤4次后低温真空干燥,得到                                   白色固体mPEG—NHs 3.2 PEG—NI{s合成条件的优化}     PEG—NHs合成反应包括两个反应,分别是甲氧基聚乙二醇同丁二酸酐之间的酯化反应和N一羟基琥珀酰亚胺同mPEG—sA之间的脱水反应,可分别对两个反应进 行优化,使之得到更高产率和纯度的mPEG—NHS。 3.2.1酯化反应的优化 3.2.1.1催化剂种类的选择     目前,酯化反应使用最广泛的催化剂是无机酸,包括浓硫酸,磷酸和浓盐酸, 其中浓硫酸用的较多。浓硫酸虽然具有酸性强,催化效果好,性能稳定及价廉等 优点,但因其具有氧化性强,副反应多,腐蚀性强,污染环境等缺点越来越不为 人们所接受。而有机酸类催化剂近年来越来越多的应用于酯化反应,该类催化剂 反应条件温和,操作简便,少污染,酯化率高,产品质量好。故本试验选择吡啶 和对甲基苯磺酸作为催化剂同不加催化剂在相同条件下反应进行对比。     称取3.Og mPEG一5000[cH。o_(CH:cH。O)ncH。cH。一0H]和O.189丁二酸酐(succinic anhydric SA),加入3ml N,N一二甲基甲酸胺,分别加入 0.003759,0.0159,O.03759,O.0759的对甲基苯璜酸和2u 1,5u l,10p l,15 u l,20u 1在100℃反应3小时,然后将反应物冷却至4℃,滴加入预冷的无水乙醚,直至白色沉淀不再产生。所得的沉淀用乙醚洗涤4次,然后过滤,干燥,得到白色 固体mPEG—SA,称重并测定该白色固体的mPEG含量。然后将反应得到的固体mPEG—SA与N一羟基琥珀酰亚胺(N-hydroxysnccinimide,NHS)反应,操作步骤不变,最后将得到白色固体mPEG—NHS称重,并测量其中NHS含量。 3.2.1.2反应物最佳摩尔比的确定     按照醇酸摩尔比分别为l:l,1:5,1:8:1:10:l:15量进行酯化反应,称取3.Og mPEG一5000[cH。O一(cH。CH。O)nCHtCH:一OH];}口O.0369,0.18,0.2889,O.369,0.549丁二酸酐(succinic anhydric SA),加入3m1 N,N一二甲基甲酸胺在100℃反应3小时,得到干燥后的mPEG—sA,称重并通过分光光度法测定其mPEG含量。后面脱水反应步骤不变,得到干燥后的mPEG—NHS,称重并通过分光光度法测定其NHs含量。 3.2.1.3最佳反应时间的确定     羧酸跟醇在酸催化下生成酯,这是一个可逆反应,反应进行得较慢,反应时间过长反而会降低其产率,因此需要确定一个最佳反应时间。称取3.Og mPEG一5000[CH。O一(CH2cH。O)nCH。CH:一OH]和O.189丁二酸酐(succinic anhydric SA),加入3ml N,N一二甲基甲酸胺,分别在100℃反应1h,2h,3h,4h,5h,后面反应步骤不变,得到干燥后的mPEG—sA,称重并通过分光光度法测定其IIlPEG含量。第二步脱水反应步骤不变,得到干燥后的mPEG—NHs,称重并通过分光光度法测定其NHS含量。 3.2.2脱水反应的优化 3.2.2.1最佳反应时间的确定     分别称取1.59第一步反应得到的白色固体mPEG—sA与一定量的NHs,两者的摩尔比为mPEG—sA:NHS=l:2.25,将上述反应物置于3mlN,N一二甲基甲酰胺中,加入一定量的DCcI,两者的摩尔比为111PEG—SA:DCCI=l:2.25,然后将反应物置于30。c下水浴~定的时间,分别为5h,10h,15h,20h,25h,30h,反应完毕后将得到的mPEG州HS干燥后称重并测定NHS含量。 3.2.2.2最佳反应物摩尔比的确定     取1.59第一步反应得到的白色固体mPEG—SA同NHS以不同的摩尔比,其它反应条件不变的情况下,测定其产物JJ】PEG_NHS的质量,并用分光光度法测定NHS 含量。选择反应摩尔比IIlPEG—SA:丁二酸酐分别为:1:l:1:1.5:1:2:1:2.5:1:3:1:3.5。3.2.2.3最佳反应温度的确定将1_59第一步反应得到的白色固体mPEG—SA与一定量NHs,两者的摩尔比为 mPEG—sA:NHs=1:2.25,将上述反应物置于3ml N,N一二甲基甲酰胺中,加入一 定量的DCCI,两者的摩尔比为mPEG—sA:DCCI=1:2.25,然后将反应物置于不同的温度下搅拌过夜,最后得到mPEG—NHS低压干燥后测产率。选择反应温度分别为:lO。c,1 5。C。20。C,25。c.300C。 4.结果与讨论 1.皿PEG浓度测定标准曲线     绘制mPEG浓度标准曲线,操作步骤如表3.1所示:                   表3.1  mPEG标准曲线测定表                     Table3.1  nle Standard Curve of mPBG mPEG标准液(m1)            O        O.25      0.5      0.75    1.0 去离子水(m1)                4.O      3.75      3.5      3.25    3.0 5%BaCl2溶液(m1)          1.O      1.0      1.O        1.0    1.O 0.1M碘液(1111)            O.5      0.5      O.5      O.5      0.5 室温放置15IIlin后测量 A535                    O        O.159    0.321    O.452    0.604                         图3.1ⅢPEG标准曲线 3.3.2ⅫS浓度测定标准曲线 绘制NHs浓度标准曲线,操作步骤如表3.2所示:       表3.2NHs标准曲线表                                           T曲Ie3.2 The standardcurve ofNHS                     —、、~鎏管号                       溶液、\  1                                2          3        4          5          6                     NHs标准溶液(1111)                  O      O.1        0.2        Or3        0.4        0.5                           氨水(IIll)                3.O      2.9        2.8        2.7        2.6        2.5                                 A260                0    0.138      O.2“      O.375    0.474      O.583    6        5        ●      3    a口doO        2                                                                 图3.2删s摩尔浓度标准曲线       1                                                                 Fi93.2  The  staIldard curve of NHS       D                         NH8阜}镕娅帅M) 3.3.3酯化反应的优化 3.3.3.1反应时间的优化                                       表3.3反应时间对酯化反应产率的影响 1曲le33The effect of他ac60n廿me on the yieId ofthe幅teri6caitiOn reactiOn                 时间(h)            mPEG'SA质量(g)                    mPEG—SA中fIlPEG的质量含量                 l                  1.502l                          18.21%              2                  1.7288                          9.38%                 3                  1.8334                          5.73%                 4                  1.8048                          5.96%                 5                  1.802l                          8.29%                                                    0-6               图3.3随反应时同对mPEG—sA的产率的影响     由图可知,反应至3h基本完成,继续延长反应时间对转化率的提高影响不大,反而会增加副产物的积累和终产物消耗。因此,对该合成反应体系,反应时间以3小时为宣。                 表3.4不同催化剂对酯化反应结果的影响 Table3.4  The  effect of different catalyzers On the yield 0f山e e咖ri丘camoⅡ代actioⅡ                           催化剂为对甲基苯磺酸 l催化剂加入量                       mPEG-sA质量(g)            mPEG—SA中mPEG百分含量  (g)   0.003759                l_5125                        57.23%     O.0159                1.7780                        48.86%     O.03759                1.7128                        63.72%     O.0759                1.8100                        51.22%                                 催化剂为吡啶 催化剂加入量                                      mPEG.SA中mPEG质量百分含       (u 1)          nlPEG-sA质量(g)                        量       2                  1.4123                        8.21%    5                  1.7342                        6.34%       10                  1.6473                        6.33%       15                  1.602l                        9.83%       20                  1.321l                        11.54%   酯他反应楚一个W逆反应。为了褥商酯的产量,必须尽量馕反应向有秘予生 成酯的方向进行。          一般是馒魇应物酸和醇中的~神过艇。在工业生产中,究竟使哪种过量为好,一般视原料燕否易得、价格蹙否便宜以及是否容易回收等具体情况嚣定。本安验使援捡牾提jc雩较使寰豹反应物丁二酸酝过量,从面促使醋化茨应向产物方向进行,提高产率。因此本试验采敬醇酸摩尔比分别为l:2,1:5,l:8;l:10;l:15麴爰痤傣系,在爱疫薅闽必3h,不使爱摧像翔等其它条件不变的情况下进行反应。分别检测反应产物的含髓。如表3.3和图3.5显示,在其它反应条律裙同勰情况下,随醇酸篦的溅,l、,繇隧着丁二酸蓦手嗣瀵静增麓,辩p懿 的转化率随之增加,但当醇酸过小时,因反应体系酸酐过多,~定程度上降低了 催亿剂和原料的浓度。使转化率降低。醇酸眈的适宣眈值为l:lO。 参考文献 [1]肖新颜,夏正斌,张旭东,等.环境友好涂料的研究新进展.化工学报,2003,54(4):531—536 [2]王文军,岳彩艳,李红旭,等.水性聚氨酯胶粘剂的研制[J].中国胶粘剂, 2005, 14 (5): 10-13. 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[10]吉婉丽,龚燕燕,夏德慧,等.聚醚型水性聚氨酯胶黏剂的研究[J].化学与粘合, 2007, 29 (5): 332-335. 致谢 这次得到了很多老师、同学和同事的帮助,其中我的指导师卢培浩老师对我的关心和支持尤为重要,当我遇到难题,他总是耐心的给予帮助。 其次,感谢学校给予我这样一次机会,能够独立地完成一个课题,并在这个过程当中,给予我们各种方便,使我们在即将离校的最后一段时间里,能够更多学习一些实践应用知识,增强了我们实践操作和动手应用能力,提高了独立思考的能力。再一次对我的母校表示感谢。  我衷心的感谢在整个毕业设计期间和我密切合作的同学,和曾经在各个方面给予过我帮助的同事们,在这段日子里,我们共同演绎了团结合作的童话,把一个庞大的,从来没有上手的课题,圆满地完成了。正是因为有了你们的帮助,才让我不仅学到了本次课题所涉及的新知识,更让我感觉到了知识以外的东西,那就是团结的力量。  最后,再次感谢所有在这次毕业设计中给予过我帮助的人。                   
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