实验一 脯氨酸含量的测定

实验一 脯氨酸含量的测定 实验一 脯氨酸含量的测定 一、目的 了解脯氨酸与植物逆境、衰老的关系;掌握脯氨酸测定原理和常规测定方法。 二、原理 在正常环境条件下，植物体内游离脯氨酸含量较低，但在逆境(干旱、低温、高温、盐渍等)及植物衰老时，植物体内游离脯氨酸含量可增加10~100倍，并且游离脯氨酸积累量与逆境程度、植物的抗逆性有关。因此，测定植物体内游离脯氨酸的含量，在一定程度上可以判断逆境对植物的危害程度和植物对逆境的抵抗力。 在酸性条件下，脯氨酸与茚三酮反应生成稳定的红色缩合物，此缩合物在515nm处有最大吸收峰，可以用分光光度法测定。 三、实验材料，主要仪器和试剂 1(实验材料 植物组织。 2(主要仪器 (1)分光光度计 (2)水浴锅 (3)大试管(18mm×200mm) (4)具塞刻度试管(20mL) 3(试剂 (1)酸性茚三酮溶液:称取1.25g茚三酮溶于30mL冰乙酸和20mL 6M磷酸溶液中，搅拌加热(低于70?)溶解，冷却后置棕色瓶中，4?保存可使用2~3天。 (2)80%乙醇(分析纯)。 (3)脯氨酸标准溶液:称取10mg脯氨酸，用少量80%乙醇溶解，蒸馏水定容至100mL(100μg/mL)。再用蒸馏水释释成1.0、2.5、5.0、10.0、15.0、20.0μg/mL的系列溶液。 四、操作步骤 1(脯氨酸标准曲线制作 取7支具塞试管，分别加入各浓度的标准脯氨酸系列溶液2mL，冰乙酸2mL，茚三酮溶液2mL，混匀后沸水浴中加热20min，冷却后，以0号管为对照在515nm光波长下比色测定光密度。以光密度OD为纵坐标，脯氨酸含量为横坐标，绘制标准曲线。 515nm 管 号 标准脯氨酸(μg) 冰乙酸(mL) 茚三酮溶液(mL) OD 515nm 1 0 2 2 2 1 2 2 3 2.5 2 2 4 5.0 2 2 5 10 2 2 6 15 2 2 7 20 2 2 2(样品制定 (1)称取0.2~0.5g植物样品放入研砵中，用总量为10mL 80%的乙醇(少许)研磨成匀浆，将匀浆移入大试管并用剩余80%乙醇洗研砵，试管加盖，黑暗下浸提1h(样品为绿色叶片时，应加入少许活性炭)。 (2)过滤上述提取液，并加1g人造沸石振荡15min，室温下离心3 000r/min、5min。 (3)取上清液2mL，加入2mL冰乙酸，2mL茚三酮溶液于大试管中，充分混匀，沸水浴加热20min，冷却后515nm波长下测定光密度。从标准曲线上查出待测样品中脯氨酸含量(μg)。 五、结果计算 C×5 脯氨酸含量(μg / g)= W 式中: C——由标准曲线查得的待测样品脯氨酸含量(μg) W——植物样品重量(g) 5——提取脯氨酸时80%乙醇体积(10mL)与测定时所取样品液体积(2mL)比。 六、思考题 1(植物组织内游离脯氨酸测定有何意义, 2(脯氨酸提取除本实验方法外，还有何方法,测定时应作哪些改变, 参考 1(在正常环境条件下，植物体内游离脯氨酸含量较低，但在逆境(干旱、低温、高温、盐渍等)及植物衰老时，植物体内游离脯氨酸含量明显增加。测定植物体内游离脯氨酸的含量，可以判断逆境对植物的危害程度和植物对逆境的抵抗力。 2(脯氨酸提取除本实验方法外，还可以用磺基水杨酸处理样品，待酸性茚三酮反应之后，再用甲苯萃取，520nm比色。当脯氨酸提取试剂或萃取剂改变时，测定光密度的波长应当改变，具体采用多少波长，还应根据实验而定。 实验二 考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量 一、目的 学习和掌握考马斯亮蓝G-250测定蛋白质含量的原理和方法。 二、原理 50(Coomassie brilliant blue G-250)测定蛋白质含量属于染料结合法的考马斯亮蓝G-2 一种。考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm;当它与蛋白质结合 后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速;其结合物在室温下1h内保持稳定。该法是1976年Bradford建立，试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度比Lowry法还高4倍，可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为0,1 000μg,mL，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。 二、二、材料、主要仪器和试剂 1(实验材料 新鲜绿豆芽 2(主要仪器 (1)分析天平、台式天平 (2)刻度吸管 (3)具塞试管、试管架 (4)研钵 (5)离心机、离心管 (6)烧杯、量筒 (7)微量取样器 (8)分光光度计 3(试剂 1)牛血清白蛋白标准溶液的配制:准确称取100mg牛血清白蛋白，溶于100mL蒸( 馏水中，即为1 000μg,mL的原液。 (2)蛋白试剂考马斯亮蓝G-250的配制:称取100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50mL 90,乙醇中，加入85,(W,V)的磷酸100mL，最后用蒸馏水定容到1 000mL。此溶液在常温下可放置一个月。 (3)乙醇 (4)磷酸(85,) 四、操作步骤 1(标准曲线制作 (1)0~100μg,mL标准曲线的制作:取6支10mL干净的具塞试管，按1取样。盖塞后，将各试管中溶液纵向倒转混合，放置2min后用1cm光经的比色杯在595nm波长下比色，记录各管测定的光密度OD，并做标准曲线。 595nm 表1 低浓度标准曲线制作 管 号 1 2 3 4 5 6 1 000μg,mL标准蛋白液(mL) 0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 蒸馏水(mL) 1.00 0.98 0.96 0.94 0.92 0.90 考马斯亮蓝G-250试剂(mL) 5 5 5 5 5 5 蛋白质含量(μg) 0 20 40 60 80 100 OD 595nm (2)0~1 000μg,mL标准曲线的制作:另取6支10mL具塞试管，按表2取样。其余步骤同(1)操作，做出蛋白质浓度为0~1 000μg,mL的标准曲线。 表2 高浓度标准曲线制作 管 号 7 8 9 10 11 12 1 000μg,mL标准蛋白液(mL) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 蒸馏水(mL) 1.00 0.8 0.6 0.4 0.2 0 考马斯亮蓝G-250试剂(mL) 5 5 5 5 5 5 蛋白质含量(μg) 0 200 400 600 800 1 000 OD 595nm 2(样品提取液中蛋白质浓度的测定 (1)待测样品制备:称取新鲜绿豆芽下胚轴2g放入研钵中，加2mL蒸馏水研磨成匀浆，转移到离心管中，再用6mL蒸馏水分次洗涤研钵，洗涤液收集于同一离心管中，放置0.5~1h以充分提取，然后在4 000r/min离心20min，弃去沉淀，上清液转入10mL容量瓶，并以蒸馏水定容至刻度，即得待测样品提取液。 (2)测定:另取2支10mL具塞试管，按下表取样。吸取提取液0.1mL(做一重复)，放入具塞刻度试管中，加入5mL考马斯亮蓝G-250蛋白试剂，充分混合，放置2min后用1cm光径比色杯在595nm下比色，记录光密度OD，并通过标准曲线查得待测样品提取595nm 液中蛋白质的含量X(μg)。以标准曲线1号试管做空白。 表3 待测液蛋白质浓度测定 管 号 13 14 蛋白质待测样品提取液(mL) 0.1 0.1 0.9 0.9 蒸馏水(mL) 5 5 考马斯亮蓝G-250试剂(mL) OD595nm 蛋白质含量(μg) 五、结果计算 提取液总体积(mL) X× 测定时取样体积(mL) 样品蛋白质含量(μg / g鲜重)= 样品鲜重(g) 式中:X为在标准曲线上查得的蛋白质含量(μg)。 六、附 注 1(Bradford法由于染色方法简单迅速，干扰物质少，灵敏度高，现已广泛应用于蛋白质含量的测定。 ++2+2(有些阳离子，如K、Na、Mg、(NH)SO、乙醇等物质不干扰测定，但大量的去424 污剂如TritonX-100、SDS等严重干扰测定。 3(蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合的反应十分迅速，在2min左右反应达到平衡;其 结合物在室温下1h内保持稳定。因此测定时，不可放置太长时间，否则将使测定结果偏低。 七、思考题 1(制作标准曲线及测定样品时，为什么要将各试管中溶液纵向倒转混合, 参考答案 1(将各试管中溶液纵向倒转混合目的是使反应充分，并且使整个反应液均一，否则在比色测定时，结果会有较大偏差，使标准曲线的制作不标准，后续的测定结果就不可靠。 实验三 茚三酮显色法测定氨基酸含量 一、一、目的 学习茚三酮显色法测定氨基酸含量的方法 二、二、原理 OO CCCOOHHOHOCONH2+RC3++CCHCNH+2HOHOHCCR OO醛 类还原型茚三酮氨基酸茚三酮 OOOO CCCCHOHHO2+ 3CHNCCNH3++CHOCOHCCC OOOO 蓝紫色产物 茚三酮溶液与氨基酸共热，生成氨。氨与茚三酮和还原性茚三酮反应，生成紫色化合物。该化合物颜色的深浅与氨基酸的含量成正比，可通过测定570nm处的光密度，测定氨基酸的含量。 三、 试剂与材料 (1)标准氨基酸溶液:配制成0.3mmol/L溶液。 (2)pH5.4，2mol/L醋酸缓冲液:量取86mL 2mol/L醋酸钠溶液，加入14mL 2mol/L乙酸混合而成。用pH检查校正。 (3)茚三酮显色液:称取85mg茚三酮和15mg还原茚三酮，用10mL乙二醇甲醚溶解。 茚三酮若变为微红色，则需按下法重结晶:称取5g茚三酮溶于15,25mL热蒸馏水中，加入0.25g活性炭，轻轻搅拌。加热30min后趁热过滤，滤液放入冰箱过夜。次日析出黄白色结晶，抽滤，用1mL冷水洗涤结晶，置干燥器干燥后，装入棕色玻璃瓶保存。 还原型茚三酮按下法制备:称取5g茚三酮，用125mL沸蒸馏水溶解，得黄色溶液。将5g维生素C用250mL温蒸馏水溶解，一边搅拌一边将维生素C溶液滴加到茚三酮溶液中， 不断出现沉淀。滴定后继续搅拌15min，然后在冰箱内冷却到4?，过滤、沉淀用冷水洗涤3次，置五氧化二磷真空干燥器中干燥保存，备用。 乙二醇甲醚若放置太久，需用下法除去过氧化物:在500mL乙二醇甲醚中加入5g硫酸亚铁，振荡1,2h，过滤除去硫酸亚铁，再经蒸馏，收集沸点为121,125?的馏分，为无色透明的乙二醇甲醚。 (4)60,乙醇。 (5)样品液:每毫升含0.5,50μg氨基酸。 (6)分光光度计。 (7)水浴锅。 四、操作步骤 1(标准曲线的制作 分别取0.3mmol/L的标准氨基酸溶液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mL于试管中，用水补足至1mL。各加入1mL pH5.4，2mol/L醋酸缓冲液;再加入1mL茚三酮显色液，充分混匀后，盖住试管口，在100?水浴中加热15min，用自来水冷却。放置5min后，加入3mL 60,乙醇稀释，充分摇匀，用分光光度计测定OD。(脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应呈黄色，570nm 应测定OD)。 440nm 以OD为纵坐标，氨基酸含量为横坐标，绘制标准曲线。 570nm 2(氨基酸样品的测定 取样品液1mL，加入pH5.4，2mol/L醋酸缓冲液1mL和茚三酮显色液1mL，混匀后于100?沸水浴中加热15min，自来水冷却。放置5min后，加3mL 60,乙醇稀释，摇匀后测定OD(生成的颜色在60min内稳定)。 570nm 将样品测定的OD与标准曲线对照，可确定样品中氨基酸含量。 570nm 五、五、 结果计算 OD对应标准曲线查得值 570nm氨基酸含量(mmol/L)= 1 000 六、思考题 1(茚三酮是否可用于氨基酸和蛋白质的定性鉴定, 参考答案 1(可以。蛋白质、多肽和各种氨基酸具有茚三酮反应。除α-氨基酸中的脯氨酸和羟脯氨酸呈黄色外，其它氨基酸生成紫红色，最终为蓝色化合物。因此在层析法可以用茚三酮对氨基酸进行定性鉴定。 实验四 紫外吸收法测定蛋白质含量 一、目的 学习紫外分光光度法测定蛋白质含量的原理;熟练掌握紫外分光光度计测定原理及使用方法。 二、原理 由于蛋白质中存在着含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸，因此蛋白质具有吸收紫外光的性 质，最大吸收峰在280nm波长处。在此波长范围内，蛋白质溶液的光密度OD与其280nm 浓度呈正比关系，可作定量测定。 三、实验材料、主要仪器和试剂 1(试验材料:待测的蛋白质溶液。 ( 2( 主要仪器 2 (1)紫外分光光度计，(2)试管与试管架，(3)刻度吸量管 3(试剂 (1)标准牛血清蛋白溶液:准确称取经凯氏定氮法校正的结晶牛血清蛋白，配制成浓度为1mg/mL的溶液。 (2)待测蛋白质溶液:浓度为1mg/mL左右的溶液。 四、操作步骤 1(标准曲线制作 按表1分别向每支试管内加入各种试剂，混匀。以光程为1cm的石英比色杯，在280nm波长处测定各管溶液的光密度值OD。以蛋白质浓度为横坐标，光密度值为纵坐标，绘280nm 出标准曲线。 表1 蛋白质标准曲线制作 管号 标准蛋白质溶液(mL) 蒸馏水(mL) 蛋白质浓度(mg/mL) OD 280nm 1 0 4 0 2 0.5 3.5 0.125 3 1.0 3.0 0.25 4 1.5 2.5 0.375 5 2.0 2.0 0.50 6 2.5 1.5 0.625 7 3.0 1.0 0.75 8 4.0 0 1.0 2(样品测定 取待测蛋白质溶液1mL，加入蒸馏水3mL，混匀，按上述方法测定280nm的光密度，并从标准工作曲线上查出待测蛋白质溶液的浓度。 五、附注 1(在测定工作中，可以利用280nm及260 nm的光密度值求出蛋白质的浓度: 蛋白质浓度(mg/mL)=1.45OD―0.74OD 280nm260nm 式中的OD是蛋白质溶液在280nm下测得的光密度，OD是蛋白质溶液在260nm下280nm260nm 测得的光密度。 2(对于有核酸存在时所造成的误差，可将待测的蛋白质溶液稀释至光密度在0.2~2.0之间，选用光程为1cm的石英比色杯，在280nm及260nm处分别测出光密度OD /OD280nm260nm的比值，从表2中查出校正因子“F”值，同时可查出该样品内混杂的核酸的百分含量，将F值代入下述公式，即可计算出该溶液的蛋白质浓度。 蛋白质浓度(mg/mL)= F×OD×D 280nm 式中:OD为被测溶液在280nm紫外波长下的光密度，D为溶液的稀释倍数。 280nm 表2 紫外吸收法测定蛋白质含量的校正因子 OD /OD 校正因子 核酸% OD /OD 校正因子 核酸% 280nm260nm280nm260nm 1.75 1.116 0.00 0.846 0.656 5.50 1.63 1.081 0.25 0.822 0.632 6.00 1.52 1.054 0.50 0.804 0.607 6.50 1.40 1.023 0.75 0.784 0.585 7.00 1.36 0.994 1.00 0.767 0.565 7.5 1.30 0.970 1.25 0.753 0.545 8.00 1.25 0.944 1.50 0.730 0.508 9.00 1.16 0.899 2.00 0.705 0.478 10.00 1.09 0.852 2.50 0.671 0.422 12.00 1.03 0.814 3.00 0.644 0.377 14.00 0.979 0.776 3.50 0.615 0.322 17.00 0.939 0.743 4.00 0.595 0.278 20.00 0.874 0.682 5.00 注:通常纯蛋白质的OD /OD 约为1.8，而纯核酸的比值约为0.5。 280nm260nm 六、思考题 1(紫外吸收法与Folin-酚比色法测定蛋白质含量相比，有何缺点及优点, 2(若样品中含有核酸类杂质，应如何校正, 参考答案 1(蛋白质测定的Folin-酚比色法(即Lowry法)的定量范围为5,100μg蛋白质，灵敏度高;但操作要费较长时间，且Folin试剂显色反应由酪氨酸、色氨酸和半胱氨氨酸引起，因此样品中若含有酚类、柠檬酸和巯基化合物均有干扰作用;不同蛋白质因酪氨酸、色氨酸含量不同而使显色强度也稍有不同。 紫外吸收法测蛋白质含量迅速、简便、不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定。因此，已在蛋白质和酶的生化制备中广泛采用，尤其在柱层析分离纯化中，常用280nm进行紫外检测，来判断蛋白质吸附或洗脱情况。但该法的缺点是:(1)对于测定那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异较大的蛋白质，有一定的误差。故该法适于测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。(2)若样品中含有嘌呤、嘧啶等吸收紫外光的物质，会出现较大干扰。例如，在制备酶的过程中，层析柱的流出液中有时混杂有核酸，应予以校正。 2(当样品中含有核酸类杂质，可以根据核酸在260nm波长处有最强的紫外光吸收，而蛋白质在280nm处有最大的紫外光吸收的性质，通过计算可以适当校正核酸对于测定蛋白质浓度的干扰作用。详细内容见附注。但是，因为不同的蛋白质和核酸的紫外吸收是不相同的，虽然经过校正，测定结果还存在着一定的误差。 实验五 还原糖和总糖的测定——3,5-二硝基水杨酸比色法 一、目的 掌握还原糖和总糖测定的基本原理，学习比色法测定还原糖的操作方法和分光光度计的使用。 二、原理 还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。还原糖是指含有自由醛基或酮基的糖类，单糖都是还原糖，双糖和多糖不一定是还原糖，其中乳糖和麦芽糖是还原糖，蔗糖和淀粉是非还原糖。利用糖的溶解度不同，可将植物样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来，对没有还原性的双糖和多糖，可用酸水解法使其降解成有还原性的单糖进行测定，再分别求出样品中还原糖和总糖的含量(还原糖以葡萄糖含量计)。 还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物，3,5-二硝基水杨酸则被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系，利用分光光度计，在540nm波长下测定光密度值，查对标准曲线并计算，便可求出样品中还原糖和总糖的含量。由于多糖水解为单糖时，每断裂一个糖苷键需加入一分子水，所以在计算多糖含量时应乘以0.9。 COOHCOOH OHOH加 热 +糖 酸+还原糖碱 性 ONNH22ONNO22 3-氨基-5-硝基水杨酸(棕红色)3,5-二硝基水杨酸(黄色) 三、实验材料、主要仪器和试剂 1( 实验材料 小麦面粉;精密pH试纸。 2( 主要仪器 (1)具塞玻璃刻度试管:20mL×11 (2)大离心管:50mL×2 (3)烧杯:100mL×1 (4)三角瓶:100mL×1 (5)容量瓶:100mL×3 (6)刻度吸管:1mL×1;2mL×2;10mL×1 (7)恒温水浴锅 (8)沸水浴 (9)离心机 (10)扭力天平 (11)分光光度计 3( 试剂 (1)1mg/mL葡萄糖标准液 准确称取80?烘至恒重的分析纯葡萄糖100mg，置于小烧杯中，加少量蒸馏水溶解后，转移到100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至100mL，混匀，4?冰箱中保存备用。 (2)3,5-二硝基水杨酸(DNS)试剂 将6.3g DNS和262mL 2M NaOH溶液，加到500mL含有185g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5g结晶酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加蒸馏水定容至1000mL，贮于棕色 瓶中备用。 (3)碘-碘化钾溶液:称取5g碘和10g碘化钾，溶于100mL蒸馏水中。 (4)酚酞指示剂:称取0.1g酚酞，溶于250mL 70%乙醇中。 (5)6M HCl和6M NaOH各100mL。 四、操作步骤 1( 制作葡萄糖标准曲线 取7支20mL具塞刻度试管编号，按表1分别加入浓度为1mg/mL的葡萄糖标准液、蒸馏水和3,5-二硝基水杨酸(DNS)试剂，配成不同葡萄糖含量的反应液。 表1 葡萄糖标准曲线制作 1mg/mL葡萄糖标准液 蒸馏水 DNS 葡萄糖含量 光密度值 管 号 (mL) (mL) (mL) (mg) (OD) 540nm 0 0 2 1.5 0 1 0.2 1.8 1.5 0.2 2 0.4 1.6 1.5 0.4 3 0.6 1.4 1.5 0.6 4 0.8 1.2 1.5 0.8 5 1.0 1.0 1.5 1.0 6 1.2 0.8 1.5 1.2 将各管摇匀，在沸水浴中准确加热5min，取出，冷却至室温，用蒸馏水定容至20mL，加塞后颠倒混匀，在分光光度计上进行比色。调波长540nm，用0号管调零点，测出1~6号管的光密度值。以光密度值为纵坐标，葡萄糖含量(mg)为横坐标，在坐标纸上绘出标准曲线。 2( 样品中还原糖和总糖的测定 (1)还原糖的提取 准确称取3.00g食用面粉，放入100mL烧杯中，先用少量蒸馏水调成糊状，然后加入50mL蒸馏水，搅匀，置于50?恒温水浴中保温20min，使还原糖浸出。将浸出液(含沉淀)转移到50mL离心管中，于4 000r/min下离心5min，沉淀可用20mL蒸馏水洗一次，再离心，将二次离心的上清液收集在100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，混匀，作为还原糖待测液。 (2)总糖的水解和提取 准确称取1.00g食用面粉，放入100mL三角瓶中，加15mL蒸馏水及10mL 6M HCl，置沸水浴中加热水解30min(水解是否完全可用碘-碘化钾溶液检查)。待三角瓶中的水解液冷却后，加入1滴酚酞指示剂，用6mol/LNaOH中和至微红色，用蒸馏水定容在100mL容量瓶中，混匀。将定容后的水解液过滤，取滤液10mL，移入另一100mL容量瓶中定容，混匀，作为总糖待测液。 (3)显色和比色 取4支20mL具塞刻度试管，编号，按表2所示分别加入待测液和显色剂，空白调零可使用制作标准曲线的0号管。加热、定容和比色等其余操作与制作标准曲线相同。 表2 样品还原糖测定 还原糖待测液 总糖待测液 蒸馏水 DNS 光密度值 查曲线葡萄糖量 管 号 (mL) (mL) (mL) (mL) (OD) (mg) 540nm 7 0.5 1.5 1.5 8 0.5 1.5 1.5 9 1 1 1.5 10 1 1 1.5 五、结果与计算: 计算出7、8号管光密度值的平均值和9、10管光密度值的平均值，在标准曲线上分别查出相应的还原糖毫克数，按下式计算出样品中还原糖和总糖的百分含量。 提取液总体积 查曲线所得葡萄糖毫克数× 测定时取用体积 还原糖(%)= ×100 样品毫克数 六查曲线所得水解后还原糖毫克数×稀释倍数 总糖(%)= ×0.9×100 、附 样品毫克数 注 1( 离心时对称位置的离心管必须配平。 2( 标准曲线制作与样品测定应同时进行显色，并使用同一空白调零点和比色。 3( 面粉中还原糖含量较少，计算总糖时可将其合并入多糖一起考虑。 七、思考题 1(3,5-二硝基水杨酸比色法是如何对总糖进行测定的? 2(如何正确绘制和使用标准曲线? 参考答案 1(植物中的总糖包括单糖、寡糖和多糖，单糖是还原糖，可直接测定。而没有还原性的寡糖和多糖，需用高浓度的酸在加热的条件下水解成有还原性的单糖，还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物，3,5-二硝基水杨酸则被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成一定比例关系，利用分光光度计，在540nm波长下测定光密度值，查对标准曲线并计算，可求出样品中还原糖和总糖的含量。由于多糖水解为单糖时，每断裂一个糖苷键需要加入一分子水，所以在计算多糖含量时应乘以0.9。 2(标准曲线应在坐标纸上绘制，横坐标轴距坐标纸底边1.5~2cm，标示出刻度和葡萄糖的毫克数;纵坐标轴距坐标纸左边1.5~2cm，标示刻度和光密度值;曲线为过原点的直线，测定点均匀分布在直线的两侧;标准曲线只能在测试条件完全相同的情况下，用于确定样品中的物质含量。对于重复的测定，应取吸光度的平均值查标准曲线;测定数据不应记在标准曲线上。 实验六 还原糖含量测定——砷钼酸比色法 一、目的 植物体内的还原糖主要是葡萄糖、果糖和麦芽糖。它们在植物体内的分布，不仅反映植物体内碳水化合物的运转情况，而且也是合成其它成分碳架来源和呼吸作用的基质。此外，水果、蔬菜中含糖量的多少，也是鉴定其品质的重要指标。其它碳水化合物，如淀粉、蔗糖 等，经水解也生成还原糖。因此，测定还原糖的方法在研究植物体内生理生化变化和测定植物体内碳水化合物方面都是很重要的。 二，原理; 还原糖是具有羰基(>C=O)的糖，能将其它物质还原而其本身被氧化。 (1) (1) 还原糖在碱性条件及有酒石酸钾钠存在下加热，可以定量地还原二价铜离子为一价铜离子，产生砖红色的氧化亚铜沉淀，其本身被氧化。具体反应如下: CuSO + 2NaOHNa(SO) + Cu(OH)4242 HO―CH―COONa O―CH―COONa Cu(OH)+ ? u ? + 2HO 2 2HO―CH―COOK O―CH―COOK CHO H―C―OH ? O―CH―COONa HO―C―H Cu ? + ? + 2HO 2O―CH―COOK H―C―OH ? H―C―OH ? CHOH 2 COOH ? HO―CH―COONa (CHOH) + 2 ? + CuO? 42 ? HO―CH―COOK CHOH 2 (2)氧化亚铜在酸性条件下，可将钼酸铵还原，还原型的钼酸铵再与砷酸氢二钠起作用，生成一种蓝色复合物——砷钼蓝，其颜色深浅在一定范围内与还原糖的含量(即被还原的CuO量)成正比，用标准葡萄糖与砷钼酸作用，比色后做标准，就可测得样品还原糖含量。 2+ CuO + HSOCu 224+2+2-2- 2Cu + MoO + SO2Cu + 蓝色复合物 44 三、实验材料、主要仪器和试剂 1(实验材料 苹果、面粉等 2(主要仪器 (1)分光光度计 (2)水浴锅 (3)具塞刻度试管:20mL×10 (4)刻度吸管:1 mL×1，2 mL×4，5 mL×3 (5)容量瓶:100 mL×2 (6)漏斗 (7)研钵 3(试剂 (1)铜试剂: A、4,CuSO•5HO 42 B、称取24g无水碳酸钠，用850mL水溶于大烧杯中，加入2g含4分子结晶水的酒石酸钾钠，待全溶(应加热)后加入碳酸氢钠16g，再加入120g无水硫酸钠(加热)，全溶及冷却后加水至900mL，沉淀1,2d，取上清液(要求严格时过滤)备用。 使用前将A与B按1?9混匀即可使用。 (2)砷钼酸试剂:25g钼酸铵 ( NH)MoO?4HO溶于450mL蒸馏水中(加热溶467242 解，但温度接近150?时易分解)，待冷却后再加入21mL浓HSO混匀。另将3g砷酸氢二24 钠(NaHasO?7HO)溶解于25mL蒸馏水中，然后加到钼酸铵溶液中，室温下放置于棕色242 瓶中可长期使用。 (3)200μg,mL标准葡萄糖原液:准确称取分析纯葡萄糖200mg，溶解定容到1000mL。 四、操作步骤 1(标准曲线的制作: 在一系列刻度试管中，分别加入200μg,mL标准葡萄糖0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5及0.6 mL，再顺序加入蒸馏水2、1.9、1.8、1.7、1.6、1.5及1.4 mL，配成浓度分别为0、10、20、30、40、50及60μg/mL的系列葡萄糖溶液。每试管加入铜试剂2mL，混匀后沸水浴中加热10min，立即冷却，再加入2mL砷钼酸试剂，振荡两分钟后稀释到20mL，用分光光度计在620nm波长下比色，测其光密度OD(做一式两份)。 620nm 以糖浓度微克数为横坐标，光密度OD为纵坐标，绘制标准曲线。 620nm 2(植物样品中还原糖的提取: 将样品洗净，吸干其表面水分，切碎混匀，称取1g放入研钵中，加入约0.5g石英砂，磨成匀浆，加水将样品由玻璃漏斗冲入100mL容量瓶中，加水达70,80mL，摇匀后置于80?恒温水浴上浸提0.5h。 待上述样品冷却后，沉淀蛋白质，加入5,硫酸锌5mL，再慢慢滴入0.3mol/L Ba(OH)2 5mL，以沉淀蛋白质。振荡后静置，至上层出现清液后再加一滴Ba(OH)，直至无白色沉淀2时，向容量瓶加水至刻度。 3(还原糖含量的测定: 过滤上述已定容的样品液，取5mL滤液，再定容到100mL(此步视样品的含糖量而定)。取已稀释的溶液2mL，与标准葡萄糖显色法相同:加铜试剂2mL，煮沸10min，加砷钼酸试剂2mL，振荡2mL，定容到15ml，620nm波长下比色，记下光密度OD(至少重复620nm两次)。 五，结果计算 G×稀释液倍数 还原糖含量(,)= 6W×10 式中:G——从标准曲线上查得含糖量(μg) W——样品重(g) 六、思考题 举例说明哪些是还原糖, 参考答案: 还原糖是指含有自由醛基或酮基的糖类，单糖都是还原糖，双糖和多糖不一定是还原糖，其中果糖、乳糖和麦芽糖是还原糖，蔗糖、淀粉和纤维素等是非还原糖。 实验七 淀粉酶活力的测定 一、目的 学习和掌握测定淀粉酶(包括α-淀粉酶和β-淀粉酶)活力的原理和方法。 二、原理 淀粉是植物最主要的贮藏多糖，也是人和动物的重要食物和发酵工业的基本原料。淀粉 经淀粉酶作用后生成葡萄糖、麦芽糖等小分子物质而被机体利用。淀粉酶主要包括α-淀粉酶和β-淀粉酶两种。α-淀粉酶可随机地作用于淀粉中的α-1,4-糖苷键，生成葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、糊精等还原糖，同时使淀粉的粘度降低，因此又称为液化酶。β-淀粉酶可从淀粉的非还原性末端进行水解，每次水解下一分子麦芽糖，又被称为糖化酶。淀粉酶催化产生的这些还原糖能使3,5-二硝基水杨酸还原，生成棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸，其反应如下: COOHCOOH OHOH加 热 +糖 酸+还原糖碱 性 ON2NH2ON2NO2 3-氨基-5-硝基水杨酸(棕红色)3,5-二硝基水杨酸(黄色) 淀粉酶活力的大小与产生的还原糖的量成正比。用标准浓度的麦芽糖溶液制作标准曲线，用比色法测定淀粉 酶作用于淀粉后生成的还原糖的量，以单位重量样品在一定时间内生成的麦芽糖的量表示酶活力。 淀粉酶存在于几乎所有植物中，特别是萌发后的禾谷类种子，淀粉酶活力最强，其中主要是α-淀粉酶和β-淀粉酶。两种淀粉酶特性不同，α-淀粉酶不耐酸，在pH3.6以下迅速钝化。β-淀粉酶不耐热，在70?15min钝化。根据它们的这种特性，在测定活力时钝化其中之一，就可测出另一种淀粉酶的活力。本实验采用加热的方法钝化β-淀粉酶，测出α-淀粉酶的活力。在非钝化条件下测定淀粉酶总活力(α-淀粉酶活力+β-淀粉酶活力)，再减去α-淀粉酶的活力，就可求出β-淀粉酶的活力。 三、实验材料、主要仪器和试剂 (实验材料 1 萌发的小麦种子(芽长约1cm) 2(仪器 (1)离心机 (2)离心管 (3)研钵 (4)电炉 (5)容量瓶:50mL×1, 100mL×1 (6)恒温水浴 (7)20mL具塞刻度试管×13 (8)试管架 (9)刻度吸管:2mL×3, 1mL×2, 10mL×1 (10)分光光度计 3(试剂(均为分析纯) (1)标准麦芽糖溶液(1mg/mL):精确称取100mg麦芽糖，用蒸馏水溶解并定容至100mL。 (2)3,5-二硝基水杨酸试剂:精确称取3,5-二硝基水杨酸1g，溶于20mL 2mol/L NaOH溶液中，加入50mL蒸馏水，再加入30g酒石酸钾钠，待溶解后用蒸馏水定容至100mL。盖 紧瓶塞，勿使CO进入。若溶液混浊可过滤后使用。 2 (3)0.1mol/L pH5.6的柠檬酸缓冲液 A液:(0.1mol/L 柠檬酸):称取CHO?HO 21.01g，用蒸馏水溶解并定容至1L。 6872 B液:(0.1mol/L柠檬酸钠):称取NaCHO?2HO 29.41g，用蒸馏水溶解并定容至36572 1L。 取A液55mL与B液145mL混匀，既为0.1mol/LpH5.6的柠檬酸缓冲液。 (4)1%淀粉溶液:称取1g淀粉溶于100mL 0.1mol/L pH5.6的柠檬酸缓冲液中。 四、操作步骤 1(麦芽糖标准曲线的制作 取7支干净的具塞刻度试管，编号，按表1加入试剂: 表1 麦芽糖标准曲线制作 管 号 试 剂 1 2 3 4 5 6 7 麦芽糖标准液(mL) 0 0.2 0.6 1.0 1.4 1.8 2.0 蒸馏水(mL) 2.0 1.8 1.4 1.0 0.6 0.2 0 麦芽糖含量(mg) 0 0.2 0.6 1.0 1.4 1.8 2.0 3,5-二硝基水杨酸(mL) 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 摇匀，置沸水浴中煮沸5min。取出后流水冷却，加蒸馏水定容至20mL。以1号管作为空白调零点，在540nm波长下比色测定光密度。以麦芽糖含量为横坐标，光密度为纵坐标，绘制标准曲线。 2(淀粉酶液的制备 称取1g萌发3天的小麦种子(芽长约1cm)，置于研钵中，加入少量石英砂和2mL蒸馏水，研磨匀浆。将匀浆倒入离心管中，用6mL蒸馏水分次将残渣洗入离心管。提取液在室温下放置提取15,20min，每隔数分钟搅动1次，使其充分提取。然后在3 000r/min转速下离心10min，将上清液倒入100mL容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，摇匀，即为淀粉酶原液，用于α-淀粉酶活力测定。 吸取上述淀粉酶原液10mL，放入50mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，即为淀粉酶稀释液，用于淀粉酶总活力的测定。 3( 酶活力的测定:取6支干净的试管，编号，按表2进行操作。 表2 酶活力测定取样表 操 作 项 目 α-淀粉酶活力测定 β-淀粉酶活力测定 ?- 1 ?- 2 ?- 3 ?- 4 ?- 5 ?- 6 淀粉酶原液(mL) 1.0 1.0 1.0 0 0 0 钝化β-淀粉酶 置70?水浴15min，冷却 淀粉酶稀释液(mL) 0 0 0 1.0 1.0 1.0 3,5-二硝基水杨酸(mL) 2.0 0 0 2.0 0. 0 预保温 将各试管和淀粉溶液置于40?恒温水浴中保温10min 1%淀粉溶液(mL) 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 保温 在40?恒温水浴中准确保温5min 3,5-二硝基水杨酸(mL) 0 2.0 2.0 0 2.0 2.0 将各试管摇匀，显色后进行比色测定光密度，记录测定结果，操作同标准曲线。 五、结果计算 计算?- 2、?- 3光密度平均值与?- 1光密度之差，在标准曲线上查出相应的麦芽糖含量(mg)，按下列公式计算α- 淀粉酶的活力。 ,淀粉酶活力[麦芽糖毫克数/样品鲜重(g),5分钟], 麦芽糖含量(mg)，淀粉酶原液总体积(mL),样品重(g) 计算?- 2、?- 3光密度平均值与?- 1光密度之差，在标准曲线上查出相应的麦芽糖含量(mg)，按下式计算(α，β)淀粉酶总活力。 (α，β)淀粉酶总活力[麦芽糖毫克数/样品鲜重(g),5分钟] 麦芽糖含量(mg)，淀粉原液总体积(mL)，稀释倍数,样品重(g) β-淀粉酶活力,(α，β)淀粉酶总活力,α-淀粉酶活力 六、附 注 (1)样品提取液的定容体积和酶液稀释倍数可根据不同材料酶活性的大小而定。 (2)为了确保酶促反应时间的准确性，在进行保温这一步骤时，可以将各试管每隔一定时间依次放入恒温水浴，准确记录时间，到达5min时取出试管，立即加入3,5-二硝基水杨酸以终止酶反应，以便尽量减小因各试管保温时间不同而引起的误差。同时恒温水浴温度变化应不超过?0.5?。 (3)如果条件允许，各实验小组可采用不同材料，例如萌发1d、2d、3d、4d的小麦种子，比较测定结果，以了解萌发过程中这两种淀粉酶活性的变化。 七、思考题 1(为什么要将?- 1、?- 2、?- 3号试管中的淀粉酶原液置70?水浴中保温15min, 2(为什么要将各试管中的淀粉酶原液和1%淀粉溶液分别置于40?水浴中保温, 参考答案 1(由于β-淀粉酶不耐热，70?15min被钝化，所以将此3个试管中的溶液在70?保温15min使其钝化，从而测得的淀粉酶活性即为α-淀粉酶活性。 2(酶反应需要适当的温度，只有在一定的温度条件下才表现出最大活性，40?是淀粉酶的最适温度，所以应将酶液和底物(淀粉液)先分别保温至最适温度，然后再进行酶反应，这样才能使测得的数据更加准确。 实验八 硝酸还原酶活性的测定 一、目的 硝酸还原酶(EC.1.6.6.1，缩写NR)是硝酸盐同化中第一个酶，也是限速酶，处于植物氮代谢的关键位置。它与植物吸收利用氮肥有关，对农作物产量和品质有重要影响，因而硝酸还原酶活性被当作植物营养或农田施肥的指标之一，也可作为品种选育的指标之一。通过本实验可以初步掌握测定硝酸还原酶活性的原理和方法。 二、原理 ,,32硝酸还原酶可将NO还原成NO，其反应为: ,,NR++,,,32 NO+ NADH + H NO+ NAD + HO 2 ,,22在一定条件下，NO的生成量与硝酸还原酶活性呈正相关。NO含量可用磺胺显色法测定，即在酸性条件下与对-氨基苯磺酰胺发生重氮反应，生成的重氮化合物又与N-萘基乙二胺盐酸盐(或α-萘胺)生成红色偶氮化合物，可在540nm下比色测定。反应如下: NHNClN2 --+NOCl22+H2HO+++2 SONH22SONH22 NClN NN HCl++ RSONH22CHNHHClCHR'HN222 HCl红色偶氮化合物 硝酸还原酶活性一般采用活体法或离体法测定。离体法需将材料磨成匀浆，经过滤或离心除去残渣，以上清液为硝酸还原酶粗酶液进行测定。由于研磨中NADH受损失，必需外,3加NADH方可测定。活体法直接用鲜活组织进行测定。环境中的NO进入细胞后，被硝酸,,22还原酶还原成NO并扩散到细胞外在溶液中积累，测定溶液中NO的含量即可得知硝酸还原酶活性的大小。活体法不破坏细胞原有的酶反应系统，NADH可由代谢反应不断生成，无需外加。活体法简便、快速，不需要贵重仪器设备及低温条件，但重复性欠佳，应作一定量的重复。本实验采用活体法测定硝酸还原酶活性。 三、实验材料、仪器和试剂 1(材料 材料可选用小麦、玉米、白菜、油菜、烟叶等作物的叶片 2(仪器 (1)天平 (2)真空泵和真空干燥器 (3)离心机 (4)20mL刻度试管×7 (5)50mL三角瓶×3 (6)恒温水浴 (7)恒温箱 (8)分光光度计 (9)移液管:5mL × 2;2mL × 5;1mL × 1 3(试剂 (1)亚硝酸钠标准液:精确称取亚硝酸钠0.1000g，用水溶解后定容至100mL，吸取此液5mL，用水稀释定容至1 000mL，即为5μg/mL的亚硝酸钠标准液。 (2)0.1mol/L pH7.5磷酸缓冲液: A液(0.2mol/L NaHPO):称取35.61g NaHPO?2HO(A.R)，用蒸馏水溶解并定容24242 至1 000mL。 B液(0.2mol/L NaHPO):称取NaHPO?HO(A.R)27.6g，用蒸馏水溶解并定容至24242 1 000mL。 取A液84.0mL和B液16.0mL，混匀，加蒸馏水100mL。必要时用酸度计测定其pH，并用HCl或NaOH溶液校正至pH7.5。 (3)0.04mol/L KNO:称取10.11g KNO(A.R)溶于磷酸缓冲液并定容至500mL。 33 (4)1%对氨基苯磺酸:称1g对氨基苯磺酸，加25mL浓盐酸，用水定容至100mL。 (5)0.2% α -萘胺:称0.2g α -萘胺，加25mL冰乙酸，用水定容至100mL。 (6)30%三氯乙酸:75.0g 三氯乙酸用水定容至250mL。 四、操作步骤 (标准曲线的制作 1 取6支干净试管，编号，按表1加入试剂: 表1 标准曲线制作取样表 试 管 号 试 剂 1 2 3 4 5 6 亚硝酸钠标准液(mL) 0 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0 蒸馏水(mL) 2.0 1.6 1.2 0.8 0.4 0 1%对氨基苯磺酸(mL) 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 0.2% α-萘胺(mL) 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 亚硝酸钠含量(μg) 0 2 4 6 8 10 摇匀后在室温下放置20min，然后在540nm波长下测定光密度，以亚硝酸含量为横坐标，光密度为纵坐标绘制标准曲线。 2(酶反应和酶活性的测定 将实验材料(如白菜叶片)用水洗净，再用蒸馏水冲洗，然后用纱布或滤纸吸干。将材 料剪成0.5cm × 0.5cm左右的小块，混合均匀后分别称取三份，每份1g，然后分别放入3只50mL的三角瓶中，编号后按表2加入各种试剂: 表2 酶恬性测定取样表 三 角 瓶 号 1 2 3 0.1mol/L pH7.5磷酸缓冲液(mL) 4.0 4.0 4.0 0.04mol/L KNO溶液(mL) 5.0 5.0 5.0 3 30%三氯乙酸(mL) 1.0 0 0 摇匀后将三角瓶置于真空干燥器中，接上真空泵抽气10min。放气后叶片变软并沉入溶液。将三角瓶取出放入恒温箱，在30?、暗条件下保温30min。取出后立即向2、3号瓶分别加入1mL 30%三氯乙酸以终止酶反应。将各瓶中的反应液离心(2 000r/min，10min)，然后分别吸取上清液2mL于另一试管中，各加入4mL 1%对氨基苯磺酸和4mL 0.2% α-萘胺，室温显色20min后测定540nm波长下的光密度。用2、3号管溶液光密度平均值减去1号管溶液的光密度，得到的值在标准曲线上查出相应的NaNO含量(μg)。 2 五、结果与计算 NaNO含量(μg)，稀释倍数2NR活性[NaNO(μg)/鲜重(g),h],2样品重(g)，时间(h) 把在标准曲线上查得的NaNO含量代入下式，计算硝酸还原酶活性: 2 六、附 注 (真空抽气可在真空恒温箱中进行(抽气至700mmHg柱，10min)，也可以在真空干1 燥器中接真空泵抽气。 2(酶反应要在暗条件下进行的原因是叶绿体在光合作用时可产生亚硝酸还原酶的辅酶,2铁氧还蛋白，与亚硝酸还原酶同时存在时可还原NO，所以在暗条件下进行反应可阻止,2NO的继续反应，以保证测定结果的准确。 3(硝酸还原酶是诱导酶，光照是其诱导条件之一，所以应在光合作用进行了一段时间以后(3h)采样，田间采样应在早晨9点钟以后。 4(无机磷对硝酸还原酶活力有促进作用，所以常用磷酸缓冲液。 5(在配制标准溶液时，加入亚硝酸钠标准液和蒸馏水后要摇匀。显色时，加入1%对氨基苯磺酸后应充分摇匀。 七、思考题 1(为什么要将加有样品和试剂的三角瓶放入真空干燥器抽气, 2(为什么1号三角瓶在加入样品之前就要先加入1.0ml 30%三氯乙酸, 参考答案 1(将加有样品和试剂的三角瓶放入真空干燥器中进行抽气、放气，重复数次，可以排出植物组织间隙的气体，使底物溶液进入叶片组织并进行酶反应。 2(由于1号瓶事先加入三氯乙酸，造成酸性条件，使得加入样品中的蛋白质(包括硝酸还原酶)变性失活，因此不会产生酶反应，可以此溶液作为对照 实验九 纤维素酶活力的测定 一、目的 学习和掌握3,5-二硝基水杨酸(DNS)法测定纤维素酶活力的原理和方法，了解纤维素酶的作用特性。 二、原理 纤维素酶是一种多组分酶，包括C酶、C酶和β-葡萄糖苷酶三种主要组分。其中C1X1酶的作用是将天然纤维素水解成无定形纤维素，C酶的作用是将无定形纤维素继续水解成X 纤维寡糖，β-葡萄糖苷酶的作用是将纤维寡糖水解成葡萄糖。纤维素酶水解纤维素产生的纤维二糖、葡萄糖等还原糖能将碱性条件下的3,5-二硝基水杨酸(DNS)还原，生成棕红色的氨基化合物，在540nm波长处有最大光吸收，在一定范围内还原糖的量与反应液的颜色强度呈比例关系，利用比色法测定其还原糖生成的量就可测定纤维素酶的活力。 三、实验材料、主要仪器和试剂 1(实验材料 (1)纤维素酶制剂 500mg (2)新华定量滤纸 50mg / 份 × 4 (3)脱脂棉花 50mg / 份 × 4 (4)羧甲基纤维素钠(CMC) 510mg 5)水杨酸苷 500mg ( 2(主要仪器 (1)722型或其他型号的可见分光光度计 (2)恒温水浴2台 (3)沸水浴锅 (4)电炉子 (5)剪刀 (6)万分之一分析天平 (7)恒温干燥箱 (8)冰箱 (9)试管架 (10)胶头滴管 (11)具塞刻度试管 20mL×24 (12)移液管或加液器 0.5 mL×3;2mL×7 (13)容量瓶 100 mL×6;1000 mL×3 (14)量筒 50 mL×2;100 mL×1;500 mL×1 (15)烧杯 100 mL×6;500mL×3;1 000 mL×1 3(试剂(均为分析纯) (1)浓度为1mg/mL的葡萄糖标准液 将葡萄糖在恒温干燥箱中105?下干燥至恒重，准确称取100mg于100mL小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，移入100mL容量瓶中用蒸馏水定容至100mL，充分混匀。4?冰箱中保存(可用12,15天)。 (2)3,5-二硝基水杨酸(DNS)溶液 准确称取DNS 6.3g于500mL大烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，加入2mol/L NaOH溶液262mL，再加到500mL含有185g酒石酸钾钠(CHOKNa ? 4HO，MW=282.22)的热4462 水溶液中，再加5g结晶酚(CHOH，MW=94.11)和5g无水亚硫酸钠(NaSO，MW=126.04)，6523搅拌溶解，冷却后移入1 000mL容量瓶中用蒸馏水定容至1 000mL，充分混匀。贮于棕色瓶中，室温放置一周后使用。 (3)0.05 mol/L pH4.5的柠檬酸缓冲液 A液(0.1 mol/L 柠檬酸溶液):准确称取CHO ? HO(MW=210.14)21.014g于500mL6872 大烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，移入1 000mL容量瓶中用蒸馏水定容至1 000mL，充分混匀。4?冰箱中保存备用。 B液(0.1 mol/L 柠檬酸钠溶液):准确称取NaCHO ? 2HO(MW=294.12)29.412g36572 于500mL大烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，移入1 000mL容量瓶中，然后用蒸馏水定容至1 000mL，充分混匀。4?冰箱中保存备用。 取上述A液27.12mL，B液22.88mL，充分混匀后移入100mL容量瓶中用蒸馏水定容至100mL，充分混匀，即为0.05 mol/L pH4.5的柠檬酸缓冲液。4?冰箱中保存备用，用于测定滤纸酶活力。 (4)0.05 mol/L pH5.0的柠檬酸缓冲液 取上述A液20.5mL，B液29.5mL，充分混匀后移入100mL容量瓶中用蒸馏水定容至100mL，充分混匀。即为0.05M pH5.0的柠檬酸缓冲液。4?冰箱中保存备用。用于测定C1酶活力。 (5)0.51,羧甲基纤维素钠(CMC)溶液 精确称取0.51gCMC于100mL小烧杯中，加入适量0.05 mol/L pH5.0的柠檬酸缓冲液，加热溶解后移入100mL容量瓶中并用0.05 mol/L pH5.0的柠檬酸缓冲液定容至100mL，用前充分摇匀。4?冰箱中保存备用，用于测定C酶活力。 X (6)0.5,水杨酸苷溶液 准确称取0.5g水杨酸苷于100mL小烧杯中，用少量0.05 mol/L pH4.5的柠檬酸缓冲液溶解后，移入100mL容量瓶中并用0.05 mol/L pH4.5的柠檬酸缓冲液定容至100mL，充分混匀。4?冰箱中保存备用，用于测定β-葡萄糖苷酶活力。 (7)纤维素酶液的配制 准确称取纤维素酶制剂500mg于100mL小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，移入100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至100mL，此酶液的浓度为5mg/mL，4?冰箱中保存备用。 四、操作方法和步骤 1(葡萄糖(G)标准曲线的制作 取8支洗净烘干的20mL具塞刻度试管，编号后按表1加入标准葡萄糖(G)溶液和蒸馏水，配制成一系列不同浓度的葡萄糖溶液。充分摇匀后，向各试管中加入1.5mL DNS溶液，摇匀后沸水浴5min，取出冷却后用蒸馏水定容至20mL，充分混匀。在540nm波长下，以1号试管溶液作为空白对照，调零点，测定其它各管溶液的光密度值并记录结果。以葡萄糖含量(mg)为横坐标，以对应的光密度值为纵坐标，在坐标纸上绘制出葡萄糖标准曲线。 表1 葡萄糖标准曲线制作 1 2 3 4 5 6 7 8 管 号 试 剂 葡萄糖标液(mL) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 蒸 馏 水(mL) 2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 0.6 葡萄糖含量(mg) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 2(滤纸酶活力的测定 取4支洗净烘干的20mL具塞刻度试管，编号后各加入0.5mL酶液和1.5mL 0.05 mol/L pH4.5的柠檬酸缓冲液，向1号试管中加入1.5mL DNS溶液以钝化酶活性，作为空白对照，比色时调零用。将4支试管同时在50?水浴中预热5,10min，再各加入滤纸条50mg(新华定量滤纸，约1cm × 6 cm)，50?水浴中保温1h后取出立即向2、3、4号试管中各加入1.5mL DNS溶液以终止酶反应，充分摇匀后沸水浴5min，取出冷却后用蒸馏水定容至20mL，充分混匀。以1号试管溶液为空白对照调零点，在540nm波长下测定2、3、4号试管液的光密度值并记录结果。 根据3个重复光密度的平均值，在标准曲线上查出对应的葡萄糖含量，按下式计算出滤纸酶活力(U/g)。在上述条件下，每小时由底物生成1μmol葡萄糖所需的酶量定义为一个酶活力单位(U)。 葡萄糖含量(mg)× 酶液定容总体积(mL)× 5.56 滤纸酶活力 (U/g) , 反应液中酶液加入量(mL)× 样品重(g)× 时间(h) 式中:5.56为1mg葡萄糖的μmol数。(1 000/180=5.56) (C3酶活力的测定 1 将5mg/mL的原酶液稀释10,15倍后用于测定C酶活力，以脱脂棉为底物。 1 取4支洗净烘干的20mL具塞刻度试管，编号后各加入50mg脱脂棉，加入1.5mL 0.05M pH5.0的柠檬酸缓冲液，并向1号试管中加入1.5mL DNS溶液以钝化酶活性，作为空白对照，比色时调零用。将4支试管同时在45?水浴中预热5,10min，再各加入适当稀释后的酶液0.5mL，45?水浴中保温24h。取出后立即向2、3、4号试管中各加入1.5mL DNS溶液以终止酶反应，充分摇匀后沸水浴5min，取出冷却后用蒸馏水定容至20mL，充分混匀。以1号试管溶液为空白对照调零点，在540nm波长下测定2、3、4号试管液的光密度值并记录结果。 根据3个重复光密度的平均值，在标准曲线上查出对应的葡萄糖含量，按下式计算出C酶活力(U/g)。在上述条件下反应24h，由底物生成1μmol葡萄糖所需的酶量定义为一个1 酶活力单位(U)。 葡萄糖含量(mg)× 酶液定容总体积(mL)× 稀释倍数 × 5.56 × 24 C酶活力 (U/g), 1反应液中酶液加入量(mL)× 样品重(g)× 时间 (h) 式中:24为酶活力定义中的24h。 4(C酶活力的测定 X 将5mg/mL的原酶液稀释5倍后用于测定C酶活力，以CMC为底物。 X 取4支洗净烘干的20mL具塞刻度试管，编号后各加入1.5mL 0.51,CMC柠檬酸缓冲液，并向1号试管中加入1.5mL DNS溶液以钝化酶活性，作为空白对照，比色时调零用。将4支试管同时在50?水浴中预热5,10min，再各加入稀释5倍后的酶液0.5mL，50?水浴中保温30min后取出，立即向2、3、4号试管中各加入1.5mL DNS溶液以终止酶反应， 充分摇匀后沸水浴5min，取出冷却后用蒸馏水定容至20mL，充分混匀。以1号试管溶液为空白对照调零点，在540nm波长下测定2、3、4号试管液的光密度值并记录结果。 根据3个重复光密度的平均值，在标准曲线上查出对应的葡萄糖含量，按下式计算出C酶活力(U/g)。在上述条件下，每小时由底物生成1μmol葡萄糖所需的酶量定义为一个X 酶活力单位(U)。 葡萄糖含量(mg)× 酶液定容总体积(mL)× 稀释倍数 × 5.56 C酶活力 (U/g), X反应液中酶液加入量(mL)× 样品重(g)× 时间(h) 5(β-葡萄糖苷酶活力的测定 取4支洗净烘干的20mL具塞刻度试管，编号后各加入1.5mL 0.5,水杨酸苷柠檬酸缓冲液，并向1号试管中加入1.5mL DNS溶液以钝化酶活性，作为空白对照，比色时调零用。将4支试管同时在50?水浴中预热5,10min，再各加入酶液0.5mL，50?水浴中保温30min，取出后立即向2、3、4号试管中各加入1.5mL DNS溶液以终止酶反应，充分摇匀后沸水浴5min，取出冷却后用蒸馏水定容至20mL，充分混匀。以1号试管溶液为空白对照调零点，在540nm波长下测定2、3、4号试管液的光密度值并记录结果。 根据3个重复光密度的平均值，在标准曲线上查出对应的葡萄糖含量，按下式计算出β-葡萄糖苷酶活力(U/g)。在上述条件下，每小时由底物生成1μmol葡萄糖所需的酶量定义为一个酶活力单位(U)。 葡萄糖含量(mg)× 酶液定容总体积(mL)× 5.56 β-葡萄糖苷酶活力 (U/g), 反应液中酶液加入量(mL)× 样品重(g)× 时间(h) 五、五、结果计算 1(葡萄糖(G)标准曲线的制作(表2) 表2 标准曲线测定数据列表 管 号 1 2 3 4 5 6 7 8 葡萄糖含量(mg) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 光密度(OD) 0 540nm 根据表中数值，以葡萄糖(G)含量(mg)为横坐标，以对应的光密度值为纵坐标，在坐标纸上绘制出葡萄糖标准曲线。并在坐标纸的右上角写上实验题目、时间、实验人。 2( 2( 滤纸酶活力的测定结果计算(表3) 表3 滤纸酶活力的测定数据列表 管 号 1 2 3 4 三管平均值 光密度(OD) 0 540nm 葡萄糖含量(mg) 0 根据滤纸酶活力公式，计算出滤纸酶活力(U/g): 葡萄糖含量(mg)× 100(mL)× 5.56 滤纸酶活力 (U/g), 0.5(mL)× 0.5(g)× 1(h) 3( 3( C酶活力的测定结果计算(表4) 1 表4 C酶活力的测定数据列表 1 管 号 1 2 3 4 三管平均值 光密度值 0 葡萄糖含量(mg) 0 根据C酶活力公式，计算出C酶活力(U/g): 11 葡萄糖含量(mg)× 100(mL)× 稀释倍数 × 5.56 × 24 C酶活力 (U/g), 10.5(mL)× 0.5(g)× 24(h) (C酶活力的测定结果计算 4X 管 号 1 2 3 4 三管平均值 光密度值 0 葡萄糖含量(mg) 0 根据C酶活力公式，计算出C酶活力(U/g): XX 葡萄糖含量(mg) × 100(mL)× 5(倍)× 5.56 C酶活力 (U/g), X0.5(mL)× 0.5(g)× 0.5(h) 5(β-葡萄糖苷酶活力的测定结果计算 管 号 1 2 3 4 三管平均值 光密度值 0 葡萄糖含量(mg) 0 — — — 根据β-葡萄糖苷酶活力公式，计算出β-葡萄糖苷酶活力(U/g): 葡萄糖含量 (mg) × 100(mL × 5.56 β-葡萄糖苷酶活力 (U/g), 0.5(mL)× 0.5(g)× 0.5(h) 六、附 注 1(DNS溶液配制时，将含DNS的NaOH溶液加到含酒石酸钾钠的热水溶液中时，一定要慢倒，边倒边搅拌，以防被烫。 2( 2( 纤维素酶液的浓度可根据不同酶制剂的活力而相应调整。如果酶活力高，酶浓度可小些;反之，酶活力低时，酶浓度则大些。 3(在测定时，调零用1号管液一定在相应的各管液测定完成后，方可从比色杯中弃掉。 4(测定酶活时，滤纸条和脱脂棉等底物一定要充分浸入在反应液中。 5(用移液管或加液器加各试剂时，不能将移液管或取液枪头混用。 七、思考题 1(为什么用产物的生成量来定义酶活单位而不用底物减少量来定义, 2(DNS为什么能钝化纤维素酶活性, 3(为什么在测定C酶活力和C酶活力时，酶液要稀释, 1X 参考答案 1(因为产物的生成是从无到有的过程，用适当的方法可以很容易、很准确的测出产物产生的多少;而底物的加入量比较大，它的减少量不容易被测出。所以常用产物的生成量来定义酶活单位。 2(因为在配制3,5-二硝基水杨酸(DNS)时，加入了氢氧化钠，而使得3,5-二硝基水杨酸(DNS)试剂的碱性非常强，强碱抑制了纤维素酶的活性，所以3,5-二硝基水杨酸(DNS)能钝化纤维素酶的活性。 3(为了确保适当的底物反应浓度，在反应初速度时测出的结果更为精确，所以要找出最适的酶液浓度，而将酶液稀释来测定C酶活力和C酶活力。 1X 实验十 超氧化物歧化酶(SOD)活力测定 植物叶片在衰老过程中发生一系列生理生化变化，如核酸和蛋白质含量下降、叶绿素降解、光合作用降低及内源激素平衡失调等。这些指标在一定程度上反映衰老过程的变化。近来大量研究表明，植物在逆境胁迫或衰老过程中，细胞内自由基代谢平衡被破坏而有利于自由基的产生。过剩自由基的毒害之一是引发或加剧膜脂过氧化作用，造成细胞膜系统的损伤，严重时会导致植物细胞死亡。自由基是具有未配对价电子的原子或原子团。生物体内产生的 ,..自由基主要有超氧自由基(O)、羟自由基(OH)、过氧自由基(ROD)、烷氧自由基(RO)2 等。植物细胞膜有酶促和非酶促两类过氧化物防御系统，超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)和抗坏血酸过氧化物酶(ASA-POD)等是酶促防御系统的重要保护酶。抗坏血酸(V)、V和还原型谷胱甘肽(GSH)等是非酶促防御系统中的重CE .,. 要抗氧化剂。SOD、CAT等活性氧清除剂的含量水平和O、HO、OH和O等活性氧的2222含量水平可作为植物衰老的生理生化指标。 自1968年发现SOD后，立刻引起科学界的高度重视，近40年来这方面的研究进展非常迅速，它的应用领域日益拓宽，SOD也有了产品。二十世纪80年代后期，我国关于SOD的研究及应用也形成了热点，如今已在化妆品添加剂、饮料及医药方面显示了特殊效果。 .,超氧自由基(O)是生物细胞某些生理生化反应常见的中间产物。自由基是本身带有2 不成对价电子的分子、原子、原子团或离子，化学性质非常活泼，是活性氧的一种。如果细胞中缺乏清除自由基的酶时，机体就会受到各种损伤。超氧化物歧化酶(Superoxide ,.Dismutase)，简称SOD，能通过歧化反应清除生物细胞中的超氧自由基(O)，生成HO222和O。HO由过氧化氢酶(CAT)催化生成HO和O，从而减少自由基对有机体的毒害。 22222 一、目的 学习和掌握氯化硝基四氮唑蓝(NBT)光化还原法测定SOD活力的方法和原理，并了解SOD的作用特性。 二、原理 SOD是含金属辅基的酶。高等植物含有两种类型的SOD:Mn,SOD和Cu.Zn,SOD，它们都催化下列反应: ,,， SOD .. O， O， 2HHO， O2222 2 CATHOHO ， 1/2O 22 22 ,.由于超氧自由基(O)为不稳定自由基，寿命极短，测定SOD活性一般为间接方法。2 .并利用各种呈色反应来测定SOD的活力。核黄素在有氧条件下能产生超氧自由基负离子O2,，当加入NBT后，在光照条件下，与超氧自由基反应生成单甲月替 ( 黄 色 ) ，继而还原生成二甲月替 ，它是一种蓝色物质，在560nm波长下有最大吸收。当加入SOD时，可以使超 +氧自由基与H结合生成HO和O，从而抑制了NBT光还原的进行，使蓝色二甲月替 生成222 速度减慢。通过在反应液中加入不同量的SOD酶液，光照一定时间后测定560nm波长下各液光密度值，抑制NBT光还原相对百分率与酶活性在一定范围内呈正比，以酶液加入量为横坐标，以抑制NBT光还原相对百分率为纵坐标，在坐标纸上绘制出二者相关曲线，根据SOD抑制NBT光还原相对百分率计算酶活性。找出SOD抑制NBT光还原相对百分率为50,时的酶量作为一个酶活力单位(U)。 三、实验材料、主要仪器和试剂 1(实验材料 小麦、玉米、水稻、棉花等新鲜叶片 2(主要仪器 (1)722型或其他型号的可见分光光度计 (2)万分之一分析天平 (3)高速冷冻离心机 (4)冰箱 (5)光照箱:4 500Lux (6)带盖瓷盘 1个/处理 (7)移液管架 (8)研钵 (9)离心管 5mL数个 (10)微烧杯 10,15mL 8个/处理 (11)移液管或加样器 0.5mL×4;1mL×2;2mL×2;5mL×1 (12)微量进样器 50μL×2;100μL×2 (13)烧杯 50mL×3;100mL×5;500mL×1;1 000mL×2 (14)量筒 50mL×1;100mL×2 (15)容量瓶 50mL×1;100mL×5;250mL×1;1 000mL×2 (16)细口瓶 125mL×5 3(试剂 (1)0.1 mol/L pH7.8磷酸钠(NaHPO-NaHPO)缓冲液 2424 A液(0.1 mol/L NaHPO溶液):准确称取NaHPO? 12HO(MW=358.14)3.5814g于24242 100mL小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，移入100mL容量瓶中用蒸馏水定容至刻度，充分混匀。4?冰箱中保存备用。 B液(0.1 mol/L NaHPO溶液):准确称取NaHPO? 2HO (MW=156.01)0.780g于24242 50mL小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，移入50mL容量瓶中用蒸馏水定容至刻度，充分混 匀。4?冰箱中保存备用。 取上述A液183mL与B液17mL充分混匀后即为0.1 mol/L pH7.8的磷酸钠缓冲液。4?冰箱中保存备用。 (2)0.026 mol/L 蛋氨酸(Met)磷酸钠缓冲液 准确称取L-蛋氨酸(CHNOS，MW=149.21)0.3879g于100mL小烧杯中，用少量5112 0.1 mol/L pH7.8的磷酸钠缓冲液溶解后，移入100mL容量瓶中并用0.1 mol/L pH7.8的磷酸钠缓冲液定容至刻度，充分混匀(现用现配)。4?冰箱中保存可用1,2d。 ,4 (3)7.5 × 10mol/L NBT溶液 准确称取NBT(COHOClNO，MW=817.7)0.1533g于100mL小烧杯中，用少量蒸432106 馏水溶解后，移入250mL容量瓶中用蒸馏水定容至刻度，充分混匀(现配现用)。4?冰箱中保存可用2,3d。 ,5(4)含1.0μmol/L EDTA的2 × 10 mol/L核黄素溶液 A液:准确称取EDTA(MW=292)0.00292g于50mL小烧杯中，用少量蒸馏水溶解。 B液:准确称取核黄素(MW=376.36)0.0753g于50mL小烧杯中，用少量蒸馏水溶解。 C液:合并A液和B液，移入100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，此溶液为含0.1mmol/L EDTA的2mmol/L 核黄素溶液。4?冰箱中保存可用8,10d。该溶液应避光保存，即用黑纸将装有该液的棕色瓶包好，置于4?冰箱中保存。 ,5 当测定SOD酶活时，将C液稀释100倍，即为含1.0μmol/L EDTA的2 × 10mol/L 核黄素溶液。 (5)0.05 mol/L pH7.8磷酸钠缓冲液 取0.1 mol/L pH7.8的磷酸钠缓冲液50mL，移入100mL容量瓶中用蒸馏水定容至刻度，充分混匀。4?冰箱中保存备用。 (6)石英砂。 四、操作方法和步骤 1(酶液的制备 按每克鲜叶加入3mL 0.05 mol/L pH7.8磷酸钠缓冲液，加入少量石英砂，于冰浴中的研钵内研磨成匀浆，定容到5mL刻度离心管中，于8 500 r/min(10 000g)冷冻离心30min，上清液即为SOD酶粗提液。 2(酶活力的测定 每个处理取8个洗净干燥好的微烧杯编号，按表1加入各试剂及酶液，反应系统总体积为3mL。其中4,8号杯中磷酸钠缓冲液量和酶液量可根据试验材料中酶液浓度及酶活力进行调整(如酶液浓度大、活性强时，酶用量适当减少)。 各试剂全部加入后，充分混匀，取1号微烧杯置于暗处，作为空白对照，比色时调零用。其余7个微烧杯均放在温度为25?，光强为4 500Lux的光照箱内(安装有3根20W的日光灯管)照光15min，然后立即遮光终止反应。在560nm波长下以1号杯液调零，测定各杯液光密度并记录结果。以2、3号杯液光密度的平均值作为抑制NBT光还原率100,，根据其他各杯液的光密度分别计算出不同酶液量的各反应系统中抑制NBT光还原的相对百分率。以酶液用量为横坐标，以抑制NBT光还原相对百分率为纵坐标，作出二者相关曲线。 找出50,抑制率的酶液量(μL)作为一个酶活力单位(U)。 表1 反应系统中各试剂及酶液的加入量(mL) 试 剂 试剂(5) 试剂(2) 试剂(3) 酶 液 试剂(4) 杯 号 1 0.9 1.5 0.3 0 0.3 2 0.9 1.5 0.3 0 0.3 3 0.9 1.5 0.3 0 0.3 4 0.85 1.5 0.3 0.05 0.3 5 0.80 1.5 0.3 0.10 0.3 6 0.75 1.5 0.3 0.15 0.3 7 0.70 1.5 0.3 0.20 0.3 8 0.65 1.5 0.3 0.25 0.3 五、结果计算 1(560nm波长下各杯液的光密度(表2) 表2 测定数据列表 杯 号 1 2 3 4 5 6 7 8 2、3号平均值 酶液量(mL) 0 0 0 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 — 光密度(OD) 0 560nm 抑制率(,) — 100 100 100 以酶液加入量为横坐标，以抑制NBT光还原相对百分率为纵坐标，在坐标纸上绘制出二者相关曲线。找出50,抑制率的酶液量(μL)作为一个酶活力单位(U)。 2(SOD酶活力按下式计算 V × 1000 × 60 A, B × W × T 式中各因子代表内容如下: A:为酶活力(酶活力单位:U/g(FW)?h); V:为酶提取液总体积(mL); B:为一个酶活力单位的酶液量(μL); W:为样品鲜重(g); T:为反应时间(min); 1 000:为1mL = 1 000μL; 60:为1h = 60min。 3(抑制率按下式计算 —D D12抑制率= ×100, D 1 式中各因子代表内容如下: D:为2、3号杯液的光密度平均值; 1 D:为加入不同酶液量的各杯液的光密度值。 2 注:有时因测定样品的数量多，每个样品均按此法测定酶活力工作量将会很大，也可每个样品只测定1个或2个酶液用量的光密度值，按下式计算酶活力。 (D,D) × V × 1000 × 60 12A, D× B × W × T × 50, 1 式中各因子代表如下: D:为2、3号杯液的光密度平均值; 1 D:为测定样品酶液的光密度; 2 50,:为抑制率50,; 其它各因子代表的内容与上述SOD酶活力的各因子代表的内容相同。 六、注意事项 1(富含酚类物质的植物(如茶叶)在匀浆时产生大量的多酚类物质，会引起酶蛋白不可逆沉淀，使酶失去活性，因此在提取此类植物SOD酶时，必须添加多酚类物质的吸附剂，将多酚类物质除去，避免酶蛋白变性失活，一般在提取液中加1,4,的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。 2(测定时的温度和光化反应时间必须严格控制一致。为保证各微烧杯所受光强一致，所有微烧杯应排列在与日光灯管平行的直线上。 七、思考题 1(为什么SOD酶活力不能直接测得, 2(超氧自由基为什么能对机体活细胞产生危害，SOD酶如何减少超氧自由基的毒害, 参考答案 ,.1(由于超氧自由基(O)为不稳定自由基，寿命极短，反应过程不易控制，测定的2 结果也不精确，所以测定SOD活性一般采用间接方法。 2(自由基是具有未配对价电子的原子或原子团，化学性质非常活泼，是活性氧的一种。植物在逆境胁迫或衰老过程中，细胞内自由基代谢平衡被破坏而有利于自由基的产生。过剩自由基的毒害之一是引发或加剧膜脂过氧化作用，造成细胞膜系统的损伤，严重时会导致植物细胞死亡。超氧自由基是生物细胞某些生理生化反应常见的中间产物，如果细胞中缺乏清除自由基的酶，机体就会受到各种损伤。SOD则能通过歧化反应清除生物细胞中的超氧自 .,由基(O)，生成HO和O，HO由过氧化氢酶(CAT)催化生成HO和O，从而减少22222222自由基对有机体的毒害。 实验 十一 过氧化物酶活性的测定 一、目的 过氧化物酶广泛存在于植物体中，是活性较高的一种酶。它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有关系。在植物生长发育过程中它的活性不断发生变化。一般老化组织中活性较高，幼嫩组织中活性较弱。这是因为过氧化物酶能使组织中所含的某些碳水化合物转化成木质素，增加木质化程度，而且发现早衰减产的水稻根系中过氧化物酶的活性增加，所以过氧化物酶可作为组织老化的一种生理指标。此外，过氧化物同工酶在遗传育种中的重要作用也正在受到重视。 通过本实验学习并掌握过氧化物酶活性测定的原理及方法。 二、原理 过氧化物酶催化过氧化氢氧化酚类的反应，产物为醌类化合物，此化合物进一步缩合或与其他分子缩合，产生颜色较深的化合物。本实验以邻甲氧基苯酚(即愈创木酚)为过氧化物酶的底物，在此酶存在下，HO可将邻甲氧基苯酚氧化成红棕色的4-邻甲氧基苯酚，其22 反应为: CHO O CHCH3 3 3 O O O 过氧化物酶 + 4HO 22 OH 邻甲氧基苯酚 O O O CHO CH3 3 4,邻甲氧基苯酚(红棕色) 红棕色的物质可用分光光度计在470nm处测定其消光值，即可求出该酶的活性。 三、实验材料、主要仪器和试剂 1( 1( 材料 水稻根系，马铃薯块茎等。 2( 2( 仪器 (1)分光光度计 (2)移液管 (3)离心机(4 000r/min) (4)秒表 (5)研钵 (6)天平 3(药品 (1)0.1mol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.5) 取12.114g三羟甲基氨基甲烷(Tris)，加水稀释，用HCl调pH8.5后定容1 000mL。 (2)0.2 mol/L磷酸缓冲液(pH6.0) 贮备液A:0.2 mol/L NaHPO溶液(27.8g NaHPO?HO配成1 000mL)。 24242 贮备液B:0.2 mol/L NaHPO溶液(53.65g NaHPO?7HO或71.7g NaHPO?12HO24242242配成1 000mL)。 分别取贮备液A 87.7mL与贮备液B 12.3mL充分混匀并稀释至200mL。 (3)反应混合液 取0.2 mol/L磷酸缓冲液(pH6.0)50mL，过氧化氢0.028mL，愈创木酚0.019mL混合。 四、操作步骤 1(酶液提取:取不同水稻根系(根系表面水分吸干)1g，剪碎置于研钵中，加5mL 0.1 mol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.5)，研磨成匀浆，以4 000r/min离心5min，倾出上清液，必要时残渣再用5mL缓冲液提取一次，合并两次上清液，保存在冰箱(或冷处)备用。 2(取光径1cm比色杯2个，向其中之一加入上述酶液1mL(如酶活性过高可稀释之)，再加入反应混合液3mL，立即开启秒表记录时间;而向另一比色杯中加入0.2 mol/L磷酸缓冲液(pH6.0)，作为零对照。用分光光度计在470nm波长下测定反应5min时的光密度值。 五、结果计算 以每分钟光密度变化(以每分钟OD变化0.01为1个活力单位)表示酶活性大小，即 470nm ?OD 470nm过氧化物酶活力 = min?mg(FW) 六、附注 1(酶的提取纯化需在低温下进行。 七、思考题 1(试述酶活力的定义, 2(测定酶的活力要注意控制哪些条件, 参考答案 1(过氧化物酶活力是以每分钟光密度变化(OD变化)0.01为1个活力单位来表示酶活470nm 性大小的。 2(酶的活力测定时:(1)保持待测材料的酶活;(2)测定时注意控制反应时间; 实验十二 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离过氧化物同工酶 一、目的 同工酶是指能催化同一种化学反应，但其酶蛋白本身的分子结构组成却有所不同的一组酶。研究表明，植物在发育过程中，所含同工酶的种类和比例都不相同，它们与植物的遗传、生长发育、代谢调节及抗性等都有一定关系，因此作为基因表达的产物，测定同工酶谱是认识基因存在和表达的一种工具，在植物的种群、发育及杂交遗传的研究中有重要的意义。 过氧化物酶是植物体内普遍存在的、活性较高的一种酶。它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有关系。在植物生长发育过程中它的活性不断发生变化，测定这种酶的活性或其同工酶，可以反映某一时期植物体内代谢的变化。 利用聚丙烯酰胺凝胶电泳测定同工酶，方法简便，灵敏度高，重现性强，测定结果便于观察、记录和保存。本实验采用聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳技术，分离小麦幼苗过氧化物酶同工酶，根据酶的生物化学反应，通过染色方法显示出酶的不同区带，以鉴定小麦幼苗过氧化物酶同工酶。 通过本实验要掌握电泳技术的原理、方法、装置、凝胶配制等知识，熟悉主要的操作过程，同时对同工酶有一个感性的认识。 二、原理 1(1(电泳 带电粒子在电场中向与其自身带相反电荷的电极移动，这种现象称为电泳。近几十年来，电泳作为一项有效的分析、分离和制备技术发展很快，在生产、科研和医疗工作中得到了广泛应用。用电泳技术分离、分析蛋白质、酶、核酸等生物大分子，有较高的分辨率，目前已成为生物科学研究中必不可少的手段之一。 2(2(影响电泳的主要因素 若将带净电荷q的粒子放入电场，则该粒子所受到的引力F可用数学式表示如下: 引 F,E?q (1) 引 式中E为电场强度，单位为“v/cm”，表示电场中单位距离上的电位差。 如果这种情况发生在真空中，则带电粒子会朝着电极加速前进并且最后与电极相撞。但在溶液中，由于电场的牵引力F与加速运动的粒子和溶液之间产生的阻力(即摩擦力)F引阻 相对抗。故上述现象不会发生。根据Stokes公式，阻力的大小取决于粒子的大小和形状以及所在介质的粘度: F,6πrηv (2) 阻 式中F是球形粒子所受的阻力，r是球形粒子的半径，η是溶液的粘度，v是粒子移阻 动的速度。在溶液中，由电场而产生的加速力被阻力所对抗，因此， E?q,6πrηv (3) 将(3)式整理得: E?q V= (4) 6πrη 由此可以看出，粒子移动的速度(v)与电场强度(E)和粒子所带电荷量(q)成正比，而与粒子的大小(r)和溶液的粘度(η)成反比。非球形粒子(如DNA)在电泳过程中会受到更大的阻力，即粒子的移动速度还与粒子形状有关。 既然在一定pH条件下，每一分子都具有特殊的电荷(种类与数量)、大小和形状，在一定的时间内它在相同的电场中便应集中到特定的位置上而形成紧密的泳动带。这就是带电粒子可以用电泳技术进行分离、分析、鉴定的基本原理。 由于带电粒子的泳动速度受电场强度影响，使得同一带电粒子在不同电场里泳动速度不 同。为了便于比较，常用迁移率(或称泳动度)代替泳动速度表示粒子的泳动情况。迁移率(泳动度)的定义为“带电粒子在单位电场强度下的泳动速度”，若以m表示迁移率，则 v m= (5) E 将(4)式代入(5)式，得 E?q (6) 6πrη q m= = 6πrη E 由(6)式可以看出，迁移率(泳动度)仅与球形粒子所带电荷的数量，粒子大小及溶液粘度有关，而与电场强度无关。由于氨基酸、蛋白质、酶等的电离度a随溶液pH变化而不同，所以实际上常使用有效迁移率。有效迁移率u为迁移率m和当时条件下电离度a的乘积。即: u=m?a (7) 将(6)式代入(7)式，得: q?a u= (8) 6πrη 由(8)式可以看出，凡能影响溶液粘度η的因素如温度，影响分子带电量q及解离度a的因素如pH的改变，都会对有效迁移率产生影响。因此，电泳应尽可能在恒温条件下进行。并选用一定pH的缓冲液。同时，所选用的pH以能扩大各种被分离物质所带电荷量的差异为好，以利于分离各种成分。 以上讨论的基本上是在溶液中进行的自由电泳的情况。在支持介质中进行的各种电泳，除以上因素影响外，有效迁移率还受电渗现象的影响。所谓电渗是指在电场中，液体对于固体支持物的相对移动。例如在纸电泳中，由于滤纸(纤维素)上带有负电荷，因感应相吸而使与滤纸相接触的水溶液带正电荷，从而使液体向负极移动，带动着本来是向负极泳动的物质以更快的速度移动。因此，电泳时应避免用高电渗物质作支持介质。 最后要考虑选用离子强度适宜的溶液。一般最适的离子强度在0.02,0.2之间。在稀溶液中，离子强度?可用下式计算: 1 2?, ΣmiZi (9) 2 (9)式中，mi为离子的克分子浓度，Zi为离子的价数。 3(3(聚丙烯酰胺凝胶 聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝胶作为载体的一种区带电泳。这种凝胶是以丙烯酰胺单体(Acrylamide，简写为Acr)和交联剂N，N'-甲叉双丙烯酰胺(N,N'-Methylena Bisacrylamide，简写为Bis)在催化剂的作用下聚合而成的。 Acr和Bis在它们单独存在或混合在一起时是稳定的，且具有神经毒性，操作时应避免接触皮肤。但在具有自由基团体系时，它们聚合。引发产生自由基团的方法有两种，即化学法和光化学法。 化学聚合的引发剂是过硫酸铵 (NH)SO(Ammonium persulfate，简写为Ap)，催化4223 剂是N，N，N',N'-四甲基乙二胺(Tetramethylenediamine，简写为TEMED)。在催化剂TEMED的作用下，由过硫酸铵(Ap)形成的自由基又使单体形成自由基，从而引起聚合作用。TEMED 在低pH时失效，会使聚合作用延迟;冷却也可使聚合速度变慢;一些金属抑制聚合;分子氧阻止链的延长，防碍聚合作用。这些因素在实际操作时都应予以控制。 光聚合以光敏感物核黄素(即V)作为催化剂，在痕量氧存在下，核黄素经光解形成B2 无色基，无色基被氧再氧化成自由基，从而引起聚合作用。过量的氧会阻止链长的增加，应避免过量氧的存在。 光聚合形成的凝胶孔径较大，而且随着时间的延长而逐渐变小，不太稳定，所以用它制备大孔径的浓缩胶较为合适。采用化学聚合形成的凝胶孔径较小，而且重复性好，常用来制备分离胶。 聚丙烯酰胺的基本结构，为丙烯酰胺单位构成的长链，链与链之间通过甲叉桥联结在一起。链的纵横交错，形成三维网状结构，使凝胶具有分子筛性质。网状结构还能限制蛋白质等样品的扩散运动，使凝胶具有良好的抗对流作用。此外，长链上富含酰胺基团，使其成为稳定的亲水凝胶。该结构中不带电荷，在电场中电渗现象极为微小。这些特点，使得聚丙烯酰胺适合作区带电泳的支持介质。 聚丙烯酰胺凝胶的质量主要由凝胶浓度和交联度决定。每100ml凝胶溶液中含有的单体(Acr)和交联剂(Bis)总克数称为凝胶浓度，用T,表示。凝胶溶液中，交联剂(Bis)占单体(Acr)和交联剂(Bis)总量的百分数称为交联度，用C,表示。改变凝胶浓度以便适应各种样品的分离。一般常用7.5,浓度的聚丙烯酰胺凝胶分离蛋白质，而用2.4%的分离核酸。但根据蛋白质与核酸分子量不同，适用的浓度也不同(见表1)。 表1 凝 胶 浓 度 选 用 表 物 质 分 子 量 范 围 适用的凝胶浓度(%) 4 ,10 20,30 44 1×10,4×10 15,20 45蛋 白 质 4×10,1×10 10,15 55 1×10,5×10 5,10 5 ,5×10 2,5 4 ,10 15,20 45核 酸 10,10 5,10 56 10,2×10 2,2.6 4(4(不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理 系统的不连续性表现在以下几个方面: (1)凝胶板由上、下两层胶组成，两层凝胶的孔径不同。上层为大孔径的浓缩胶，下层为小孔径的分离胶。 (2)缓冲液离子组成及各层凝胶的pH不同。本实验采用碱性系统。电极缓冲液为pH8.3的Tris-甘氨酸缓冲液，浓缩胶为pH6.7的Tris-HCl缓冲液。而分离胶为pH8.9的Tris-HCl缓冲液。 (3)在电场中形成不连续的电位梯度。在这样一个不连续的系统里，存在三种物理效应，即电荷效应、分子筛效应和浓缩效应。在这三种效应的共同作用下，待测物质被很好地分离开来。下面以本实验要分离的小麦苗过氧化物酶同工酶为例，分别说明三种效应的作用: (1)电荷效应:各种酶蛋白按其所带电荷的种类及数量，在电场作用下向一定电极，以一定速度泳动。 (2)分子筛效应:分子量小，形状为球形的分子在电泳过程中受到阻力较小，移动较 快;反之，分子量大、形状不规则的分子，电泳过程中受到的阻力较大，移动较慢。这种效应与凝胶过滤过程中的情况不同。 (3)浓缩效应:待分离样品中的各组分在浓缩胶中会被压缩成层，而使原来很稀的样品得到高度浓缩。其原因如下: ? 由于两层凝胶孔径不同，酶蛋白向下移动到两层凝胶界面时，阻力突然加大，速度变慢。使得在该界面处的待分离酶蛋白区带变窄，浓度升高。 ? 在聚丙烯酰胺凝胶中，虽然浓缩胶和分离胶用的都是Tris-HCl缓冲液，但上层浓缩胶为pH 6.7，下层分离胶为pH 8.9。HCl是强电解质，不管在哪层胶中，HCl几乎都全部电 ,离，Cl布满整个胶板。待分离的酶蛋白样品加在样品槽中，浸在pH8.3和Tris-甘氨酸缓冲 ,液中。电泳一开始，有效泳动率最大的Cl迅速跑到最前边，成为快离子(前导离子)。在pH6.7条件下解离度仅有0.1,1,的甘氨酸(pI = 6.0 )有效泳动率最低，跑在最后边，成为慢离子(尾随离子)。这样，快离子和慢离子之间就形成了一个不断移动的界面。在pH6.7条件下带有负电荷的酶蛋白，其有效泳动率介于快慢离子之间，被夹持分布于界面附近，逐渐形成一个区带。 由于快离子快速向前移动，在其原来停留的那部分地区成了低离子浓度区，即低电导区。因为电位梯度V、电流强度I和电导率S之间有如下关系: I V, S 所以在电流恒定条件下低电导区两侧就产生了较高的电位梯度。这种在电泳开始后产生的高电位梯度作用于酶蛋白和甘氨酸慢离子加速前进，追赶快离子。本来夹在快慢离子之间的酶蛋白区带，在这个追赶中被逐渐地压缩聚集成一条更为狭窄的区带。这就是所谓的浓缩效应。在此区带中，各种酶蛋白又按其电荷而分成不同层次，在进入分离胶前被初步分离，形成若干条离得很近但又不同的“起跑线”。 当酶蛋白和慢离子都进入分离胶后，pH从6.7变为8.9，甘氨酸解离度剧增，有效迁移率迅速加大，从而赶上并超过所有酶蛋白分子。此时，快慢离子的界面跑到被分离的酶蛋白之前，不连续的高电位梯度不再存在。于是，此后的电泳过程中，酶蛋白在一个均一的电位梯度和pH条件下，仅按电荷效应和分子筛效应而被分离。与连续系统相比，不连续系统的分辨率大大提高，因此已成为目前广泛使用的分离分析手段。 三、实验材料、仪器和试剂 1( 1( 实验材料 小麦幼苗 2(仪器 (1)垂直板电泳槽及附件(玻璃板、硅胶条、梳子、导线等) (2)稳压稳流直流电泳仪 (3)高速离心机(10 000r/min) (4)量筒:500mL×1，10mL×1，5mL×1 (5)烧杯:250mL×4 (6)微量注射器(50μL) (7)其他:玻棒、大培养皿等 2( 2( 试剂 贮液配制方法见表2。 表2 聚丙烯胺凝胶电泳贮液配制方法 序号 试 剂 名 称 配 制 方 法 1 1.5,琼脂 1.5g琼脂，100mL pH8.9分离胶缓冲液浸泡，用前加热溶化。 2 分离胶缓冲液，pH8.9 取48 mL 1mol/L HCl，Tris36.8g，用无离子水溶解后定容至100 mL。 (pH8.9 Tris-HCl缓冲液) 3 浓缩胶缓冲液，pH6.7 取48 mL 1 mol/L HCl，Tris 5.98g，用无离子水溶解后定容至100 mL。 (pH6.7 Tris-HCl缓冲液) 4 分离胶丙胶贮液 Acr 28.0g，Bis 0.735g，用无离子水溶解后定容至100 mL，过滤除去 (Acr-Bis贮液?) 不溶物，装入棕色试剂瓶，4?保存。 5 浓缩胶丙胶贮液 Acr 10g，Bis 2.5g，用无离子水溶解后定容至100 mL，过滤除去不溶 (Acr-Bis贮液?) 物，装入棕色试剂瓶，4?保存。 6 10,过硫酸铵溶液(Ap) 10g过硫酸铵溶于100 mL无离子水中(当天配制)。 7 四甲基乙二胺(TEMED) 原液。 8 核黄素溶液 核黄素4.0mg，无离子水溶解后定容至100mL。 9 电极缓冲液，pH8.3 Tris 6 g，甘氨酸28.8 g，溶于无离子水后定容至1 000 mL，用时稀释 (pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液) 10倍。 10 40,蔗糖溶液 蔗糖40 g，溶于100 mL无离子水中。 11 pH4.7乙酸缓冲液 乙酸钠70.52 g，溶于500 mL蒸馏水中再加36 mL冰乙酸，蒸馏水定 容至1 000 mL。 12 7,乙酸溶液 19.4 mL 36,乙酸稀释至100 mL。 13 样品提取液，pH8.0 Tris 12.1 g，加无离子水1 000 mL，以HCl调节pH至8.0 (pH8.0 Tris-HCl缓冲液) 14 0.5,溴酚蓝溶液 0.5 g溴酚蓝溶于100 mL无离子水中。 15 联大茴香胺染色液 联大茴香胺250 mg溶于140 mL 95,乙醇中，加20 mL蒸馏水，使用 前加3,HO4,5 mL(当天配制) 22 四、操作步骤 1(贮液配制 按上表配制贮液，但应注意 (1)配好的贮液用棕色瓶盛装置冰箱内保存，可放1,2个月。 (2)过硫酸铵应当天配制。 (3)如有不溶物要过滤。 (4)显色液用前再混和。 (5)电极缓冲液用时稀释10倍。 2(电泳槽的安装 垂直板电泳槽的式样很多，目前流行的是用有机玻璃做的两个“半槽”组成的方形电泳槽，中间夹着凝胶模子，是由成套的两块玻璃板装入一个用硅酮橡胶做成的模套而构成，由硅酮橡胶套决定两玻璃板之间距离约为1.5mm，形成一个“胶室”，胶就在这两板之间的胶室内聚合成平板胶。当凝胶模子与两半槽固定在一起后，凝胶槽子两侧形成前后两个槽，供装电极缓冲液和冷凝管用。 将两块玻璃板用去污剂洗净，再用蒸馏水冲洗，直立干燥(勿用手指接触玻璃板面，可用手夹住玻璃板的两旁操作)，然后正确放入硅胶条中，夹在电泳槽里，按对角线顺序旋紧 螺丝，注意用力均衡以免夹碎玻璃板。安装好电泳槽用pH8.9缓冲液配制的1.5,琼脂溶液封底，待琼脂凝固后即可灌制凝胶。 3( 3( 凝胶的制备 将贮液由冰箱取出，待与室温平衡后再配制工作液。 (1)按表3比例配制分离胶 表3 分离胶取样表 贮液号 2 4 6 7 名 称 分离胶缓冲液 分离丙胶 过硫酸铵 TEMED 无离子水 取用量(mL) 3 6 0.30 0.06 15 注:TEMED在灌胶前加。 将分离胶沿长玻璃板加入胶室内，小心不要产生气泡，加至距短玻璃板顶端3cm处，立即覆盖2,3mm的水层(或水饱和正丁醇)，静置待聚合(约40min)，当胶与水层的界面重新出现时表明胶已聚合。 (2)按表4比例配制浓缩胶 表4浓缩胶取样表 贮液号 3 5 7 8 名 称 浓缩胶缓冲液 浓缩丙胶 TEMED 核黄素溶液 蔗 糖 取用量(mL) 1 2 0.03 1 4 注:TEMED在灌胶前加。 先倒掉分离胶上的水层，立即加入浓缩胶，插入梳子(即样品槽)，待胶凝后，小心取出梳子。将稀释10倍的电极缓冲液倒入两槽中，前槽(短板侧)缓冲液要求没过样品槽，后槽(长板侧)缓冲液要求没过电极，备用。 4(样品的制备 称取小麦幼苗茎部0.5 g，放入研钵内，加pH 8.0提取液1 mL，于冰水浴中研成匀浆，然后以2 mL提取液分几次洗入离心管，在高速离心机上以8 000r/min离心10min，倒出上清液，以等量40,蔗糖及1/5体积溴酚蓝指示剂混和，留作点样用。 5(点样 用微量注射器(50μL)吸取少量样液，在浓缩胶上层点样，每个点样槽15,50μL。点样时须小心，防止样品液的扩散。 6(电泳 将电泳槽放入冰箱，接好电源线(前槽为负极)。打开电源开关，调节电流到20mA左右，样品进入到分离胶后加大到30mA，维持恒流。待指示染料下行到距胶板末端1cm处，即可停止电泳。把调节旋扭调至零，关闭电源，电泳约3h。 7(剥胶 取出电泳胶板，去掉胶套，掀开玻璃，去掉浓缩胶，用玻棒协助将分离胶放到盛有pH4.7的乙酸缓冲液的大培养皿中浸泡10min。 8(染色、记录结果 倒去乙酸缓冲液，加联大茴香胺染色液，使淹没整个胶板，于室温下显色20min，即得到过氧化物酶同工酶的红褐色酶谱。该酶活性染色过程如下:过氧化物酶分解HO产生氧22基，后者使联大茴香胺发生反应生成褐色化合物。所以用染色液浸泡凝胶时，有过氧化物酶 同工酶蛋白质条带的部位便出现褐色的谱带。 倒掉染色液，重新加入7,的乙酸溶液，于日光灯下观察记录酶谱，绘图或照相。 五、附注 1(如果室温较高，可适当减少电流，延长电泳时间，或采取降温措施，以免温度过高造成酶活损失。 2(工业纯丙烯酰胺(Acr)和甲叉双丙烯酰胺(Bis)的纯化方法 (1)Acr的纯化 称取70g的Acr，于50?溶于1 000L三氯甲烷(A.R.)中，趁热过滤，冷至,20?，使结晶，于冷处用布氏漏斗抽滤，用冷的三氯甲烷短时间冲洗，继续抽滤，收集结晶，在真空干燥器中彻底干燥。将白色纯结晶保存于棕色瓶中，熔点为84.5?0.3?。 (2)Bis的纯化 称取12g的Bis溶于40,50?的1 000L丙酮(A.R.)中，趁热过滤，慢慢冷至,20?，于冷处过滤或离心收集结晶。用冷丙酮洗涤后，真空干燥。白色结晶保存于棕色瓶中。 六、思考题 1( 1( 电泳要求的基本条件有哪些, 2( 2( 丙烯酰胺凝胶电泳的制胶过程中，哪些因素影响胶的凝聚, 3(电泳系统的不连续性表现在哪几个方面,存在哪几种物理效应, 4(简述酶活性染色的过程, 参考答案 1(电泳的基本条件为:(1)电泳应尽可能在恒温条件下进行。(2)选用一定pH的缓冲液。同时，所选用的pH以能扩大各种被分离物质所带电荷量的差异为好，以利于分离各种成分。(3)有效迁移率还受电渗现象的影响，电泳时应避免用高电渗物质作支持介质。(4)选用离子强度适宜的溶液。一般最适的离子强度在0.02,0.2之间。 2(TEMED在低pH时失效，会使聚合作用延迟;冷却也可使聚合速度变慢;一些金属抑制聚合;分子氧阻止链的延长，防碍聚合作用。这些因素在实际操作时都应予以控制。以光敏感物核黄素(V)作为催化剂进行光聚合时，应避免过量氧的存在。 B2 3(系统的不连续性表现在以下几个方面:(1)凝胶板的上、下两层凝胶的孔径不同，上层为大孔径的浓缩胶，下层为小孔径的分离胶。(2)缓冲液离子组成及各层凝胶的pH不同。本实验采用碱性系统。电极缓冲液为pH8.3的Tris-甘氨酸缓冲液，浓缩胶为pH6.7的Tris-HCl缓冲液。而分离胶为pH8.9的Tris-HCl缓冲液。(3)在电场中形成不连续的电位梯度。在这样一个不连续的系统里，存在三种物理效应，即电荷效应、分子筛效应和浓缩效应。在这三种效应的共同作用下，待测物质被很好地分离开来。 4(该酶活性染色过程如下:过氧化物酶分解HO产生氧基，后者使联大茴香胺发生反22 应生成褐色化合物。所以用染色液浸泡凝胶时，有过氧化物酶同工酶蛋白质条带的部位便出现褐色的谱带。 实验十三 维生素C的含量测定 一、目的 学习和掌握用2,6-二氯酚靛酚滴定法测定植物材料中抗坏血酸含量的原理与方法。 二、原理 维生素C是人类营养中最重要的维生素之一，它与体内其它还原剂共同维持细胞正常的氧化还原电势和有关酶系统的活性。维生素C能促进细胞间质的合成，如果人体缺乏维生素C时则会出现坏血病，因而维生素C又称为抗坏血酸。水果和蔬菜是人体抗坏血酸的主要来源。不同栽培条件、不同成熟度和不同的加工贮藏方法，都可以影响水果、蔬菜的抗坏血酸含量。测定抗坏血酸含量是了解果蔬品质高低及其加工成效的重要指标。 2,6-二氯酚靛酚是一种染料，在碱性溶液中呈蓝色，在酸性溶液中呈红色。抗坏血酸具有强还原性，能使2,6-二氯酚靛酚还原褪色，其反应如下: O ClC -CHOONO+O CHO Cl(蓝 色)CH -+HOHCHHO CHOH2Cl 抗坏血酸 OHON Cl 2,6-二氯酚靛酚 (红 色) O C ClCOO COOHHON+ HCHClHOCH还原型2,6-二氯酚靛酚 (无 色)CHOH2 脱氢抗坏血酸 当用2,6-二氯酚靛酚滴定含有抗坏血酸的酸性溶液时，滴下的2,6-二氯酚靛酚被还原成无色;当溶液中的抗坏血酸全部被氧化成脱氢抗坏血酸时，滴入的2,6-二氯酚靛酚立即使溶液呈现红色。因此用这种染料滴定抗坏血酸至溶液呈淡红色即为滴定终点，根据染料消耗量即可计算出样品中还原型抗坏血酸的含量。 三、实验材料、主要仪器和试剂 1(实验材料 取新鲜水果(蔬菜)样品50g，加100g 2,草酸溶液，用组织捣碎机打成匀浆。称取10g匀浆，移入50mL容量瓶，用2,草酸定容至刻度，摇匀后静置备用。 2(仪器 (1)天平 (2)组织捣碎机 (3)容量瓶(50mL) (4)刻度吸管(5mL，10mL) (5)锥形瓶(100mL) (6)碱式滴定管(10mL) 3(试剂 (1)2,草酸 (2)1,草酸 (3)标准抗坏血酸溶液(0.1mg/mL):精确称取50.0mg抗坏血酸，用1,草酸溶液溶解并定容至500mL。临用现配。 (4)0.05,的2,6-二氯酚靛酚溶液:500mg 2,6-二氯酚靛酚溶于300mL含104mg碳酸氢钠(A.R)的热水中，冷却后再用蒸馏水稀释至1 000mL，滤去不溶物，贮棕色瓶内，4?保存一周有效。滴定样品前用标准抗坏血酸标定。 四、操作步骤 1(2,6-二氯酚靛酚溶液的标定:准确吸取4.0mL抗坏血酸标准液(含0.4mg抗坏血酸)于100mL锥形瓶中，加16mL 1,草酸溶液，用2,6-二氯酚靛酚滴至淡红色(15S内不褪色即为终点)。记录所用染料溶液的体积(mL)，计算出1mL染料溶液所能氧化抗坏血酸的量(mg)(记作T)。 2(样品滴定:准确吸取样品提取液(上清液或滤液)两份，每份20.0mL，分别放入两个100mL锥形瓶中，按上面的操作进行滴定并记录所用染料溶液体(mL)。 五、结果计算 取两份样品滴定所用染料体积平均值，代入下式计算100g样品中还原型抗坏血酸的含量: V×T×G×A 抗坏血酸含量(mg/100 g样品), ×100 W×G×A 11 式中:V —— 滴定样品提取液消耗染料平均值(mL) T —— 每mL染料所能氧化抗坏血酸mg数 G —— 匀浆总重量(g) G—— 制备提取液取用匀浆重量(g) 1 A —— 样品提取液定容体积(mL) A—— 滴定时吸取样品提取液体积(mL) 1 W —— 样品重量(g) 六、附 注 (1)样品提取液定容时若泡沫过多，可加几滴辛醇或丁醇消泡。 (2)市售2,6-二氯酚靛酚质量不一，以标定0.4mg抗坏血酸消耗2mL左右的染料为宜， 可根据标定结果调整染料溶液浓度。 (3)样品的提取液制备和滴定过程，要避免阳光照射和与铜、铁器具接触，以免抗坏血酸被破坏。 (4)滴定过程宜迅速，一般不超过2min。样品滴定消耗染料1,4mL为宜，如果超出此范围，应增加或减少样品提取液用量。像番茄、柑桔等维生素C含量高的试材，可称取5g样品，加少许2%草酸研磨，定容到50mL，再离心或过滤;吸取20mL两份，分别滴定，记录消耗的染料量。按下式计算维生素C含量。 V×T×A 维生素C含量(mg/100 g样品), ×100 W×A 1 式中:V —— 滴定样品提取液消耗染料平均值(mL) T —— 每mL染料所能氧化抗坏血酸mg数 A —— 样品提取液定容体积(50mL) A —— 滴定时吸取样品提取液体积(20mL) 1 W —— 样品重量(5g) 七、思考题 1( 1( 该法测定抗坏血酸有何不足, 2( 2( 用2%草酸提取样品的目的是什么, 参考答案 1(用本法测定抗坏血酸含量虽简便易行，可以一次测定大量的样品。但有下述缺点:第一，本法只能测定还原型抗坏血酸，不能测出具有同样生理功能的氧化型抗坏血酸和结合型抗坏血酸。第二，样品中的色素经常干扰对终点的判断，可预先用白陶土脱色，或加入2,3ml二氯乙烷，以二氯乙烷层变红为终点。 2(用2,草酸制备样品提取液，可有效地抑制抗坏血酸氧化酶，以免抗坏血酸为氧化2，型而无法滴定。如果样品中有较多亚铁离子(Fe)时，亦会使染料还原而影响测定，这时应改为8,乙酸制备样品提取液。 实验十四 植物DNA的提取与测定 一、目的 随着基因工程等分子生物学技术的迅速发展及广泛应用，人们经常需要提取高分子量的植物DNA，用于构建基因文库、基因组 southern分析、酶切及克隆等，这是研究基因结构和功能的重要步骤。本实验目的是学习从植物材料中提取和测定DNA的原理并掌握CTAB提取DNA的方法，进一步了解DNA的性质。 二、原理 细胞中的DNA绝大多数以DNA-蛋白复合物(DNP)的形式存在于细胞核内。提取DNA时，一般先破碎细胞释放出DNP，再用含少量异戊醇的氯仿除去蛋白质，最后用乙醇把DNA 从抽提液中沉淀出来。DNP与核糖核蛋白(RNP)在不同浓度的电解质溶液中溶解度差别很大，利用这一特性可将二者分离。以NaCl溶液为例:RNP在0.14mol/L NaCl中溶解度很大，而DNP在其中的溶解度仅为纯水中的1,。当NaCl浓度逐渐增大时，RNP的溶解度变化不大，而DNP的溶解则随之不断增加。当NaCl浓度大于1mol/L时，DNP的溶解度最大，为纯水中溶解度的2倍，因此通常可用1.4mol/L NaCl提取DNA。为了得到纯的DNA制品，可用适量的RNase处理提取液，以降解DNA中搀杂的RNA。 关于植物总DNA的提取主要有两种方法: 1( CTAB法: CTAB(十六烷基三甲基溴化铵，hexadecyltrimethylammonium bromide, 简称CTAB):是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中(0.7mol/L NaCl)是可溶的，当降低溶液盐的浓度到一定程度(0.3 mol/L NaCl)时从溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB与核酸的复合物同蛋白、多糖类物质分开，然后将CTAB与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液中，再加入乙醇使核酸沉淀，CTAB能溶解于乙醇中。 2( SDS法: 利用高浓度的阴离子去垢剂SDS(十二烷基磺酸钠，Sodium dodecyl sulfate, 简称SDS)使DNA与蛋白质分离，在高温(55,65?)条件下裂解细胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸，然后采用提高盐浓度及降低温度的方法使蛋白质及多糖杂质沉淀，离心后除去沉淀，上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。 79一般生物体的基因组DNA为10~10bp，在基因克隆工作中，通常要求制备的大分子DNA的分子量为克隆片段长度的4倍以上，否则会由于制备过程中随机断裂的末端多为平末端，导致酶切后有效末端太少，可用于克隆的比例太低，严重影响克隆工作。因此有效制 )尽量去除蛋白质、RNA、次生代谢物质(如备大分子DNA的方法必须考虑两个原则:(1 多酚、类黄酮等)、多糖等杂质，并防止和抑制内源DNase对DNA的降解。(2)尽量减少对溶液中DNA的机械剪切破坏。 2+2+几乎所有的DNase都需要Mg或Mn为辅因子，故实现(1)尽量去除蛋白质的要求，需加入一定浓度的螯合剂，如EDTA、柠檬酸，而且整个提取过程应在较低温度下进行(一般利用液氮或冰浴)。为实现(2)需要在DNA处于溶解状态时，尽量减弱溶液的涡旋，而且动作要轻柔，在进行DNA溶液转移时用大口(或剪口)吸管。 提取的DNA是否为纯净、双链、高分子的化合物，一般要通过紫外吸收、化学测定、“熔点”(melting temperature, Tm)测定、电镜观察及电泳分离等方法鉴定。本实验采用CTAB法提取DNA并通过紫外吸收法鉴定。 三、实验材料、主要仪器和试剂 1(实验材料 新鲜菠菜幼嫩组织、花椰菜花冠或小麦黄化苗等 2(主要仪器 (1)高速冷冻离心机 (2)751型分光光度计 (3)恒温水浴 (3)液氮或冰浴设备 (4)磨口锥形瓶 (5)核酸电泳设备 3(试剂(CTAB法) (1)CTAB提取缓冲液:100 mmol/L Tris-HCl (pH8.0)，20 mmol/L EDTA-Na，1.4mol/L 2NaCl(如表1)，2% CTAB，使用前加入0.1%(V/V)的β-巯基乙醇。 表1 CTAB提取缓冲液配制 *试剂名称 M.W. 配制1 000mL 配制500mL Tris 121.14 12.114g 6.057g EDTA-Na 372.24 7.4448g 3.7224g 2 NaCl 58.44 81.816g 40.908g * 用HCl调pH值。 (2)TE缓冲液:10mmol/L Tris-HCl, 1mM EDTA( pH8.0)。 (3) DNase-free RNase A: 溶解RNase A于TE缓冲液中，浓度为10mg/mL，煮沸10,30min, 除去DNase活性，,20?贮存(DNase为DNA酶，Rnase为RNA酶)。 (4)氯仿-异戊醇混合液(24:1，V/V):240mL氯仿(A.R.)加10mL异戊醇(A.R.)混匀。 (5)3mol/L乙酸钠(NaAc，pH6.8):称取NaAc?3HO 81.62g，用蒸馏水溶解，配制2 成200mL，用HAc调pH至6.5。 (6)95,乙醇 pH8.0)液，NaAc溶液均需要高压灭菌。 TE缓冲液，Tris-HCl( 四、操作步骤 1( 称取2,5g新鲜菠菜幼嫩组织或小麦黄花苗等植物材料，用自来水、蒸馏水先后冲洗叶面，用滤纸吸干水分备用。叶片称重后剪成1cm长，置研钵中，经液氮冷冻后研磨成粉末。待液氮蒸发完后，加入15mL预热(60,65?)的CTAB提取缓冲液，转入一磨口锥形瓶中，置于65?水浴保温，0.5~1h，不时地轻轻摇动混匀。 2(加等体积的氯仿/异戊醇(24:1)，盖上瓶塞，温和摇动，使成乳状液。 3(将锥形瓶中的液体倒入离心管中，在室温下4 000r/min离心5min，静置，离心管中出现3层，小心地吸取含有核酸的上层清液于量筒中，弃去中间层的细胞碎片和变性蛋白以及下层的氯仿。 4(根据需要，上清液可用氯仿/异戊醇反复提取多次。 5(收集上层清液，并将其倒入小烧杯。沿烧杯壁慢慢加入1,2倍体积预冷的95,乙醇，边加边用细玻棒沿同一方向搅动，可看到纤维状的沉淀(主要为DNA)迅速缠绕在玻棒上。小心取下这些纤维状沉淀，加1,2 mL 70%乙醇冲洗沉淀，轻摇几分钟，除去乙醇，即为DNA粗制品。 6(上述DNA粗制品含有一定量的RNA和其它杂质。若要制取较纯的DNA，可将粗制品溶于TE缓冲液中，加入10mg/mL的RNase溶液，使其终浓度达50μg/mL，混合物于37?水浴中保温30min除去RNA。重复步骤2,5的操作，可制得较纯的DNA制品。 7(将DNA制品溶于250μL的TE缓冲液中，完全溶解DNA样品。 8(加入1/10倍体积的3mol/L NaAc(pH6.8)和2倍体积的95,乙醇，沉淀DNA，重复步骤5。最后，将DNA溶于250μL 的TE缓冲液中。 9(在751型分光光度计上测定该溶液在260nm紫外光波长下的光密度值。代入下式计 算DNA的含量。 四、结果计算 OD 260nmDNA浓度(μg/mL), ×稀释倍数 0.020×L 式中OD为260nm处的光密度;L为比色杯光径(cm);0.020为1μg/mL DNA钠盐的260nm 光密度。 DNA的紫外吸收高峰为260nm，吸收低峰为230nm，而蛋白质的紫外吸收高峰为280nm。上述DNA溶液适当稀释后，在751分光光度计上测定其OD、OD和OD。如260nm230nm280nmOD/ OD?2，OD/ OD?1.8，表示RNA已经除净，蛋白含量不超过0.3,。 260nm230nm260nm280nm 五、附 注 如果植物样品不经液氮处理，提取液中的CTAB浓度需要提高到4%(W/V)。在许多情况下，使用0.1%(V/V)巯基乙醇，并不能完全抑制叶片中的氧化作用，但是，这种氧化作用不会影响限制性内切酶的活性。如果使用的巯基乙醇浓度高于0.1%(V/V)，则会大大降低DNA的得率。 六、思考题 1(制备的DNA在什么溶液中较稳定? 2(为了保证植物DNA的完整性，在吸取样品、抽提过程中应注意什么, 参考答案 2+1(制备的DNA在:(1)含有螯和剂如EDTA中较稳定，因为EDTA能螯和Mg或2+Mn离子，抑制DNase;(2)在pH5,9之间较稳定，否则过酸过碱会破坏DNA的结构;(3)有一定离子强度(强度越高, DNA越稳定)的溶液中较稳定。 (TE满足以上要求, 但如需对所得DNA进行酶切, EDTA浓度不可过高, 一般用0.1×TE或0.2×TE)。 2(为了保证植物DNA的完整性:(1)整个提取过程应在较低温度下进行(一般利用液氮或冰浴);这样可防止和抑制内源DNase对DNA的降解;(2)当DNA处于溶解状态时，要尽量减弱溶液的涡旋，动作要轻柔;在进行DNA溶液转移时用大口(或剪口)吸管，尽量减少对溶液中DNA的机械剪切破坏。 实验十五 质粒DNA的提取、酶切与鉴定 一、目的 掌握质粒的小量快速提取法;了解质粒酶切鉴定原理。 二、原理 质粒(plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子。大小在1~200kb之间，具有双链闭合环状结构的DNA分子。主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中。质粒具有自主复制和转录能力，能使子代细胞保持它们恒定的拷贝数，可表达它携带的遗传信息。他可独立游离在细胞质内，也可整合到细菌染色体中，它离开宿主的细胞就不能存活，而它控制的许多生物 学功能却赋予宿主细胞的某些表型。 所有分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤:培养细菌使质粒扩增;收集和裂解细菌;分离和纯化质粒DNA。采用溶菌酶可破坏菌体细胞壁，十二烷基磺酸钠(Sodium dodecyl sulfate, SDS)可使细胞壁裂解，经溶菌酶和阴离子去污剂(SDS)处理后，细菌DNA缠绕附着在细胞壁碎片上，离心时易被沉淀出来，而质粒DNA则留在上清液中。用酒精沉淀洗涤，可得到质粒DNA。 67质粒DNA分子量一般在10~10道尔顿范围内。在细胞内，共价闭环DNA(covalently closed circular DNA，简称cccDNA)常以超螺旋形式存在。若两条链中有一条链发生一处或多处断裂，分子就能旋转而消除链的张力，这种松弛型的分子叫作开环DNA(open circular DNA, 简称ocDNA)。在电泳时，同一质粒如以cccDNA形式存在，它比其开环和线状DNA的泳动速度都快，因此在本实验中，质粒DNA在电泳凝胶中呈现3条区带。 限制性内切酶是一种工具酶，这类酶的特点是具有能够识别双链DNA分子上的特异核苷酸顺序的能力，能在这个特异性核苷酸序列内，切断DNA的双链，形成一定长度和顺序DNA片段。如:EcoR?和Hind?的识别序列和切口是: EcoR?:G?AATTC Hind?:A?AGCTT G，A等核苷酸表示酶的识别序列，箭头表示酶切口。限制性内切酶对环状质粒DNA有多少切口，就能产生多少酶切片段，因此鉴定酶切后的片段在电泳凝胶的区带数，就可以推断酶切口的数目，从片段的迁移率可以大致判断酶切片段大小的差别。用已知分子量的线状DNA为对照，通过电泳迁移率的比较，就可以粗略推测分子形状相同的未知DNA的分子量。 三、 实验材料、主要仪器和试剂 1(主要仪器 (1)塑料离心管1.5mL×30 (2)塑料离心管架×1 (3)微量加样器10μL、100μL、1 000μL各一支 (4)常用玻璃仪器及滴管等 (5)台式高速离心机(20 000r/min) (6)电泳仪 (7)电泳槽 (8)样品槽模板 2(材料 大肠杆菌DH5α 3(试剂 (1)pH8.0 G.E.T 缓冲液(50mmol/L葡萄糖，10 mmol/L EDTA，25mmol/L Tris-HCl);用前加溶菌酶4mg/mL。 (2)pH 4.8乙酸钾溶液(60mL 5mol/L KAc，11.5mL冰乙酸，28.5mL HO) 2 (3)酚/氯仿(1?1，V/V):酚需在160?重蒸，加入抗氧化剂8-羟基喹啉，使其浓度为0.1%，并用Tris-HCl缓冲液平衡两次。氯仿中加入异戊醇，氯仿/异戊醇(24?1，V/V)。 (4)pH 8.0 TE缓冲液:10mmol/L Tris，1mmol/L EDTA，其中含有RNA酶(RNase)20μg/mL。 (5)TBE缓冲液:称取Tris10.88g、硼酸5.52g和EDTA 0.72g，用蒸馏水溶解后，定容至200mL，用前稀释10倍。 (6)EB染色液:称取5g溴化乙锭(Ethidium Bromide，EB)，溶于蒸馏水中并定容到10mL，避光保存。临用前，用电泳缓冲液稀释1 000倍，使其最终浓度达到0.5μg/mL。 四、操作步骤 1(培养细菌 将带有质粒的大肠杆菌DH5α接种在LB琼脂培养基上，37?培养24~48h。 2(从细菌中快速提取制备质粒DNA (1)用3~5根牙签挑取平板培养基上的菌落，放入1.5mL小离心管中，或取液体培养菌液1.5 mL置小离心管中，10 000r/min离心1min去掉上清液。加入150μL 的G.E.T.缓冲液，充分混匀，在室温下放置10min。 (2)加入200μL新配置的0.2mol/L NaOH，1%SDS。加盖，颠倒2 ~ 3次使之混匀。冰上放置5 min。 (3)加150μL冷却的乙酸钾溶液，加盖后颠倒数次混匀，冰上放置15 min。10 000r/min离心5 min，上清液倒入另一离心管中。 (4)向上清液中加入等体积酚/氯仿，震荡混匀，10 000r/min离心2 min，将上清液转移至新的离心管中。 (5)向上清液中加入等体积无水乙醇，混匀，室温放置2 min。离心5 min，倒去上清乙醇溶液，将离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体。 (6)加1mL 70%乙醇，震荡并离心，倒去上清液，真空抽干，待用。 3( 质粒DNA的酶解 将自提质粒加入20μL的 TE缓冲液，使 DNA完全溶解。取清洁、干燥、灭菌的具塞离心管编号用微量加样器按表1所示将各种试剂分别加入每个小离心管内。 表1 DNA酶切加样表 *管 号 标准样品 (μL) 标准样品自提样品质内切酶EcoRI EcoRI酶切缓冲水 λDNA(μg) PBR322(μg) 粒(μL) (μ) 液10×(μL) 1 10 2 8 2 10 4 2 3 0.5 2 4 1 4 2 5 0.5 4 2 6 10 4 2 8 7 10 2 8 * 补无菌双蒸水至20μL，依实际情况做相应调整 加样后，小心混匀，置于37?水浴中，酶解2~3h，反应终止后，各酶切样品于冰箱中贮存备用。 4(DNA琼脂糖凝胶电泳 (1)琼脂糖凝胶的制备:称取0.6g琼脂糖，置于三角瓶中，加入50 mL TBE缓冲液，经沸水浴加热全部融化后，取出摇匀，此为1.2%的琼脂糖凝胶。 (2)胶板的制备:取橡皮膏(宽约1cm)将有机玻璃板的边缘封好，水平放置，将样品槽板垂直立在玻璃板表面。将冷却至65?左右的琼脂糖凝胶液，小心倒入凝胶液，使胶液缓慢展开，直到在整个玻璃板表面形成均匀的胶层，室温下静置30 min，待凝固完全后，轻轻拔出样品槽模板，在胶板上即形成相互隔开的样品槽。用滴管将样品槽内注满TBE缓冲液以防止干裂，制备好胶板后立即取下橡皮膏，将胶板放在电泳槽中使用。 (3)加样:用微量加样器将上述样品分别加入胶板的样品小槽内。每次加完一个样品，要用蒸馏水反复洗净微量加样器，以防止相互污染。 5( 电泳 加完样品后的凝胶板，立即通电。样品进胶前，应使电流控制在20mA，样品进胶后电压控制在60~80V，电流为40~50 mA。当指示前沿移动至距离胶板1~2cm处，停止电泳。 6( 染色 将电泳后的胶板在EB染色液中进行染色以观察在琼脂糖凝胶中的DNA条带。 五、结果与观察 在波长为254nm的紫外灯下，观察染色后的电泳胶板。DNA存在处显示出红色的荧光条带。 六、思考题 1(染色体DNA与质粒DNA分离的主要依据是什么, 2(EB染料有哪些特点,在使用时应注意些什么, 参考答案 1( 纯化DNA的方法主要依据染色体DNA比质粒DNA分子大得多，而且染色体DNA被断裂成线状分子，但质粒DNA为共价闭环结构，当加热或用酸、碱处理DNA溶液时，线状染色体DNA容易发生变性，共价闭环的质粒DNA在冷却和回到中性pH时即恢复其天然构象。 2(EB染料的全名是3,8-二氨基-5-乙基-6苯基菲啶溴盐。EB能插入DNA分子中碱基对之间，导致EB与DNA结合，DNA所吸收的260nm的紫外光传递给EB，或者结合的EB本身在300nm和360nm 吸收的射线均在可见光谱的红橙区，以560 nm波长发射出来。EB染料有许多优点，如染色操作简便、快速，室温下染色15~20min;不会使核酸断裂;灵敏度高，10ng或更少的DNA即可检出。 但应特别注意的是，EB是诱变剂，配制和使用EB染色液时，应带乳胶手套或一次性手套，并且不要将该染色液洒在桌面或地面上，凡是沾污EB的器皿或物品，必须经专门处理后，才能进行清洗或弃去。 实验十六 紫外吸收法测定核酸的含量 一、目的 学习紫外分光光度法测定核酸含量的原理和操作方法，熟悉紫外分光光度计的基本原理 和使用方法。 二、原理 核酸、核苷酸及其衍生物的分子结构中的嘌呤、嘧啶碱基具有共轭双健系统(,C,C一C,C一)，能够强烈吸收250~280nm波长的紫外光。核酸(DNA，RNA)的最大紫外吸收值在260nm处。遵照Lambert-Beer定律，可以从紫外光吸收值的变化来测定核酸物质的含量。 在不同pH溶液中嘌呤、嘧啶碱基互变异构的情况不同，紫外吸收光也随之表现出明显的差异，它们的摩尔消光系数也随之不同。所以，在测定核酸物质时均应在固定的pH溶液中进行。 核酸的摩尔消光系数(或吸收系数)，通常以ε(ρ)来表示，即每升含有一摩尔核酸磷的溶液在260nm波长处的消光值(即光密度，或称为光吸收)。核酸的摩尔消光系数不是一个常数，而是依赖于材料的前处理、溶液的pH和离子强度发生变化。它们的经典数值(pH = 7.0)如下: DNA的ε(ρ)= 6 000 ~ 8 000 RNA的ε(ρ)= 7 000 ~ 10 000 小牛胸腺DNA钠盐溶液(pH = 7.0)的ε(ρ)= 6 600，DNA的含磷量为9.2%，含1μg/mL DNA钠盐的溶液光密度为0.020。RNA溶液(pH = 7.0)的ε(ρ)= 7 700~7 800，RNA的含磷量为9.5%，含1μg /mL RNA溶液的光密度为0.022~0.024。采用紫外分光光度法测定核酸含量时，通常规定:在260nm波长下，浓度为1μg/mL的 DNA溶液其光密度为0.020，而浓度为1μg/mL的RNA溶液其光密度为0.024。因此，测定未知浓度的DNA(RNA)溶液的光密度OD，即可计算测出其中核酸的含量。 260nm 该法简单、快速、灵敏度高，如核酸3μg,mL的含量即可测出。对于含有微量蛋白质和核苷酸等吸收紫外光物质的核酸样品，测定误差较小，若样品内混杂有大量的上述吸收紫外光物质，测定误差较大，应设法事先除去。 由于降解或水解作用，核酸的光密度可以增高约40,，这就是众所周知的增色效应(hyperchromic effect)。在大分子的核酸中，氢键和π-键相互作用改变了碱基的共振行为。因此，核酸的光密度低于构成它的核苷酸的光密度，该现象称为减色效应(hypochromic effect)。 三、实验材料、主要仪器和试剂 1(试材:核酸样品DNA或RNA。 2( 2( 主要仪器 (1)分析天平 (2)紫外分光光度计 (3)冰浴或冰箱 (4)离心机 (5)离心管(10mL) (6)烧杯(10mL) (7)容量瓶(50mL、100mL) (8)移液管(0.5ml、2mL和5mL) (9)药品勺和玻璃棒 (10)试管和试管架。 3(试剂 (1)5%~6%氨水:用25%~30,氨水稀释5倍。 (2)钼酸铵-过氯酸试剂:取3.6mL70%过氯酸和0.25g钼酸铵溶于96.4mL蒸馏水中。 四、操作步骤 1(核酸样品纯度的测定 (1)准确称取待测的核酸样品0.5g，加少量蒸馏水(或无离子水)调成糊状，再加适量的水，用5%~6%氨水调至pH7，定容至50mL。 (2)取两支离心管，甲管内加入2mL样品溶液和2mL蒸馏水;乙管内加入2mL样品溶液和2mL沉淀剂(沉淀除去大分子核酸，作为对照)。混匀，在冰浴(或冰箱)中放置30min，3 000r/min离心10min。从甲、乙两管中分别取0.5mL上清液，用蒸馏水定容至50mL。选用光程为1cm的石英比色杯，在260nm波长下测其光密度。 (3)计算 甲OD,乙OD260nm260nm(μg/mL)0.020(0.024)DNA(或RNA),，100样品浓度(μg/mL) 60.5(g)0.5，10(μg)上式中样品浓度,,,50(μg/mL)445010(mL)50，，(mL)20.5 如果待测的核酸样品不含酸溶性核苷酸或可透析的低聚多核苷酸，则可将样品配制成一定浓度的溶液(20~50μg/mL)在紫外分光光度计上直接测定。 2(核酸溶液含量的测定 当待测的核酸样品中含有酸溶性核苷酸或可透析的低聚多核苷酸，在测定时需要加钼酸铵-过氯酸沉淀剂，沉淀除去大分子核酸，测定上清液260 nm处光密度作为对照。 (1)取2支离心管，每管各加入2mL待测的核酸溶液，再向甲管内加2mL蒸馏水，向乙管内加2mL沉淀剂。混匀，在冰浴(或冰箱)中放置10min，3 000r/min离心10min。将甲、乙两管清液分别稀释至光密度在0.1~1.0之间。选用光程为1cm的石英比色杯，在260nm波长下测其光密度OD。 260nm (2)计算 甲,乙ODOD260nm260nm(或)含量(,/),，稀释倍数DNARNAgmL0.020(或0.024) 五、思考题 1(采用紫外光吸收法测定样品的核酸含量，有何优点及缺点, 2(若样品中含有核苷酸类杂质，应如何校正, 参考答案 1(用紫外光吸收法测定样品的核酸含量，具有简单、快速、灵敏度高的优点，并且待测核酸样品中含有的微量蛋白质和核苷酸等吸收紫外光物质，产生较小测定误差。但该法在测定样品内混杂有大量的上述吸收紫外光物质时，则会产生较大测定误差，需要设法事先除去。 2(当样品中含有核苷酸类杂质时，需要加钼酸铵-过氯酸沉淀剂处理，沉淀除去大分子核酸，测定上清液260 nm处光密度，以此作为对照;再从未加沉淀剂测得的样品液260nm光密度中扣除。 六、附 注: 化学法测定DNA的含量——二苯胺显色法 (一)原理 DNA在酸性条件下加热，其嘌呤碱与脱氧核糖间的糖苷键断裂，生成嘌呤碱、脱氧核糖和脱氧嘧啶核苷酸，而2-脱氧核糖在酸性环境中加热脱水生成ω-羟基-γ-酮基戊糖，与二苯胺试剂反应生成蓝色物质，在595nm波长处有最大吸收。DNA在40~400μg范围内，光吸收与DNA的浓度成正比。在反应液中加入少量乙醛，可以提高反应灵敏度。 NHCHOCHO HCHHCH+H HCH蓝色物质HCOH ,HO2COCHOH OHCH2CHOH2 脱氧核糖ω-羟基-γ-酮基戊醛 (二)试剂及器材 1( DNA标准溶液 准确称取小牛胸腺的DNA钠盐，以0.01mol,L NaOH溶液配成200μg,mL的溶液。 2( 测定样品溶液 L NaOH溶液配成100~150μg,mL的溶液。准确称取干燥的DNA制品，以0.01mol, 若要测定RNA制品中的DNA含量，样品中至少要含有DNA 20μg,mL 才能进行测定。 3( 二苯胺试剂 称取1g二苯胺， 溶于100mL的分析纯的冰乙酸中，再加入60,以上的过氯酸10mL，混匀待用。临用前加入1mL的1.6,乙醛，配好的试剂应为无色。 4(分光光度计 (三)操作方法 (1 制作DNA标准曲线:取12支洁净干燥试管按表1加入试剂: 表1 DNA标准曲线制作 管号 DNA标准溶液(mL) HO(mL) 二苯胺试剂(mL) DNA含量(μg) 2 1，2 0 2.0 4 0 3，4 0.4 1.6 4 80 5，6 0.8 1.2 4 160 7，8 1.2 0.8 4 240 9，10 1.6 0.4 4 320 11，12 2.0 0 4 400 按上表加完各试剂后，充分混匀。于60?水浴中保温1h，冷却后于595nm波长处以1，2管为空白调零，测定各管光密度(OD)。取两管的平均值，以DNA的含量为横坐标，595nm 光密度为纵坐标，绘制标准曲线。 2( 样品DNA含量测定:取2支干净试管按表2加入试剂，其它操作同上。 表2 样品DNA含量测定 *管号 DNA待测溶液(mL) 二苯胺试剂(mL) OD DNA含量(μg) 595nm 1’ 2 4 2’ 2 4 *待测溶液中的DNA含量应调整至标准曲线的可读范围内。 3( DNA含量计算:以样品的光密度，从标准曲线上查出相对应DNA含量，按下式 计算出样品中DNA的百分含量。 待测液中测得的DNA量(μg) DNA(%)= ×100 待测液中样品的量(μg) 附 注:二苯胺试剂具有腐蚀性，且二苯胺反应产生的蓝色不易褪色，操作中应防止洒出，比色时，比色杯外面一定要擦干净。