【doc】鸡胚蛋中水溶性维生素的测定及其孵化期间的变化

【doc】鸡胚蛋中水溶性维生素的测定及其孵化期间的变化 鸡胚蛋中水溶性维生素的测定及其孵化期 间的变化 第28卷第2期 2012年3月 00D&MACHIRY ; Vol_28,No.2 Mar.2012 鸡胚蛋中水溶性维生素的测定及其孵化期间的变化 Detectionofwater—solutionvitaminsinembroynatedeggs anditschangesduringincubate 范亮.张或陈历俊姜铁民 ,Liang'ZHANGCHENLi-junJIANGTie—in (1.大连工业大学,辽宁大连116034;2.北京三元食品股份有限公司,北京100085) (1.DalianPo,,ef0ogUniversity,Dalian,Liaoningl16034,China; 2.BeijingSanyuanCo.,Ltd,Beijing100085,China) 摘要:对鸡胚蛋中水溶性维生素的色谱测定方法进行优化和 验证,5种维生素的加标回收率均在9O以上,且在0.1, 5O/xg/mI具有良好的线性相关性;采用RP—HPIC对不 同胚龄(即入孵的第0,2,4,6,8,10,l2,14,16和l8天)肉鸡 胚胎发育过程中的5种水溶性维生素(核黄素,烟酸,烟酰 胺,吡哆醇和叶酸)进行测定与分析,并与鲜蛋进行对比.结 果表明,随着孵化时间的延长,维生素B,烟酸和叶酸3种维 生素均有不同程度的增加,其中烟酸增加3.2倍,维生素Bz 增加31;叶酸在12d达到最高,比鲜蛋约增加1倍;未能 检测出维生素B和烟酰胺. 关键词:鸡胚蛋;水溶性维生素;核黄素;烟酸;叶酸 Abstract:Theassessmentandvalidationofreliableandanalytical methodforthedeterminationofwater—so1uti0nvitamins,Therecov eryofthefivekindsofvitaminsaremorethan90anditappearsa verygoodlinearityduring0.1,50t~g/mI.ARP—HPICmethod wasputtousetodetectfivewatersolublevitamins(riboflavin,,nia cin,niacinamide,pyridoxinfolicacid)indifferentincubateperiod(the 0,2-n,4m,6,8th,10,l21h,14,16hand18dayafterincubate) embroynatcdeggsandmadeacomparisonwiththefreshegg,there suitsindicatedthatastheincubategoeson,thecontentofriboflavin, niacinandfoliCacidhadmadeaincreaseatdifferentJevel,thecontent ofniacininthe18dayofembroynatedeggsis3.2timesthanfresh eggs,astoriboflavin,thisamountis31,thebiggestcontentoffo lieacidappearsthe12day,itisthetwiceamountofthefresheggs, bothofthepyridoxinandniacinamidewerebelowthelimitofdetec— tion. Keywords:embroynatedeggs;water—solutionvitamin;riboflavin;ni acin;folicacid 基金项目:国家"863"(编号:2011AA100903);北京市科技计划 (编号:D10110504600000) 作者简介:范亮(1985),男,大连工业大学在读硕士研究生. Email:fanliang24233@163.corn 通讯作者:陈历俊 收稿日期:20111201 4O 鸡胚蛋是受精鸡蛋孵化至一定天数后,还未破壳,可食 用的鸡蛋,据《本草纲目》记载:"鸡胚蛋有治疗头痛,偏头痛, 头风病及四肢疯障之功能."民间早有食用的习惯,俗称"喜 蛋","毛蛋","活珠子"等.而一个受精鸡蛋能否正常发育, 除了要求有正常的孵化条件外,在一定程度上还取决于孵化 期间内营养成分的变化情况,因此弄清各种营养的代谢变化 规律,对调控禽类胚胎发育,提高孵化率有着重要的意义. 已有学者对鸡胚蛋孵化期间的营养变化情况进行了研 究:李利东等研究发现鸡胚蛋孵化期间多种对人体有益的 营养元素均有所增加,如牛磺酸增加了将近2O倍,V增加 了100倍,钙含量增加6倍多等,对人体不利的脂肪含量 下降5O,胆固醇下降5.5倍等,其研究结果与李国喜等的 研究[2'基本一致;刘娟娟?比较了不同品种鸡胚蛋孵化期 间营养物质的变化规律情况,发现不同品种的鸡胚蛋在孵化 期间变化规律也略有不同,但总体趋势相似;房兴堂等还 对鸡胚蛋的蛋白质脂肪的转化转移进行了一定的研究,发现 胚胎中的蛋白质和脂肪主要来源于蛋黄.但目前还没有对 鸡胚蛋中的一些重要的水溶性维生素进行研究的报道,如参 与体内脂质代谢,组织呼吸的氧化过程和糖类无氧过程的烟 酸和烟酰胺;参与神经递质,糖原,核酸以及所有氨基酸代谢 的维生素B以及对神经细胞与脑发育有促进作用的H十酸 等.因此,本试验分别对不同胚龄鸡胚蛋中的维生素B.,烟 酸,烟酰胺,维生素Be以及叶酸进行检测分析,旨在为人们 食用鸡胚蛋提供科学依据,同时也对鸡胚蛋的深加工提供理 论支持. 1材料与方法 1.1样品 样品取自北京华都食品有限公司,分别取无精蛋,鲜蛋, 安全与检测 0,2,4,6,8,1O,12,14,l6,18d胚龄鸡蛋,去壳后用高速匀浆 机混匀,并分装于一2O?保存待测 1.2主要试剂 盐酸吡哆醇,叶酸,烟酸,烟酰胺和核黄素品:德国 Dr.EhrenstorferGmbH公司; 三氟乙酸:色谱纯,美国Tedia公司; 乙腈:色谱纯,美国Fisher公司; 水:市售娃哈哈纯净水; 其余试剂均为分析纯 1.3主要仪器 高效液相色谱仪:含IC10ATVP二:泵,SPD10Avp紫 外检测器,classvp软件,日本Shimadzu公司; 双光束紫外可见光分光光度计:Cintra20,澳大利亚GBC 公司; 冷冻离心机:2K15,美国Sigma公司; c色谱柱:VenusilXBPC天津博纳杰艾尔科技有限 公司. 1.4标准溶液配制 1.4.1烟酸,烟酰胺,吡哆醇分别取烟酸,烟酰胺和吡哆 醇溶液50mg于50mI容量瓶中,用水溶解并定容至刻 度. 1.4.2叶酸称取10mg叶酸,溶解于0.01mol/L氢氧化 钠乙醇溶液(乙醇:水一1:4)并定容至100mIl7]. 1.4.3核黄素取50mg核黄素溶于0.02mol/I乙酸溶 液中,并定容至500mI棕色容量瓶中. 1.5样品提取 1.5.1核黄素,烟酸,烟酰胺和吡哆醇参照文献[9]提取 烟酸,烟酰胺和维生素Bs,并稍加改动,称取样品1,2g于 150mL三角瓶中,加入0.1M盐酸溶液,于121?水解 30min,冷却后,以2.5M乙酸钠调pH至4.5,转入50mI 容量瓶中,并用水定容至刻度,用0.22ffm过滤后待测. 1.5.2叶酸参照文献[1O]并稍加改动,称取I,2g样品 于I50ml三角瓶中,加入0.026mol/LTric,HC1缓冲溶 液(pH7.4)含有l(?/v)抗坏血酸钠20mI,121?高压 水解20min,转移至5OmL容量瓶中,加人5三氯乙酸 5mI,用超纯水定容至刻度,混匀于4?6000r/min离心 20min,上清液经过0.22ffm滤膜过滤贮存于4?待测. 2结果与讨论 2.1色谱条件优化 采用等度洗脱,流动相为三氟乙酸(TFA)水溶液(含 1g/I庚烷磺酸钠)和乙腈,选用反相(.色谱柱5"m (4.6mm×25cm),本试验研究了不同浓度(3,40%)乙 腈对样品出峰时间的影响,发现高浓度乙腈能缩短出峰时 间,但是会导致烟酸和烟酰胺无法分离,较低浓度乙腈会延 长保留时间.由图1可知,当乙腈浓度为:lO时,可较好的 2012年第2期 分离核黄素,烟酸,烟酰胺和吡哆醇.由图2可知,当乙腈浓 度为l5时,叶酸在25mir内可出峰,且样品分离效果良 好,故将检测叶酸的最适乙腈浓度定为15.此外,流动相 的pH对分离水溶性维生素也至关重要,Ciu1.M等口采 用0.025%TFA水溶液和Z腈梯度洗脱检测蜂蜜中的水溶 性维生素,得到较好的结果.本试验研究了不同浓度的 TFA(O.025t0.1)对维生素分离的影响,结果表明在 较低浓度TFA下叶酸和维生素B2均有拖尾现象,在浓度升 至0.1时,能较好的解决拖尾问题,且分离效果良好. 0.04 ?? 也-40.02 0.00 O10203040 保留时间 Retentiontime/rain (a)标准混合液色谱图 耋耋些 . 01O203040 保留时间 Retentiontime/rain (b)鸡胚蛋提取液色谱图 1.烟酰胺2.烟酸3.核黄素4.吡哆醇 标准混合液及鸡胚蛋提取液色谱图 Chromatogramsofastandardmixtureof nicotinamide,nicotinicacid,riboflavin, pyridoxinandembryoedeggs 在19O,500nm下对5种维生素进行波长扫描,其最大 吸收波长分别为核黄素260nm,盐酸吡哆醇290nm,烟酸和 烟酰胺260nm,叶酸255nm.为方便试验,将盐酸吡哆醇的 吸光值设为290nm,其余均为260nm,该结果也与田颖等的 研究"]一致,柱温采用25?l_】2.". 由图1还可知,4种水溶性维生素的保留时间分别为烟 酰胺tR一15.3min,烟酸tR一18.2min,核黄素R一 38.1rain和吡哆醇t一38.min,但是在样品中没有发现 烟酰胺和吡哆醇,食物营养成分表中也未查到鸡蛋中烟酰 胺和吡哆醇含量,这也与本试验的研究结果一致.由图2还 可知,叶酸的保留时间为t一21.4min. 2.2方法验证 2.2.1检出限进空白样品,以基线3倍噪声值在标准曲 线差得结果计算,测得5种维生素的检出限分别为核黄素 0.12btg/mI烟酸0.075>g/rnI,烟酰胺0.06~g/mI,吡哆 4] 第28卷第2期范亮等:鸡胚蛋中水溶性维生素的测定及其孵化期间的变化 醇0.045ffg/mL,叶酸0.09ffg/mL(表1),而Lebiedzinska 等l所得各种维生素的检测限在0.19,9.2ng/mI,与本试 验结果有较大出入,可能是仪器的不同而造成的. 2.2.2线性范围将逐级稀释的维生素混合标准工作液分 别进样10L,测得结果以峰面积为y对质量浓度 z(ffg/mL)作图,结果见表1.由表1可知,各种维生素在 0.1,50t*g/mL线性关系良好. 耋耋 塞-耋g 保留时间 Retentiontime/rain (a)叶酸标准品溶液 保留时间 Retentionfime/min (b)鸡胚蛋提取液 图2叶酸标准品溶液和鸡胚蛋提取液色谱图 Figure2Chromatogramsofastandard solutionandembryoedeggs 表1方法验证 Table1Validationdata 2.2.3精密度和回收率在上述试验条件下,取混合标准 样品溶液5.0ffg/mI,进样量lOI,平行测定5次,计算其 变异系数,同时取已知浓度的样品,分别加入样品浓度的 5O,100,150的混合标准溶液,按1.5的方法制备后进 行测定,结果(见表1)5种维生素的变异系数在3.34, 6.18(一5),回收率均在9O%以上,Ciulu等[1研究表明各 种维生素的回收率在9O,llO,变异系数在2.6,7.6, 也与本试验结果基本一致. 42 2.3不同胚龄鸡胚蛋中水溶性维生素的含量 通过与水溶性维生素标准混合液的保留时间的对比并 向样品提取溶液中加入已知浓度标准溶液来确定样品中含 有相应的维生素.之后对混标进行分析,待各个样品完全分 离后再分别对单个样品进行分析以确定各个物质的出峰时 间,外标法定量.在线性范围内选取5个不同的浓度制作各 个维生素的标准曲线,结果见表2. 表2不同孵化期间鸡胚蛋水溶性维生素含量变化 Table2Averageconcentrationofwater-solublevitamins ofdifferentperiodembroyed eggsorigin/(mg?kg) 十一b.检出限. 由表2可知,鸡胚蛋中维生素含量有所差别,其中以烟 酸最多,叶酸次之,维生素Bz最少,烟酰胺和维生素B含量 低于检测限. 如果鸡胚蛋中缺乏核黄素,在孵化至1O,14d时会发生 鸡胚死亡.在孵化过程中所检测的维生素Bz的含量增加了 31.2,这与刘娟娟的研究结果略有出入,她所检测的4 个品种的鸡胚蛋在孵化过程中维生素B.含量均略有降低, 但是变化不显着,这可能与维生素B主要以黄素蛋白的辅 酶形式参与生理生化代谢有关_1,自身含量损失不大. 烟酸含量增加3.7倍,且在O,12d烟酸含量增加缓慢, 在12d后迅速增加,一方面这与鸡胚蛋在孵化12d后胎儿 开始大量吞食蛋白羊水导致水分急剧下降有关_1',因未发 现烟酰胺,故烟酸的增加含量并非是烟酰胺转化而来,而在 动物体内,色氨酸可以转化为烟酸,且转化率与肝脏中的色 氨酸加氧酶有很大关系.研究表明,鸡胚在12d时肝脏 生长速度开始加快,有可能在肝脏增重的过程中增加了色氨 酸加氧酶的分泌从而促进了色氨酸一烟酸的转化. 安全与检测 在孵化过程中,叶酸的含量呈现"先增加后减小"的趋 势,且在第12天含量达到最大,比鲜蛋约增加一倍,因为叶 酸无法在体内合成和转化,所以可能的原因是在整个孵化过 程中胚蛋内水分含量大大降低,从而导致干物质含量上 升_1.,而随着孵化的进行,至1O,11d时,胚胎的心脏,肝 脏和大脑等器官生长速度开始加快,并于l6d时达到生长 高峰期,在此过程中鸡胚DNA的合成,神经系统的发育 以及氨基酸的代谢均发生了很大变化,而这些生理反应变化 均依赖叶酸的参与进行,冈此在12d后,叶酸的含量一直处 于逐渐降低.从另一方面讲,如果从补充叶酸含量来考虑, 应该选取12d之前的鸡胚蛋. 3结论 各种维生素在0.1,50/~g/mI均有良好的线性关系,检 测限分别为核黄素0.12~g/mI,烟酸0.0715/,g/mI,烟酰胺 0.06/,g/rnI,吡哆醇0.045/,g/rnI,叶酸0.09,ug/mI,变异 系数在3.34,6.18且回收率均在9O以上.该方法同样也 可用来分析蛋制品的水溶性维生素含量.检测了不同孵化 期间鸡胚蛋中水溶性维生素的含量变化情况,在孵化过程中 核黄素,烟酸和叶酸的含量均有不同程度的增加,其中烟酸 含量增加最多,约增加3.2倍,核黄素增加不明显,而叶酸在 12d时达到最大,并在12d后逐渐降低,整个孵化过程中均 未发现烟酰胺和吡哆醇. 参考文献 1李利东,袁建兴,宓晓黎,等.不同孵化期的鸡旺蛋营养和功效成 分研究[J].食品科学,2004,25(11):287,290 2李国喜,康相涛,韩瑞丽,等.固始鸡孵化期间酲黄胆固醇和粗脂 肪和锌含量分析EJ].湖北农业科学,2006,45(L1):497,499 3李国喜,康相涛,田亚东,等.固始鸡孵化期间蛋壳内钙鳞含量变 化规律研究口].中国农学通报,2006,22(4):4,7 4刘娟娟.不同品种鸡胚蛋孵化期间营养物质的变化[D].泰安:山 东农业大学,2007. 5房兴堂,丁梅,赵春梅.乌骨鸡胚胎发育过程中卵内蛋白质脂肪的 变化研究[J].生命科学研究,2004,8(2):185,188 2012年第2期 6中华人民共和国国家标准.GB5413.15一2010婴幼儿食品和 乳品中烟酸和烟酰胺的测定IS].北京:中国标准出版社,2010. 7中华人民共和国国家标准.GB/T5009.2?——2008食品中叶酸 的测定[s].北京:中国标准出版社,2009. 8中华人民共和国国家标准.GB_,T9695.28——2oo8肉与肉制品 维生素Bz的测定Es].北京:中国标准出版社,2009. 9SNdaw,MBergaentzle,D~oude—Werner,eta1.Extraction proceduresfortheliquidchr0?1atographicdeterminationofthia min,riboflavinandvitaminB6infoodstuffs[J].FoodChemis— try,2000,71(1):129,138 1ORP6oPrieto,DBHaytowitz,JMHolden,eta1.Useofthe affinity/HPlCmethodforquantitativeestimationoffolicacidin enrichedcereal—grainproducts[J].TheJournalofNutrition, 2006,136(12):3079. 1lBAJvanIandeghem,JPuts,HAClaessens.Theanalysisof thiaminanditsderivativesinwholebloodsamplesunderhigh pHconditionsofthemobilephase[J].JournalofChromatogra— phyB,2005,822(1,2):316,321. 12MCiulu,SSolinas,IFloris,eta1.RP——HPICdetermination ofwatersolublevitaminsinhoney[J].Talanta.2010(83): 924,929. 13田颖,黄挺,黎源倩刘军,等.高效液相色谱法同时测定多维元素 片中9种水溶性维生素[J].分析实验室,2O10,29(11):52,56. 14AIebiedzinska,MIMarszall,JKuta,eta1.Reversed—phase high——performanceliquidchromatographymethodwithcoulomet—- ricelectrochemicalandultravic?letdetectionforthequantification ofvitaminsB1(thiamine),B6(pyridoxamine,pyridoxalandpyr idoxine)andB12inanimalandplantfoodsEJ].JournalofChro matographyA,2{)07,1173(1,2):71,8O. 15刘娜,陈大舟,汤桦,等.婴儿配方奶粉中8种水溶性维生素的高 效液相色谱同时测定口].分析测试,2008,27(4):408, 4l1. 16BABowman,RMRussel1.现代营养学[M].北京:北京化学工 业出版社,2004:270,273. 17李碧春,赵东伟,王克华,等.鸡胚胎及其部分组织器官生长发育 的研究[J].江苏农业研究,200l,22(2):39,43. 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