激素性股骨头死血小板和内皮细胞源性膜

激素性股骨头死血小板和内皮细胞源性膜 中国科技论文在线 激素性股骨头死血小板和内皮细胞源性膜 微粒(EMPs)数量的变化及药物干预实验 研究 吴志宏，纪春良，郑敏哲，李辉，邱贵兴，翁习生5 ,中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院骨科～北京 100730, 摘要:目的 探讨在激素诱发血液高凝、易栓状态导致的股骨头缺血坏死发病过程中～血小 板和内皮细胞源性膜微粒的数量的变化～同时在给予干预药物抗骨增生胶囊情况下～观察上 述膜微粒的数量变化。方法 给健康成年新西兰兔肌注射甲泼尼龙～同时对照组肌注相同剂 量的生理盐水～干预组连续给予干预药物～于注射前、注射后 1 天、3 天、7 天、14 天和 28 10 天各抽静脉全血～使用流式细胞仪对 CD31+/CD42b-和 CD31+/CD42b+的膜微粒进行定量测 给予激素肌注后～CD31+/CD42b-和 CD31+/CD42b+的膜微粒显著升高,p<0.05,～ 定。结果 分别在 7 天和 14 天达峰～而干预组的膜微粒在激素和干预药物的共同作用下虽有波动～但 未出现显著差异。结论 应用大剂量糖皮质激素后～兔体内血小板和内皮细胞源性膜微粒数 量显著增加～干预药物能够抑制微粒的产生～或许有助于预防或避免激素诱发股骨头缺血坏 15 死的发生。 关键词:外科学; 激素,细胞膜微粒,股骨头缺血坏死,内皮细胞 Effects of steroid on platelet- and endothelial-derived microparticles with/without an intervention agent 20 WU Zhihong, JI Chunliang, ZHENG Minzhe, Li Hui, QIU Guixing, WENG Xisheng (Department of orthopaedics, Peking union medical college hospital, Beijing 100730) Abstract: Object:To investigate the alterations of platelet- and endothelial-derived microparticles and the change of coagulation in the steroid-induced avascular osteonecrosis of femoral head with/without an intervention agent. Methods:Healthy New Zealand rabbits were injected once intramuscularly with 25 methylprednisolone; the control group were injected once intramuscularly with the same dose of 0.9% NaCl solution; the intervention group received a intervention agent and a injection of methylprednisolone once intramuscularly, The blood sample were collected before injection of methylprednisolone and day 1, day 3, day 7, day 14 and day 28 after the injection. The microparticles expressing CD31+/CD42b- and CD31+/CD42b+ would be measured using flow cytometry. Results: 30 The numbers of PMPs and EMPs increased markedly after steroid administration. on day 7 and 14, The intervention group under the action of the hormone and the drug, The numbers of EMPs despite had fluctuations, but there was no significant difference. Conclusion: High-dose glucocorticosteroid increases the levels of EMP, The intervention agent appeared to have the efficacy to decrease the EMP levels , and can be considered a true target in the pharmacological control of steroid-induced 35 osteonecrosis. Key words: Surgery; steroid; microparticles; osteonecrosis; endothelial 0 引言 激素是股骨头缺血坏死最常见的危险因素之一，认为在 2,3 个月内使用强的松龙或其 40 等效剂量>2 g 的患者与骨坏死相关，低剂量使用激素与骨坏死的发生没有相关性[1,2]。肾上 基金项目:国家自然科学基金资助(30772192)，高等学校博士学科点专项科研基金(20070023044) 作者简介:吴志宏(1965-)，男，主任医师，主要研究方向:骨科学基础与临床研究 通信联系人:翁习生(1963-)，男，主任医师，主要研究方向:骨科学基础与临床研究. E-mail: orthoscience@126.com -1- 中国科技论文在线 腺肾皮质类固醇激素(以下简称激素)如地塞米松，甲强龙等广泛地用于治疗炎症性疾病如 类风湿性关节炎，哮喘，皮炎，自身免疫性疾病如系统性红斑狼疮(SLE)，以及白血病与 肿瘤和癌症的治疗[3]。但是长期应用或短期内大量使用大剂量激素类药物会导致激素性股骨 [4]。激素诱导的股骨头坏死早期是无症状的，激素导致股骨头坏死的发生与症 头坏死的发生 45 状的出现可能间隔几个月甚至几年[5]。 膜微粒(microparticles)，是细胞在活化或凋亡时从胞膜面以生芽方式脱落的一些磷脂 膜包裹的膜性小囊泡结构，是细胞活化或凋亡的标志。膜微粒表面可以表达富含大量凝血因 子膜受体特异性膜蛋白，为凝血酶原反应提供催化表面，因此，在血栓形成和止血的过程中 发挥重要作用。大量研究表明，微粒是检测血栓性疾病的一个重要指标。血小板源性微粒 50 ( platelets derived microparticles, PMPs ) 是 微 粒 的 主 要 来 源 ; 内 皮 细 胞 源 性 膜 微 粒 (endothelial cell derived microparticles, EMPs)产生于内皮细胞的活化或凋亡，它是判断 内皮细胞损伤的标志[6]。研究发现许多累及血管舒张功能、高凝倾向和小血管炎症的疾病， 如重症高血压、冠心病、动脉粥样硬化等与循环系统中细胞膜微粒的种类和数量有着密切的 关系。同时细胞膜微粒参与了细胞凋亡、激活和炎症细胞募集等多种病理生理过程。 55 本实验以健康成年新西兰兔为研究对象，探讨激素是否会导致兔体内的 PMPs 和 EMPs 水平发生变化，研究干扰干预药物(抗骨增生胶囊)[7]是否可以缓解或抑制这种变化，进一 探讨激素导致股骨头坏死的深层原因。 1 对象与方法 1.1 对象 60 健康成年新西兰兔 30 只，雌雄不限，体重 2.78?0.26kg;甲强龙[辉瑞制药(中国)有 限公司];抗骨增生胶囊(江苏康缘药业股份有限公司) 1.2 方法 1.分组:随机分为 3 组，各组动物的体重无显著差异。 A 组 9 只，按与 B 组相同剂量给予臀肌注射生理盐水 1 次。 65 B 组 10 只，给予甲强龙[辉瑞制药(中国)有限公司]20mg/kg 臀肌注射 1 次; C 组 8 只，给予抗骨增生胶囊(江苏康缘药业股份有限公司)灌胃，2.13g/kg，每日一 次，连续 12 天，于第 7 天时给予甲强龙 20mg/kg 臀肌注射 1 次; 2.样本采集: A 组、B 组给药前(0 天)、给药后 1、3、7、14、28 天采血 70 C 组:干预灌胃前(-7 天)、给药前(0 天)、给药后 1、3、7、14、28 天采血。 使用真空采血套装(真空采血针+真空采血管，BD 公司)，经由兔耳缘静脉，在各个 时间点的相同时间(一般在下午 3 点)采血。样本包括用于膜微粒测量的 2ml，枸橼酸纳抗 凝;用于凝血指标测定的样本 2ml 枸橼酸纳按照 1:6 抗凝;用于炎症因子测定的血清 1-1.5ml。 采集后充分摇匀，如发现凝块，则重新采集。 75 3.样本处理: ?本采集 1 小时内进行如下处理。 ?1000 转，24?，离心 10min，去除血细胞。取上清，放入 1.5mlEP 管中。 ?3400 转，24?，离心 10min，去除血小板。取上清，转移到一个新的 1.5mlEP 管中。 得到富含膜微粒的血浆。,80?保存，待测。 80 -2- 中国科技论文在线 4.微粒测定: ?从,80?冰箱中取出待测样本，置于冰水混合物中缓慢溶解。 ?取 50μl 待测放入流式细胞仪检测管中。 ?每管中各加入小鼠抗人(mouse anti-human)PE-CD31 和 FITC-CD42b 4μl，混匀。 85 ?气浴恒温振荡器 100 转/min，室温下孵育 20min。 ?0.22μm 滤膜过滤 PBS。然后加入 1ml 过滤后的 PBS，混匀。 ?加入浓度分别为 104/μl 的 0.8μm 和 3.0μm 标准微粒混合液 10μl 待测。 ?流式细胞仪参数设置:建立前向散射线性与侧向散射对数散点图 FSC LOG-SSC LOG:根据定位对照调整仪器的检测阈值 SSC 的阈值被调至 2，FS 的电压 350，增益 20; SS 的电压 0，增益 20。在此条件下收集和的信号均由 PMP/EMP 和标准微球产生，并 90 在同一条件下测定 1 管仅含去离子水的空白对照以此验证仪器噪音信号的干扰程度。 ?流式细胞仪测定直径为 0.8-3.0μm 之间带有荧光标记的细胞膜微粒，同时收集 20000 个 3.0μm 标准微粒作为计数参照标准。 95 3.0μm 标准颗粒 100 0.8μm 标准颗粒 105 图 1. 流式细胞仪双标法测定细胞膜微 2 结果 1. 各组动物的体重特征 在 A 组、B 组和 C 组之间，体重无显著差异，A 组动物体重为 2.8?0.2 kg，B 组为 2.7 110 ?0.3 kg，C 组为 2.9?0.2 kg。 2(小鼠抗人(mouse anti-human)单克隆抗体(CD31 和 CD42b)与兔相应抗原的交叉 反应 1) 未加入 CD31(即 CD31-Negative)时，C1 范围内微粒为 37.5?4.4(见图 2)，而 加入 CD31 后(即 CD31-Positive)时，C1 范围内微粒为 488.3?168.7(见图 3)，二者存在 115 显著差异(P<0.01);其中 FL2 是 PE-CD31，C1 区是 CD31 阳性细胞，即内皮细胞源性膜 微粒(EMPs)的区域。 2) 未加入 CD42b(即 CD42b-Negative)时，C4 范围内微粒为 78.3?24.6(见图 2)， 而加入 CD42b 后(即 CD42b-Positive)时，C4 范围内微粒为 5444.0?1230.7(见图 3)，二 者存在显著差异(P<0.005);其中 FL1 是 FITC-CD42b，C4 区时 CD42b 阳性细胞，即血小 120 板源性膜微粒(PMPs)的区域。 3) 综上所述，小鼠抗人单克隆抗体(CD31 和 CD42b)能够与兔相应抗原产生交叉反 -3- 中国科技论文在线 应。在流式细胞仪测量中，可以引起带有 CD31 和/或 CD42b 抗原的微粒的显著变化(p<0.01 和 p<0.005)，因此可以用来检测 EMPs 和 PMPs。 表 1. 加入小鼠抗人(mouse anti-human)单克隆抗体(CD31 和 CD42b)前后，膜微粒的变化 125 图 2. 未加入小鼠抗人单克隆抗体(CD31 和 CD42b)的流式细胞仪计数图 130 图 3. 加入小鼠抗人单克隆抗体(CD31 和 CD42b)的流式细胞仪计数图 3. 流式细胞仪分析细胞膜微粒 1)内皮细胞来源的膜微粒(EMP) -4- 中国科技论文在线 A 组(空白对照组):各时间点(1 天、3 天、7 天、14 天、28 天)相对于基线(0 天) 135 无显著变化，图 4 中 A 组曲线平坦，在 14 天时略有升高(无统计学显著性); B 组(激素组):3 天、7 天时相对于基线出现显著升高(p<0.05，见表 2)，图 4 中 B 组 曲线在给药后升高，3 天时达峰，然后逐渐下降至基线水平(第 28 天); C 组(药物干预组):给予干预药物(-7 天)后，图 4 中 C 组曲线出现下降，到 1 天 140 时达到最低点，此后在激素(0 天时给药)和干预药物的双重作用下，曲线上升(基线水平: 3 天)，3 天时达峰，而后随膜微粒下降(见 B 曲线)而下降。 表 2. CD31+/CD42-的细胞膜微粒:内皮细胞来源 145 图 4. 内皮细胞来源的膜微粒 由此我们可以看出，大剂量的糖皮质激素能够增加 EMPs 的数量，而干预药物抗骨增生 150 胶囊能够明显降低 EMPs 的数量。 2)血小板来源膜微粒(PMP) A 组(空白对照组):各时间点(1 天、3 天、7 天、14 天、28 天)相对于基线(0 天) 无显著变化，图 12 中 A 组曲线平坦，在 14 天时略有升高(无统计学显著性); B 组(激素组):给药后(0 天)7 天、14 天时相对于基线(0 天)显著升高(p<0.05， 见表 3)，图 12 中 B 组曲线 14 天时达峰，然后逐渐下降至基线水平(第 28 天); 155 C 组(药物干预组):给予干预药物(-7 天)后，图 12 中 C 组曲线出现下降，到 1 天 时达到第一个最低点，此后在激素(0 天时给药)和干预药物的双重作用下，曲线上升(3 天)，3 天时达峰(基线水平:0 天)，而后下降至第二个最低点并保持低水平波动。 160 -5- 中国科技论文在线 表 3. CD31+/CD42+的细胞膜微粒:血小板来源 图 5. 血小板来源的膜微粒 165 我们可以看出，糖皮质激素同样也能明显增加 PMPs 的数量，在干预药物抗骨增生胶囊 的作用下，PMPs 的数量又被显著降低。 综上所得，大剂量的糖皮质激素能够显著增加 EMPs 和 PMPs 的数量，这可能与激素诱 导的股骨头坏死有关;而干预药物抗骨增生胶囊能够明显降低两种膜微粒的数量，提示抗骨 增生胶囊或许有助于预防或避免激素诱发股骨头缺血坏死的发生。 170 3 讨论 随着激素的广泛应用，激素性股骨头坏死(steraid induced avascularnecrosis of femoral head, SANFH)自 1957 年首次由 Petrogrand 和 Mastomanine 报道以来，其发病率呈逐年增加 趋势，随着糖皮质激素在临床的广泛应用，SANFH 患者数量已占非创伤性股骨头坏死的首 位[8]。 175 虽然激素性股骨头坏死的病因与发病机制还不完全明了，但是血管内凝血和微循环的血 栓形成是非创伤性股骨头坏死各种病因的共同通路，在许多骨坏死患者标本中发现的微循环 血栓也证实了这一点[9]。激素通过使血小板增多，纤维素沉着，导致血液高凝，最终引起动、 静脉血栓。而细胞膜微粒是一种磷脂膜包被的亚细胞单位，具有介导细胞之间信息交流，受 体转换，信号传递，相互联系的作用，因此推测其参与压力、炎症反应等。因此我们推测， 180 激素能够刺激内皮细胞，引起内皮细胞凋亡，释放膜微粒，膜微粒进一步作用于内皮细胞， 使内皮细胞功能受损，从而引起血管血液供应障碍，最终导致股骨头缺血坏死[10]。本研究 通过试验给予兔大剂量激素及干预药物后，观察内皮细胞细胞膜微粒变化，探索膜微粒 与激素性股骨头坏死发生机制的关系。 在炎症因子如 TNF-α、IL-1 等和/或感染因素作用下，内皮细胞表面浆膜形成囊泡状突 185 起并脱落，即 EMPs。它含有胞质成分和结合细胞表面蛋白的负电荷的磷脂。研究表明在体 -6- 中国科技论文在线 内 EMP 是内皮细胞受损的一个标志[11]。内皮细胞在活化或凋亡时释放 EMP[12]。我们的体 外研究表明，激素作用于内皮细胞，可以引起内皮细胞凋亡，EMP 的释放。同样本实验结 果显示，大剂量糖皮质激素作用下，兔体内 EMP 数量显著升高。说明应用大剂量糖皮质激 素后引起内皮细胞受损。内皮细胞损害是许多血管损伤和血栓栓塞性疾病发病的中心环节 190 [13] 。 活化的血小板可表现出多种细胞反应，包括形状的改变、膜糖蛋白的转移和构型的改变、 血小板颗粒内容物的分泌和血小板微粒的形成并脱落。本实验给兔肌肉注射大剂量甲强龙 后，血液 PMP 数量增加，说明大剂量糖皮质激素可以活化血小板。脱落于血小板浆膜的微 小的颗粒富含血小板因子、组织因子和多糖蛋白，具有促凝血和抗凝血的双重作用[14,15]。PMP 195 含有黏附分子，可以黏附于暴露的胶原;另外 PMP 含有凝血因子，而且凝血因子含量要高 于血小板;特异性膜糖蛋白含有促凝活性的磷脂酰丝氨酸等物质，可以为凝血酶原的激活提 供更大的催化面积[16]。PMP 其表面单位面积比血小板能更多的黏附因子 Va、IXa，因此可 以在更短的时间内促进生成凝血酶[17]。同时本实验对 PMP 表面特异性抗原分析表明，在大 剂量糖皮质激素作用下，血小板在释放出大量 PMP 的同时得以活化(CD31 和 CD42b 阳性 200 表达)。血小板的活化是内源性凝血途径启动的基础。在活化的血小板及其释放的富含血小 板因子、组织因子和多种糖蛋白的 PMP 共同作用下，使血液处于高凝易栓状态(ATIII、PC 下降，FIB 升高)。 本研究结果表明，实验组应用大剂量糖皮质激素后，兔体内血小板(PMPs)和内皮细胞 源性膜微粒数量(EMP)显著增加，应用大剂量糖皮质激素时通过使用内皮细胞保护剂并阻 205 止内皮细胞源性微粒的释放，同样或许可以避免凝血途径的激活启动，防止血栓形成、栓塞。 本研究使用抗骨增生胶囊作为干预药物(C 组)，能够在一定程度上降低激素导致的 PMP 和 EMP 的水平升高，并改善了血液高凝状态，具有一定的治疗潜力。 大剂量糖皮质激素可以诱发体内具有高凝血潜质的 PMP 和 EMP 数量的增加，PMP 和 EMP 数量的增加是导致血液处于高凝易栓状态的重要原因之一[18,19,20]。同时，激素导致体内脂肪 210 代谢紊乱，导致脂肪栓及骨内高压，其中高凝血，脂肪代谢紊乱，同时自我修复能力明显减 弱(干细胞活性衰退)可能是激素诱导股骨头坏死的主要机制[21]。而股骨头坏死即为这些 病理机制综合作用的结果。膜微粒将成为预防和控制股骨头坏死的真正有效的靶点。 [参考文献] (References) 215 [1] Sinclair V, Shepard G. 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