转录因子NFIC在人根尖牙乳头干细胞分化中的作用及其机制研究pdf

转录因子NFIC在人根尖牙乳头干细胞分化中的作用及其机制研究pdf 分类号 R781 第四军医大学 U D C 616.31 The Fourth Military Medical University 密 级 公 开 博士学位 转录因子 NFIC 在人根尖牙乳头干细胞 分化中的作用及其机制研究 张 菁培 养 类 别 全日制学 位 类 型 学术学位一级学科专业类 口腔医学二级学科专业研 究 方 向 干细胞分化指 导 教 师 牛忠英 教授培 养 单 位 口腔医院牙体牙髓病科 二 O 一三年五月 独 创 性 声 明 秉承学校严谨的学风与优良的科学道德，本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，不包含本人或他人已申请学位或其他用途使用过的成果。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了致谢。 申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。 论文作者签名: 日期: 保 护 知 识 产 权 声 明 本人完全了解第四军医大学有关保护知识产权的规定，即:研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属第四军医大学。本人保证毕业离校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位仍然为第四军医大学。学校可以公布论文的全部或部分内容(含电子版，保密内容除外)，可以采用影印，缩印或其他复制手段保存论文。学校有权允许论文被查阅和借阅，并在校园网上提供论文内容的浏览和下载服务。同意学校将论文加入《中国优秀博硕士学位论文全文数据库》和编入《中国知识资源总库》，同意按《中国优秀博硕士学位论文全文数据库出版章程》规定享受相关权益。 论文作者签名: 导师签名: 日期: 第四军医大学博士学位论文 目 录缩略语表 1中文摘要 3英文摘要 6前 言 10文献回顾 12正 文 31 第一部分:人根尖牙乳头干细胞的分离、培养及鉴定 31 实验一、人根尖牙乳头干细胞分离、培养 31 1 材料 31 2 方法 31 3 结果 32 4 讨论 34 实验二、 人根尖牙乳头干细胞的鉴定 36 1 材料 36 2 方法 36 3 结果 37 4 讨论 37 第二部分:转录因子 NFIC 对 SCAPs 分化的影响 40 实验一、NFIC 慢病毒过表达载体的构建和过表达 NFIC 细胞系的建立 40 1 材料 40 2 方法 41 3 结果 47 4 讨论 48 实验二、过表达 NFIC 对 SCAPs 增殖、体外成牙/成骨分化的影响 52 1 材料 52 2 方法 52 3 结果 54 4 讨论 60 实验三、过表达 NFIC 对 SCAPs 体外成脂分化能力的影响 63 第四军医大学博士学位论文 1 材料 63 2 方法 63 3 结果 64 4 讨论 64 实验四、沉默 NFIC 对 SCAPs 体外成骨/成牙分化的影响 67 1 材料 67 2 方法 67 3 结果 68 4 讨论 69 实验五、NFIC 对 SCAPs 在裸鼠皮下成骨/成牙分化能力的研究 73 1 材料 73 2 方法 73 3 结果 74 4 讨论 74 第三部分:转录因子 NFIC 在 TGF-β 信号通路调控 SCAPs 分化中的作用 78 实验一、TGF-β1 对 SCAPs 增殖、成牙/成骨分化的影响 78 1 材料 78 2 方法 79 3 结果 80 4 讨论 85 实验二、TGF-β1 对 NFIC 蛋白表达的影响 87 1 材料 87 2 方法 87 3 结果 87 4 讨论 88 实验三、NFIC 在 TGF-β1 信号通路调控 SCAPs 分化中的作用 90 1 材料 90 2 方法 90 3 结果 92 4 讨论 92小 结 96参考文献 97个人简历和科研成果 107致 谢 108 第四军医大学博士学位论文 缩略语表缩写词 英文全称 中文全称α-MEM α- modified eagle’s medium α-MEM 培养基ALP alkaline phosphatase 碱性磷酸酶BMP bone morphogenetic protein 骨形态发生蛋白BMMSC bone marrow mesenchymal stem cell 骨髓间充质干细胞BSP bone sialoprotein 骨涎蛋白CBB calcined bovine bone 煅烧牛骨Col I collagen type I I 型胶原蛋白DMEM dulbeccos modified eagles medium DMEM培养基DMP-1 dentin matrix protein 1 牙本质基质蛋白 1DMSO dimethyl sulfoxide 二甲基亚砜DSP dentin sialoprotein 牙本质涎蛋白DSPP dentin sialophosphoprotein 牙本质涎磷蛋白ECM extracellular matrix 细胞外基质FBS fetal bovine serum 胎牛血清H.E hematoxylin-erosin 苏木素-伊红 -1- 第四军医大学博士学位论文缩写词 英文全称 中文全称NFIC nuclear factor I-C 核转录因子-COCN osteocalcin 骨钙蛋白PBS phosphate buffered saline 磷酸盐缓冲液 peroxisome proliferator activated 过氧化物酶体增殖PPAR-γ receptor-γ 物激活受体SCAP stem cells from the apical papilla 根尖牙乳头干细胞SEM scanning electron microscopy 扫描电子显微镜TGF-β transforming growth factor-β 转化生长因子-β -2- 第四军医大学博士学位论文 转录因子 NFIC 在人根尖牙乳头干细胞 分化中的作用及其机制研究 博士研究生:张 菁 导 师:牛忠英 教 授 辅 导 教 师:何文喜 副教授 第四军医大学口腔医院牙体牙髓病科，西安 710032 资助基金项目:国家自然科学基金(81070831) 中文摘要关键词:根尖牙乳头干细胞;转录因子;转化生长因子;细胞增殖;细胞分化;组织再生;煅烧牛骨 干细胞在组织工程学中的运用将为牙髓/牙本质再生和生物性牙根的形成提供广阔的运用前景。根尖牙乳头干细胞(stem cells from the apical papilla，SCAPs)位于未发育完成的年轻恒牙的根尖部，是一种取自正在发育组织的成体间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)。SCAPs 具有多向分化的潜能，在特定培养液诱导下可形成类牙髓/牙本质，且被认为是牙根部成牙本质细胞的来源，最终形成牙根部牙本质。SCAPs 与牙髓干细胞(dental pulp stem cells，DPSCs)相比，具有较强的成牙分化能力和较低的免疫原形，此特性被认为更适合运用于骨/牙体组织再生领域。 核转录因子NFIC(nuclear factor I-C)在调控牙根的发育中发挥了重要作用。敲除NFIC的小鼠，形成短小的磨牙牙根，而牙冠发育正常。鉴于NFIC是特异性调控牙根发育的信号分子，而SCAPs是牙根成牙本质细胞的来源，那么，NFIC在调控SCAPs -3- 第四军医大学博士学位论文分化中的作用及其机制如何，目前尚不清楚。 牙齿的发育是由一系列上皮和间充质相互作用而形成，众多的细胞因子参与了牙齿发育的调控。转化生长因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)超家族，包括TGF-βs，骨形成蛋白(bone morphogenetic proteins，BMPs)和激活素类等相关蛋白，参与调节细胞增殖、分化及上皮间充质转换和胚胎发育等。研究发现NFIC通过抑制TGF-β1调控的基因表达，影响皮肤伤口的愈合;敲除NFIC后，小鼠异常的成牙本质细胞中TGF-β?型受体和磷酸化的Smad2/3显著上调，提示，NFIC可能参与TGF-β信号通路，但是两者是在调控SCAPs分化中的作用机制尚不清楚。 本课题首先成功分离、培养和鉴定人根尖牙乳头干细胞。随后分别转染所构建的慢病毒NFIC真核表达载体或沉默NFIC的siRNA。通过体内、外实验观察NFIC对SCAPs增殖、分化的影响。最后，研究TGF-β1对SCAPs生物学特性及分化的影响，讨论NFIC与TGF-β1信号通路在SCAPs分化中的相互作用。为将来SCAPs在牙髓牙本质再生和生物性牙根方面的应用提供新的思路。结果如下:1. 人根尖牙乳头感干细胞的分离、培养及鉴定 选取因正畸原因而拔除的年轻患者第三磨牙，分离培养人原代SCAPs 有限稀释法纯化获得单克隆的细胞;免疫组织化学染色及流式细胞仪鉴定间充质干细胞标记物STRO-1等;成骨诱导、成脂诱导实验证实细胞的多向分化能力。2. 转录因子NFIC促进SCAPs分化能力 构建NFIC慢病毒真核表达载体plenti-NFIC后，与沉默NFIC的siRNA分别转染SCAPs。过表达NFIC还促进SCAPs的增殖能力、ALP活 性和成骨/牙分化能力。此外，NFIC还不同程度地增强矿化基因标记物ALP、OCN 和Col.I的mRNA;蛋白质印迹免疫检测技术也证实NFIC上调DSP蛋白水平。而沉默 NFIC 则明显抑制SCAPs矿化能力及矿化基因ALP、OCN和Col.I的表达。此外，过 表达NFIC增强脂滴的形成和成脂标记物CCAAT增强结合蛋白(CCAAT/enhancer binding protein)C/EBP-β、C/EBP-δ和过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferator- activated receptor-y，PPAR-γ)的表达。 体内研究进一步证实:过表达 NFIC 的 SCAPs 细胞复合胶原/煅烧牛骨calcined -4- 第四军医大学博士学位论文 bovine bone，CBB材料植入免疫缺陷型小鼠的皮下 12 周后，可促进形成类成牙本 质细胞和牙本质样结构。3. 转录因子NFIC参与TGF-β1信号通路对SCAPs的调控 不 同浓度 TGF-β1 均抑制 SCAPs 增殖和体外矿化结节形成，并下调矿化基因的表 达，而分别应用 TGF-β1?型受体抑制剂 SB431542 和 Smad3 的抑制剂 SIS3 阻 断TGF-β 信号通路后，可部分逆转 TGF-β1 对 SCAPs 增殖和分化的抑制作用。 TGF-β1抑制 NFIC 蛋白的表达，过表达 NFIC 减弱 TGF-β1 对 SCAPs 矿化能力 的抑制作用，而沉默 NFIC 则增强了 TGF-β1 对 SCAPs 成牙/骨的分化能力。实 验结果显示 NFIC参与 TGF-β1 信号通路对 SCAPs 的生物学调控。 综上所述，本 研究通过体内/外实验证实 NFIC 可以促进根尖牙乳头?上赴脑鲋澈头只芰Γ 欢?TGF-β1 则起抑制作用;且 NFIC 参与了 TGF-β1 对根尖牙乳头干细胞分化特 性的调控。本实验结果为阐述 NFIC 在调控 SCAPs 定向分化中的重要作用;同时 为进一步研究 SCAPs 在牙髓牙本质再生和生物学牙根的组织工程研究提供了新的 研究思路。 -5- 第四军医大学博士学位论文 Role of NFIC in the differentiation of apical papilla-derived human stem cells Candidate for Ph.D student: Zhang Jing Supervisor: He Wenxi Tutor: Niu ZhongyingDepartment of Operative Dentistry and Endodontics College of Stomatology The Fourth Military Medical University Xi’an 710032 China Sponsored Programs: grant 81070831 from the Chinese National Natural Science Foundation AbstractKey words: Stem cells from the apical papilla Nuclear factor transforming growthfactor-β proliferation differentiation tissue regeneration calcined bovine bone The use of stem cells in tissue engineering strongly extends the range of itsapplications in dental pulp/dentin regeneration or the bioroot for the future. Stem cellsderived from the apical papilla SCAPs are a population of mesenchymal stem cellsMSCs residing in root apex of incompletely developed teeth. SCAPs appear to have acapacity of multi-lineage dentinogenic especially dentinogenic differentiation when underdefined culture conditions. SCAPs are thought to be the major souce for primaryodontoblasts which are responsible for the formation of root dentin. As a distinct source ofpotent dental stem/progenitor cells SCAPs show a greater dentinogenic potential andweakly immunogenic compared with dental pulp stem cells DPSCs which might be of -6- 第四军医大学博士学位论文significance for their application in bone/dental tissue engineering. Nuclear factor I-C NFIC was reported as a critical regulator in root formation.Disruption of NFIC caused developed short molar roots contained aberrant odontoblastsand abnormal dentin formation but normal crowns in mice. Studies have reported thatNFIC played a critical role in root development and SCAPs were the source ofodontoblasts of root. However the effects and mechanisms of NFIC on the differentiationof SCAPs have not yet been reported. Tooth root formation is mediated through a series of epithelial-mesenchymalinteractions regulated by several factors. The transforming growth factor-β TGF-βsuperfamily including TGF-βs bone morphogenetic protein activins andinhibinsregulates cell proliferation cell differentiation the epithelial-to-mesenchymal transitionand embryonic development and so on. Reports have confirmed NFIC affected the normalprogression of the skin wound healing process by inhibiting the level of TGF-β.Disruption of NFIC both the expression of TGF-β-RI and the phosphorylation of Smad2/3increased during odontoblast which revealed the interaction between NFIC and TGF-βsignaling pathway. However the exact mechanism for the regulation and interaction ofNFIC and TGF-β on the differentiation of SCAPs are still unknown. In the present study we isolated expanded and identificated SCAPs from the apicalpapilla. The pLenti6.3/v5-NFIC plasmid encoding full-length NFIC or NFIC silence bysi-RNA were constructed and transfected into SCAPs respectively. Then the effects ofNFIC on the proliferation and differentiation of SCAPs were subsequently determined invitro and in vivo. In addition we also evaluated the effects of TGF-β1 on the proliferativecapacity and differentiation potential of SCAPs. The crosstalk between NFIC and TGF-β1were further determined. These will facilitate the application of SCAPs in pulp/dentinregeneration and bioroot formation.Main results1. Isolation expandation and identification of SCAPs. Human third molars with developing roots were collected due to orthodontic reasons.The extraction procedure was approved by Institutional Review Board of the Fourth -7- 第四军医大学博士学位论文Military Medical University and performed with the informed consent of the patients.Single cell suspensions of SCAPs were obtained by limiting dilution procedures.Immunocytochemical staining and flow cytometry-based cell sorting showed that the cellsderived from apical papilla contained mesenchymal stem cell populations. Besides theisolated cells had the ability of osteo/odontogenic and adipogenic differentiation whengrew under defined culture conditions.2. The effects of NFIC on proliferation and differentiation of SCAPs and in vitro. The pLenti6.3/v5-NFIC plasmid encoding full-length NFIC or NFIC silence bysi-RNA were constructed and transfected into SCAPs respectively. The proliferation ALPactivity and osteo/odontogenic differentiation capacity of SCAPs were increased byoverexpression of NFIC. Besides NFIC upregulated the mRNA levels of alkalinephosphatase ALP osteocalcin OCN and collagen type?CoL.I as well as dentinsialoprotein DSP protein which were analyzed by western blot. In contrast knockdownof NFIC blocked the mineralization of SCAPs and downregulated the expression ofodontogenic-related markers ALP OCN and CoL.I. Additionally the lipid dropletsformation and the adipogenic differentiation markers CCAAT/enhancer binding proteinbeta C/EBP-β CCAAT/enhancer binding protein delta C/EBP-δ and peroxisomeproliferator-activated receptor gamma PPARγ were further induced by NFIC. Consistently in vivo results further demonstrated that NFIC promoted the odontoblastor dentin like tissues regeneration integrating with the collagen and calcined bovinebone，CBB biomaterials in immunocompromised mice after 12 weeks.3. Involvement of NFIC in the biological effects of TGF-β1 on SCAPs TGF-β1 inhibited the prolifiration of SCAPs and mineral nodule formation indose-dependant manner. The mRNA levels of ALP OCN and CoL.I were alldownregulated by TGF-β1. Results indicated that preincubated with the inhibitors ofTGF-β/Smad signaling SB431542 or SIS3 attenuated the suppressive effect of TGF-β1on the differention of SCAPs. TGF-β1 inhibited NFIC protein level. In additionoverexpression of NFIC inhibited the effects of TGF-β1 on SCAPs while knockdown ofNFIC enhanced it demonstrating that NFIC may be a key molecule in the regulation of -8- 第四军医大学博士学位论文TGF-β1 on SCAPs. In summary results suggested that NFIC enhanced the proliferation and mineralizeddifferentiation of SCAPs both in vitro and in vivo mechanically we further found thatNFIC may be a key regulator for the inhibitory effect of TGF-β1 in calcified noduleformation and osteo/dentinogenic differentiation. Taken together current study providedvaluable evidence for the application of NFIC in the pulp/dentin regeneration and biorootformation in the future. -9- .