小鼠视网膜多潜能干细胞的分离培养和小鼠胚胎干细胞向视网膜色素上皮细胞定向分化研究

小鼠视网膜多潜能干细胞的分离培养和小鼠胚胎干细胞向视网膜色素上皮细胞定向分化研究 小鼠视网膜多潜能干细胞的分离培养和小鼠胚胎干细 胞向视网膜色素上皮细胞定向分化研究 】 分类号 密级 尊士学位论文 小鼠视网膜多潜能干细胞的分离培养和小鼠胚胎干细 胞向视网膜色素上皮细胞定向分化的研究? ? ?? ?? ?作者姓名: 肖庆 学科专业: 眼科学 湘雅二医院 学院系、所: 指导教师: 唐罗生教授 副指导老师: 高玲副教授 答辩委员会主 中南大学 二?年五月、 原创性声明 本人声明,所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。尽我所知,除了论文中特别加以标注和致谢的 地方外,论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果,也不包 含为获得中南大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我共 同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文中作了明确的说明。 作者签名: 日期:三生年日 ,,?《怎礓蓐.,,;, 学位论文版权使用授权书 本人了解中南大学有关保留、使用学位论文的,即:学校有 权保留学位论文并根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文,允 许学位论文被查阅和借阅;学校可以公布学位论文的全部或部分内 容,可以采用复印、缩印或其它手段保存学位论文。同时授权中国科 学技术信息研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》, 并通过网络向社会公众提供信息服务。 .作者妣垂导; 嘎一;鬻争、,.、? ,?。,,蔫本研究受国家自然科学基金资助。博士学位论文 摘 要 研究背景 视网膜色素上皮 ,具有复杂的结 构和特殊的生理机能。能吞噬脱落的光感受器细胞外节膜盘 ,,这对光感受器细胞外节的更新及维持正常 视觉功能至关重要,其功能障碍会导致严重视网膜疾病和一些严重的 遗传性变性眼病,如病、病、先天性黑噱和年龄 相关性黄斑变性. ,等叫。因此应 用细胞移植治疗某些眼底疾病是其中的一个研究热点,目前面 临的主要问是如何获得合适的移植细胞,才能在移植后与宿 主残留的视网膜细胞达到最佳的整合效果,以求最大限度地重建患者 的视功能。 组织细胞尤其是干细胞工程的兴起为视网膜损伤的治疗提供了一种新 的途径。极小胚胎样干细胞 . ,是美国路易斯维尔大学研究小组从小鼠骨髓和人脐 带血中分离出、具有类似胚胎干细胞生物特性的的 多能干细胞口,“等从小鼠视网膜神经上皮中分离了相似的视网膜 , 多潜能干细胞 。已有研究证实:这些多潜能干细胞不仅具有与胚胎干细胞相似 的形态学特征和细胞标记物,而且具有胚胎干细胞多分化潜能的特性, 在体外可以被诱导分化为内胚层、中胚层、外胚层细胞,潜在分化能博士学 位论文 中文摘要 力强,若作为组织工程和临床治疗的种子细胞,可避免伦理争议,具有 良好的应用前景。通过免疫磁珠分选的方法,我们从新生小鼠小鼠的 神经视网膜组织中得到?一的同一细胞亚群,通过细胞 免疫荧光和流式细胞仪其特性,为视网膜移植的供体选择提供新 的来源。 当然,目前最广泛的种子细胞来源还是胚胎干细胞 ,。 胚胎干细胞 ,具有无限扩增和多向分化潜 能的特点,因此关于其诱导分化的研究成为干细胞研究的热点。如能 在体外将胚胎干细胞源源不断地诱导分化成患者所需要的靶 细胞如、光感受器细胞细胞,可望突破视网膜移植中面临的 供体来源有限的难题,具有广阔的应用前景。目前,将体外诱 导分化成细胞的研究已经取得了一定的成果,借鉴皮肤黑色素 细胞诱导时采用的细胞层和类似的诱导条件,采用间充质细 胞系作为饲养细胞层,小鼠细胞能分化为呈六角形排列的、胞浆中 出现色素颗粒的细胞,但其诱导效率低瞄。除了共培养或组织 移植,目前尚无较好获得有效的高效率方法。因此,我们设想 建立一种无饲细胞层体外培养的小鼠诱导成光感受器和的培 养体系,提高向诱导效率。 目的 探讨免疫磁珠分选方法从新生小鼠视网膜神经上皮中分离 出具有多潜能干细胞特性的?一细胞群的可行性。 博士学位论文 中文摘要 研究小鼠视网膜多潜能干细胞与小鼠胚胎干细胞的形态特征及 基因表达差异。 探讨小鼠视网膜多潜能干细胞向分化的途径,建立一种无 饲细胞层培养的小鼠分步诱导成的高效培养体系。 方法 鼠视网膜多潜能干细胞的获取:取初生天、鼠神经视网膜 组织制成单细胞悬液,使用免疫磁珠分选的方法先行.阴性分选后 行阳性分选得至..细胞群,使用流式细胞技术和细 胞免疫荧光法鉴定其具有极小胚胎样干细胞的特性。 小鼠视网膜多潜能干细胞和胚胎干细胞的培养:用小鼠成纤维细 胞作为饲细胞层,神经干细胞培养基和胚胎干细胞完全培养基分别培 养两种细胞,并观察形态特性。 鼠胚胎干细胞和视网膜多潜能干细胞及的鉴定:采用碱 性磷酸酶染色 ,进行鼠鉴定,采用 . 免疫组织化学方法检测小鼠视网膜多潜能干细胞;用 方法检测全能性基因,,在小鼠,小鼠视网膜多潜能 干细胞与小鼠冲的表达差异; .检测小眼球 ,、 相关转录因子? 酪氨酸酶,、酪氨酸酶相关蛋白 .,冲、视网膜色素上皮细胞蛋白一,在小鼠,视网膜多潜能干细胞与 的表达差异。 博士学位论文 中文摘要 小鼠与诱导产生的基因表达差异性检测:小鼠无饲细 胞层培养,并添加诱导因子进行天的诱导,采用细胞免疫组织 化学方法检测诱导形成的, .检澳和的、 、 、基因表达差异, ?检测 ?己、、在小鼠与的表达差异。 娃里 :口木 小鼠视网膜多潜能干细胞分选率:利用免疫磁珠分选的方法从 新生小鼠神经视网膜组织中分离出细胞群,细胞计数 分选得率为.%。该细胞群干细胞抗原表达率达.%,大小 为?,形态呈小圆形,核质比高。 鼠视网膜多潜能干细胞组织形态学、免疫组化及基因表达: 形态呈小圆形,直径至,表达阳性;全能性基因、 、的表达比小鼠低,比小鼠视网膜色素上皮细胞高, 不表达的标记性基因、限、、冲;小鼠呈克 隆状生长,排列紧密,细胞集落隆突有立体感,边缘整齐清晰,形似 鸟巢。单个细胞胞浆少,细胞核大,核仁明显,界限不清。阳性, 全能性基、、拘高表达。 鼠向的定向诱导:本实验中尚未从小鼠视网膜多潜能 干细胞成功获得;但小鼠无饲细胞层培养并添加诱导因子可定 向分化为,获得的角蛋白表达阳性,、、不 表达,表达的标记性基因、?之、、。 结论 中文摘要 利用免疫磁珠分选的方法可以从新生鼠神经视网膜中成 功分离出?一细胞群,其分选率为.%。 鼠视网膜 ?一细胞群具有的特性。形态呈 小圆形,直径至,全能性基因的表达比小鼠低,比小鼠视网 膜色素细胞高,不表达的标记性基因、聊、、 具有成体干细胞的特性。 本实验小鼠视网膜多潜能干细胞诱导成存在一定困难,但 成功建立了一种小鼠无饲细胞层培养并添加诱导因子向诱导 的高效培养方案。 关键词 多潜能干细胞,极小胚胎样干细胞,胚胎干细胞,诱导, 视网膜色素上皮细胞,细胞免疫荧光 博士学位论文 英文摘要., . , ,, . ..., .,. ? ? , . 叫博士学位论文 英文摘要 ? ? .. ?, ,, . . /。‘/。。 . , . . . , . , . . .? . 博士学位论文 英文摘要.. . ? .? .: ? ,一. . 、 : , ?, ,. 博士学位论文 英文摘要? : , 、,, , ? ?.、 ??:, ,, ?.,, , , ?. ’? : .%.? 、:博士学位论文 英文摘要 ?, . ,, ? . . 、: ?,,, ?,, .?.: ? . .?. .? . , 英文摘要 博士学位论文 ? ,.? ,,, , ? , 目录 博士学位论文 目 录 中文摘要? 英文摘要? 前言?”一??一..??”?“ 日?茜”??”?”?”一??“”??”?“上 第一部分小鼠视网膜多潜能干细胞的分离和鉴定 .材料和方法.结果.讨论” .结论 第二部分小鼠视网膜多潜能干细胞特性研究 .材料和方法? .结果.讨论? .结论 第三部分小鼠视网膜多潜能干细胞和小鼠胚胎干细胞向视网膜色素上皮细 胞 的定向诱导 .材料和方法? .结果 .讨论? .结论? 全文结论? 参考文献? 综述 致谢? 攻读学位期间主要的研究成果?目录 博士学位论文 英文缩略语注释 英文全称 中文全称 英文缩写 .姆 碱性磷酸酶 千碱基对 互补 二甲基亚砜乙二胺四乙酸 胚胎干细胞 . 荧光激活细胞分类器 胎牛血清流式细胞术 成纤维生长因子表皮生长因子 异硫氰酸荧光素辣根过氧化物酶 免疫荧光 免疫磁珠分选 小鼠胚胎成纤维细胞 光密度值磷酸盐缓冲液 多聚赖氨酸 ? 多潜能干细胞 博士学位论文 目录 黝 .. 全反式视黄醛核糖核酸 视网膜色素上皮细胞 逆转录聚合酶链反应 实时定量聚合酶链反应 缓冲液 透射电镜 极小胚胎样干细胞 ?博士学位论文 前言 前言 导致视力退化或失明的主要因素包括黄斑退行性疾病和视网膜 色素变性。究其原因,是视网膜细胞为神经细胞起源,在后来的生活 中不断受到刺激和损害, 得不到补充和修复所致【。在黄斑退化的 发病过程中,视网膜色素上皮细胞起了非常重要的作用。它是单层 上皮细胞,分隔视网膜神经上皮 ,?和 膜下血液循环,生理状态下发挥发挥重要功能:为光感受 器提供营养支持。吞噬和清除光感受器脱落的外节盘膜,其中 是一种酪氨酸酶的受体基因,作为信号分子发挥着启动 特异性吞噬过程的作用。参与视紫红质的漂白,再循环。控制 离子通道和氧化损伤;分泌生长因子如 ? ,促进神经细胞的存活等川。还与互相作用维 持和调节相对稳定的一个微环境‘剐。 这些细胞不具有体内自我恢复和再生能力,它们的衰老和退化往 往导致视力的降低。而目前功能缺陷或功能损害的治疗缺乏确 切的疗效,严重影响患者的视功能和生存质量,带来沉重的经济负担 和社会负担。 因此,考虑植入新的细胞就成为一个自然的选择。细胞移植既是 细胞替代治疗的种子细胞,又可以作为基因治疗的细胞载体,为这类 疾病的治疗展现了新的曙光。现阶段的移植主要分为游离状态 的细胞移植和单层细胞片的植入。游离状态的移植经历了不同博士学位论文 前言 时期成人期、新生期、胚胎期的细胞移植,诱导或骨髓 间充质干细胞或其他组织来源的干细胞转化为的阶段。大量的 研究表明:游离细胞移植创伤较小;与成熟细胞相比,胚胎及新生的 潜在分化能力强,免疫原性小,移植后容易存活,并与宿主建立 连接的趋势。于是,如何获得足够有效的细胞进行移植,成为 目前研究的热点。 目前获得的方法并不多,已有研究进行胎儿的移植治疗 原发性功能障碍等疾病,但是难以获得足够捐赠的胎儿。 因此,目前真正能够作为大量稳定细胞供给来源的只有全能胚胎干细 胞。 而在诱导定向分化存在很多困惑。 干细胞定向诱导分化为视网膜细胞尤其是视网膜色素上皮细胞治 疗眼科疾病的研究报道不少,方法不一,也成为了当前研究的热点问 题。但其诱导的方法目前研究有限,用间充质细胞系作为培养 小鼠细胞的饲养细胞层,类似于诱导皮肤黑色素细胞所用的 细胞层、在与诱导皮肤黑色素细胞类似的条件下,小鼠细胞和 细胞共培养时细胞能分化为有多种特性的高度色素沉着的细胞 【】。细胞体外诱导分化为黑色素细胞的研究进展显示了细胞广阔 的应用前景,将为临床治疗各种色素缺陷性疾病提供新疗法,对这些全 能或多能干细胞向特定细胞系分化机制的阐明将为实现用细胞生 成健康细胞治疗疾病奠定基础。 因此,关于将干细胞定向诱导分化为视网膜细胞如光感受器细博士学位论文 前言 胞、视网膜色素上皮细胞,通过细胞移植的方法治疗视网膜疾患眼科 疾病的研究报道不少,方法不一,也成为了当前研究的热点问题。目 前真正能够作为大量稳定细胞供给来源的只有全能胚胎干细胞。除了 共培养或组织移植,目前尚无较好诱导成为有效快速高效的 方法。 极小胚胎样干细胞是美国路易斯维尔大学研究小 组从小鼠骨髓和人脐带血中分离出一种具有类似胚胎干细胞生物特 性的多能干细胞‘。极小胚胎样干细胞的形态学和细胞标志与胚胎干 细胞有相似之处,具有胚胎干细胞多分化潜能特性,在体外可以被诱导 分化为内胚层、中胚层、外胚层细胞,潜在分化能力强,若作为组织工 程和临床治疗的种子细胞,可避免伦理争议,具有良好的应用前景。 最先通过趋化分离和免疫荧光激活细胞分选 . ,相结合的方法得到【。近来 等【也报道用两步分离法从人脐带血中分离/丑; 等在鼠的肾和睾丸等其他器官中,利用与分离鼠骨髓相同的方法 对体积较小的//.细胞进行分选,得到了与鼠.相 似的干细胞群。最近,等通过图像流分析、共聚焦显微镜 及实时研究显示小鼠的脑、肾、肌肉、胰腺和骨髓中的 含量最多【。一些表达胚胎干细胞、上胚层干细胞、原 始生殖细胞表面标志的干细胞群也相继在表皮、气管上皮、心肌膜、 胰、 视网膜、羊水等非造血器官被发现【】。 视网膜研究罕见,学者刘‘】等从视网膜中分离该细胞暂称 为,的分离国内研究较少,我们采用免疫磁珠分选的新方法博士学位论文 前 言 从新生一天小鼠视网膜神经上皮中分离出/./.细 胞群,探讨其与的关系,期望从中寻找出生后相对丰富的干细 胞来源。并为更快更有效的获得开拓新的契机。 因此,本研究从以下两个方面出发期望得到可利用的细胞, 为解决目前移植治疗眼部疾病的难题提供新的思路:使用免 疫磁珠分选的方法分离获得小鼠视网膜多潜能干细胞,并将其向 方向诱导,探索其作为种子细胞的特性,间接拓展的有效来源; 探索向定向诱导分化的途径,建立一种无饲细胞层多因 子诱导方法,提高诱导效率,提供直接获得有效的方法。博士学位论文 第一 部分 第一部分小鼠极小胚胎样干细胞的分离及鉴定 细胞移植是将正常细胞移植至病损区,替代被破坏了的细胞,重 建功能。细胞移植的细胞来源不足是许多疾病治疗的梗桔,需用组织 工程方法加以克服。目前,许多疾病取得了突破性的进展,如脊髓 损伤疾病、老年痴呆症、帕金森病的治疗,以及周围神经损伤、心肌 缺血等疾病的治疗。 许多眼科领域的疾病如眼表疾病、青光眼视网膜神经节细胞损害、 视网膜色素变性、等目前治疗热点是用干细胞诱导分化为 具有特定功能的细胞移植到病变区修复缺损破坏的细胞而重建其功 能,即细胞移植。这是目前组织修复的一种重要手段。 近年来,随着组织干细胞研究的兴起,特别是对组织干细胞可塑 性的深入研究,使得干细胞的发育潜能,体外诱导分 化、分离、筛选方法等的研究有了突破性进展。 是年美国路易斯维尔大学研究小组从小鼠骨髓 和人脐带血中分离出一种具有类似胚胎干细胞生物特性的多能干细 胞。极小胚胎样干细胞的形态学和细胞标志与胚胎干细胞有相似之处, 具有胚胎干细胞多分化潜能特性,在体外可以被诱导分化为内胚层、 中胚层、外胚层细胞,潜在分化能力强【,若作为组织工程和临床治疗 的种子细胞,可避免伦理争议,具有良好的应用前景。 ‘因此,我们设想,既然这种细胞能在个体骨髓中分离获得,并随 着机体年龄的增大而减少,那作为终末分化的新生小鼠视网膜组织 中,也可能潜伏着一种具有胚胎干细胞特性的组织干细胞群,但是目 气博士学位论文 第一部分 前从视网膜组织中分离出该细胞群的方法鲜有报导。本实验从一种新 的途径出发,试图采用免疫磁珠分选的新方法,从新生小鼠视网膜中 分离这种多潜能干细胞。 .材料与方法 .主要仪器设备 二氧化碳恒温培养箱 公司,美国倒置相差显微镜 ,日本 超净工作台 中国 低温高速微量离心机 ,美国 电子天平 ,日本 纯水机册,美国 微量移液枪 公司,德国 ,美国 .微孔滤器 培养皿,离心管 ,美国 冻存管、细胞冷冻储存器 ,美国 孔、孔板、细胞记数板 ,美国 . .型电热恒温水箱 天津泰斯特仪器公司,中国 流式细胞仪 公司产品 台式多用恒温振荡器 ..型,公司,美国 型倒置相差显微镜 尼康公司,日本 荧光显微镜 尼康公司,日本水平离心机 ,英国 分析天平 .新西兰 一?冰箱 三洋公司,日本 电热恒温干燥箱 上海跃进制造厂 美天旎公司,德国 免疫磁珠分选柱,分选架,磁性细胞分 离系统 微量高速制冷离心机 美国 .主要试剂 .液 公司,美国 第一部分 博士学位论文 神经干细胞培养基 公司,美国 华舜生物公司,中国 显色剂 公司,美国 胎牛血清 公司,美国 公司,美国 胰蛋白酶.%?: 公司,美国 公司,美国 木瓜酶消化系统试剂盒 武汉博士德公司 多聚甲醛 .抗体 ? 一抗: ; 一/ 二抗: , ; 免疫磁珠试剂盒: ? .: ? ? ...,:;: .。 : ,:: . 一 ; ,, ,一一/, 。 . : 。 :?.; . .实验动物 新生一天鼠购自中南大学湘雅医学院动物部。 .实验方法 .新生小鼠视网膜神经上皮细胞的分离 冲洗,去 小心取出新生时勾/鼠/眼球,用/? 第一部分 博士学位论文 除前节和晶体,视网膜随之脱出,剪碎视网膜,将小鼠视网膜神经上皮组织移 入 超净台的培养皿中,用/液漂洗。 将组织块剪成、块组织,使用木瓜酶消化系统消化视网膜组织碎片。再 置入目孔径的不锈钢筛中的尼龙筛。 吸管吸出组织悬液,置入目筛中,注射器针芯轻轻压挤组织使之穿过筛 网。 细胞计数。 .准备计数板:用无水酒精洗计数板和专用盖玻片; .将细胞悬液混合均匀; .加样:在盖玻片一侧轻轻滴入一滴细胞悬液,不能溢出盖玻片及不能溢入两 侧 槽内; .计数:用计数器进行计数,如果有细胞位于边缘则遵循计上不计下,计左不 计 右的原则。 总细胞数木细胞平均数木稀释倍数车细胞总体积 .磁珠分选示意图及原理 巍 臻、 穗, ,鬣殇 ‘。厂 ;; 鬻 ‖,‰荔嚣:, 铲。。每,未 易, ? , ?靠??鲁???‘ ,口 % 爹》 象 。,强 ?一阴选过程中,具有能与单克隆生物素结合抗体, 一等结合的所谓 抗 , ,/, 原的细胞群被磁珠和?一生物素抗体所标记,流经分选架时,磁性结合而 被分离。 因为不具有这些抗原,不与磁珠结合,因此不具有磁性而流经磁珠分离 系统,可被收集。进行下一步阳性筛选。第一部分 博士学位论文 阳选过程中因为表达抗原而与磁珠以及标记的抗体 结合而标记,流经磁珠分选系统时存留,而未被标记的细胞,即不表达的细 胞不被存留而分离,通过收集分离后细胞,得到纯度较高的细胞,分别进行 细胞计数,通过分选前后细胞计数的比较得出细胞分选得率。再用流式细胞 仪进 行检测验证。 的分选 ?一阴选 .根据细胞计数算出所得细胞总数. 分钟离心.小心弃去上清液。 .细胞悬液离心: 。 .加缓冲液:根据细胞计数每细胞加入缓冲液 。 .加抗生物素抗体:根据细胞计数每细胞加入抗生物素抗体 .孵育:。孵育分钟。 。 .加缓冲液:根据细胞计数每细胞加缓冲液 .加磁珠:每细胞加入 抗生物素磁珠。 .孵育:。孵育分钟。 .加缓冲液:每细胞加缓冲液。 .离心: 分钟离心.小心弃去上清液。 .加缓冲液:每细胞加入 。 .磁珠分选:把分选柱放入分离器中。 .漂洗:用 缓冲液漂洗。 .细胞悬液过柱。 . 缓冲液过柱漂洗三次。 .收集细胞悬液。 阳选 .将以上分选得到的细胞悬液细胞计数。 .单细胞悬液离心:分钟离心,小心弃去上清液。 。 .加缓冲液:每细胞加缓冲液 。 .加抗抗体:每细胞加抗体 第一部分 博士学位论文 .孵育:。孵育分钟。 分钟离心,小心弃去上清液。 .加缓冲液:每细胞加缓冲液。 。 .再加缓冲液:每细胞加缓冲液 .加磁珠:每细胞加入 磁珠。 .孵育:。孵育分钟。 .离心: 分钟离心,小心弃去上清液。 分钟离心.小心弃去上清液。 .加缓冲液:每细胞用缓冲液重悬。 。 .加缓冲液:每细胞加入 .磁珠分选:把分选柱放入分离器中。 .漂洗:用 缓冲液漂洗。 .细胞悬液过柱。 . 缓冲液漂洗三次。 .取下分选柱,用配套的活塞推出并收集阳性细胞。 .分选后细胞的荧光显微镜观察 .收集磁珠分选后的细胞,置入离心管中,短时低速离心/离 心,弃上清。 .加液将细胞吹打均匀,细胞计数。 .调整细胞浓度×/,用目尼龙网过滤成单细胞。 .在荧光显微镜下观察的荧光。 .分选后细胞的流式检测 .收集磁珠分选后的细胞,置入离心管中,短时低速离心/离 心,弃上清。 .加液将细胞吹打均匀,细胞计数。 .调整细胞浓度×/,用目尼龙网过滤成单细胞。 .加入. 上机使用流式细胞仪测定。测量其阳性细胞率。 第一部分 博士学位论文 .细胞免疫荧光检测在小鼠视网膜多潜能干细胞的表达 爬片的准备 :稀释多聚赖氨酸溶液/。 .灭菌的 .用之前将稀释的多聚赖氨酸溶液放在室内,使其温度到室温?。。 .将玻片浸在稀释的多聚赖氨酸溶液分钟。注意增加时间不会提高包被效果。 .在。烘箱小时干燥,或室温?过夜干燥待用。 细胞爬片 .磁珠分选得到细胞后计数,重悬细胞于完全培养基中。 .加细胞时,先在每个孔里准备放爬片的位置滴少量培养基,目的是使玻片与培 养皿靠培养基的张力粘合到一起,然后放玻片,防止加细胞悬液时玻片漂起,造 成双层细胞贴片。整个过程无菌操作。 .将细胞密度为×/种入培养板内. .待细胞贴壁后,可去上清加培养基。 .按照实验设计,作用一定时间后取玻片。取玻片时由于玻片与培养皿底结合较 紧,张力较大,将注射器针头针尖向背面弄个小钩,将爬片轻轻勾起,用小镊子 取出。做细胞分选得到后,时间点的实验时,将所需数量的爬片取出时应 用酒精灯火焰烧一下针头和镊子。末取出的爬片继续培养。 细胞爬片的固定 细胞爬片取出后,用洗遍,然后用%乙醇,室温固定分钟后, 将表面液体吹干,入一?保存。 爬片的免疫荧光染色 按下列的步骤进行免疫荧光染色: ×次 .%冲洗%多聚甲醛固定 .%冲洗 ×次 %正常山羊血清封闭工作液 ×次 .%冲洗 小鼠抗体孵育, ×次 .%冲洗 标记的二抗孵育 ?,黑暗环境,博士学位论文 第一部分 .%冲洗 ×次 蒸馏水冲洗 次 水溶性封片剂封片 黑暗环境中在荧光显徽镜下观察。 一抗按:稀释.根据实验需要选用相应绿色荧光标记的二抗, 按:稀释.对每张染色片均另外各取张作阴性对照,分别不加一抗和不加 一抗及二抗,以代替. .结果 .视罔度嗍赡的形态观襄 培养在饲细胞层上的细胞。大部分细胞于开始贴壁,贴壁良好的细胞呈小圆 形, 胞核大,胞浆少图、 图小鼠?一??胞形态田博士学位论文 第一部分 .分选后细胞的免疫荧光检测 图由于分选现察后直接接种培养,故未用染色,直接现察其荧光以及形态. 倍 图磁珠分连后荧光显微镜直接观察小鼠?一细胞图,磁珠分选后,在 荧光里截镜下可以清晰的看封绿色荧光。表明分选得到的细胞与荧光标记的 抗 抗体蛄合. 倍 田圈麓珠分’连后培养?小时的小鼠?一?胞?胞免疫荧 先图,硅珠分选后,在焚光量?境下可以清晰的看到绿色荧先。舂明分遗得列 的?胞与 荧光标记的抗抗体嫱合.‘倍 。;豁??博士学位论文 第一部分 分选后的流式细胞学检测 图流式细胞仪检测磁珠分选前,所得.%与细胞计数所测表达率. %相近,与等学者分离的.%相近,表明阳性细胞是小鼠视网膜神经上皮细胞中 含量极少的细胞亚群。 图流式细胞仪检测在细胞分选后的表达情况 流式细胞仪检测磁珠分选后表达的阳性率,阳性表达.%,表明通过磁珠分选后, 阳性细胞亚群的纯度高,表明标志明确。 讨论 小鼠视网膜的来源和生物学特征 .非造血干细胞亚群的存在与潜能 成人骨髓中除了造血干细胞,还包含少量非造血干细胞旧驯。根据细胞表面 标记物和细胞大小,一群非造血干细胞的亚群已经被分离出来,如骨髓问质干细 胞瞄引、间充质干细胞、骨髓分离的成体多分化细胞、多分化潜能前体细胞、间 质成体细胞和内皮前体细胞。 当组织受伤时一些这样的非造血干细胞从骨髓中诱导出来,也出现在脐带血 和外周血中比副。这些游离的骨髓细胞在组织修复中的作用仍有争议。这些细胞 在培养过程中能分化成多种细胞。证据表明,组织受伤时释放的非造血干细胞能 相应产生免疫调节和营养因子,这些因子能抑制凋亡和瘢痕形成,促进血管新生