炙甘草汤颗粒中甘草酸的含量测定.doc

炙甘草汤颗粒中甘草酸的含量测定.doc 炙甘草汤颗粒中甘草酸的含量测定 摘要:目的:利用超高效液相色谱UPLC测定炙甘草汤颗粒中甘草酸的含量。:色谱柱为UltimateTM AQ-C18(4.6×150mm，5μm)，以乙腈-0.2%磷酸(34:66)为流动相，检测波长为250nm，流速为1.0ml?min-1。结果:甘草酸单铵盐对照品浓度在0.1059,1.6940 mg?ml-1范围内线性关系良好，回归方程为:Y= Y= 811011X-10261(n=5， r=0.9998)，平均加样回收率为99.19%。结论:本方法准确可靠，可作为炙甘草颗粒质量量控制的检测方法。 关键词:炙甘草汤 甘草酸 超高效液相色谱 炙甘草汤最早见载于东汉张仲景所著《伤寒论?辨太阳病脉证并治下》，是阴阳两补的名方代表，其由炙甘草、生姜、人参、生地黄、桂枝、阿胶、麦门冬、麻仁、大枣等九味药材组成，用于治疗伤寒，脉结代，心动悸等症候疾病[1]。现代药理研究表明，炙甘草汤对多种实验性心律失常具有治疗作用，对心悸、早搏、冠心病等心脏疾病具有良好的临床治疗效果[2]。炙甘草汤的君药是炙甘草，甘草酸是炙甘草中的主要药效成分之一，具有多样的药理活性，现行药典也将其作为质量控制成分[3]，因此测定炙甘草颗粒中的甘草酸具有重要的意义，建立的检测方法可为炙甘草汤颗粒提供质量控制提供实验依据。 1. 仪器与试药 Waters ACQUITY UPLCTM 超高效液相色谱仪(包括二元泵，PDA检测 器，柱温箱，美国);十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱(UltimateTM AQ-C18，4.6×150mm，5μm)， XP504 DeltaRange分析天平(瑞士);KQ-300GDV超声波处理器(昆山超声仪器有限公司);Thermo Scientific Heraeus Pico 17/21 Fresco(美国); 乙腈(色谱纯)、水(双蒸水)，其它为分析纯。 甘草酸单铵盐对照品(含量测定用，批号:110731-201012，中国药品生物制品检定所提供)，炙甘草汤配方颗粒(批号:110620)及缺炙甘草药材的炙甘草汤颗粒阴性样品由实验室自制。 2. 色谱条件与系统适用性试验 2.1 色谱条件 150mm，5μm;以乙腈-0.2%磷酸 色谱柱为UltimateTM AQ-C18(4.6× (34:66)为流动相;检测波长为250nm;柱温:30?;流速1.0ml/min。理论塔板数按甘草酸峰计算应不低于5000。 2.2 溶液的制备 2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取甘草酸单铵盐对照品8.47mg，置于5ml的量瓶中，加稀乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得浓度为1.694mg/ml的对照品溶液，折合甘草酸浓度为1.654mg/ml。 2.2.2 供试品溶液的制备 取本品，研细，精密称取细粉约1.5g，置于具塞锥形瓶中，精密加入稀乙醇50ml，称定重量，超声处理(250W，40kHz)30分钟，取出放冷，称定重量，用稀乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，续滤液用0.45μm的 微孔滤膜滤过，即得。 2.2.3 阴性样品溶液的制备 取缺炙甘草药材的炙甘草汤颗粒阴性样品，精密称取细粉约1.5g，置于具塞锥形瓶中，精密加入稀乙醇50ml，称定重量，超声(250W，40kHz)处理30分钟，取出放冷，称定重量，用稀乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，续滤液用0.45μm的微孔滤膜滤过，即得。 2.3 方法学考察 2.3.1 专属性考察 分别吸取对照品溶液、供试品溶液、阴性样品溶液各5μl进样。在上述系统适应性的色谱条件下，供试品中甘草酸色谱峰与对照品色谱峰保留时间一致，并与其它成分分离度大于1.5，达到基线分离，且阴性样品在相应的位置没有色谱峰干扰。色谱图见图1、2、3。 2.3.2 线性范围的考察 精密称取甘草酸单铵盐对照品8.47mg，置于5ml的量瓶中，加稀乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，浓度为1.694mg/ml，精密量取上述对照品溶液2.5ml，置于5ml，的量瓶中，加稀乙醇稀释至刻度，摇匀，即得浓度分别为0.847mg/ml的对照品溶液，按该法连续稀释分别得到0.4235mg/ml、0.2118mg/ml、0.1059mg/ml的对照品溶液。 分别精密吸取上述对照品溶液各5μl，按上述色谱条件测得峰面积积分值，以进样量(mg/ml)为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，做线性回归。结果表明:甘草酸单铵盐在进样量0.1014,1.6940 mg?ml-1范围内时，进样量与甘草酸面积呈良好的线性关系。回归方程为:Y= Y= 811011X-10261(n=5， r=0.9998)上述试验结果详见表1。 2.3.3 精密度试验 精密吸取对照品溶液(0.4235mg/ml)5μl，重复进样6次，测定峰面积，RSD为0.28% 表明在规定的测试条件下，仪器的精密度良好。 2.3.4 稳定性试验 取同一批供试品溶液5μl，分别于0h、2h、4h、6h、8h、12h、24h进样测定，测定其峰面积，RSD为0.36%， RSD值小于2.0%，说明供试品溶液在24内小时内稳定。 2.3.5 重复性试验 取同一批样品，研细，精密称定取6份样品，每份约1.5g，，置具塞锥形瓶中，精密加入稀乙醇50ml，分别超声处理(250W，40kHz)30分钟，取出，放冷，再称定重量，用稀乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，分别精密量取续滤液25ml，蒸干，残渣加稀乙醇使溶解，并转移至5ml的量瓶中，加稀乙醇定容至刻度，摇匀，离心，取上清液，即得。精密吸取供试品溶液各5μl，进样，测峰面积，结果测得样品中甘草酸的平均含量为3.06mg/g，RSD为0.50%，RSD(%)值小于2.0%，说明本方法重复性较好。 2.3.6 回收率试验 精密称取甘草酸单铵盐对照品11.10mg(批号:110731-201012)，加稀乙醇溶解并定容至10ml，即得浓度为1.110mg/ml的甘草酸单铵盐对照品溶液(折合成甘草酸的浓度为1.0872mg/ml)，精密量取5ml上述对照品溶液，加稀乙醇定容至500ml，即得浓度为11.10μg/ml的甘草酸单铵盐 对照品溶液(折合成甘草酸的浓度为10.87μg/ml)。 精密称取已测知甘草酸含量的样品(批号110620，甘草酸含量为1.3816mg/g)适量，研细，取6份，每份约0.4g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入浓度为11.10μg/ml的甘草酸单铵盐对照品溶液50ml(折合成甘草酸0.5436mg)，称定重量，超声处理(250W，40kHz)30分钟，取出，放冷，用稀乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液25ml，蒸干，残渣加稀乙醇使溶解，并转移至5ml的量瓶中，加稀乙醇定容至刻度，摇匀，离心，取上清液，即得。精密吸取供试品溶液5μl，测峰面积，计算回收率，测得甘草酸单铵盐额的平均回收率为99.3%，RSD为0.91%，RSD小于2.0%，说明本方法回收率良好。 2.3.7 样品测定 精密称取本品三批各约1.5g，照“2.2.2 供试品溶液的制备”制得供试品溶液，按以上色谱条件，进样测定，结果见表2。 三批炙甘草汤颗粒的甘草酸单铵盐含量分别在2.88,3.25mg/g之间，我们以三批平均含量下浮20%并计，每批产品的甘草酸含量不得低于2.30mg/g。 3. 讨论 3.1流动相的选择 本法考察了甲醇-0.2mol/L醋酸铵溶液(含3%冰醋酸)、乙腈-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.2%磷酸溶液、乙腈-0.5%磷酸溶液等流动相，结果以乙腈-0.2%磷酸(34?66)溶液时分离效果好，峰形较好，出峰时间约为19分钟，高效液相色谱的分析时间每次为30分钟，符合分析要求。 3.2提取溶剂的考察 本实验考察不同的溶剂对提取率的影响，结果显示70%甲醇、50%甲醇、70%乙醇、稀乙醇、甲醇-含3%冰醋酸醋酸铵(60?40)五种溶剂提取结果相近，但因乙醇无毒，故本法采用稀乙醇为提取溶剂。 3.3 溶剂用量的考察 本实验考察了不同的溶剂实验结果的影响，结果表明，用50ml溶剂提取时，已能提取完全，色谱峰形较好，因此我们确定提取溶剂用量为50ml。 3.4 提取时间的考察 本实验还考察了不同的提取时间对实验结果的影响，结果显示，超声30分钟后，含量无明显差异，超声30分钟时的含量稍高，且峰形较好，因此我们确定超声时间为30分钟。 由于炙甘草汤颗粒是中药复方制剂，成分比较复杂，因此对流动相，提取时间，提取溶剂等因素进行了考察，进而得到优化的色谱条件，该方法快速准确，可为炙甘草颗粒制剂的质量控制及进一步研究提供实验依据。 参考文献: [1]李飞. 方剂学 [M]. 北京; 人民卫生出版社. 2011: 881. [2]刘巍， 鲁卫星. 炙甘草汤抗快速性心律失常研究概况 [J]. 中医杂志， 2012， (04): 348-51. [3]国家药典委员会. 中华人民共和国药典-一部 [S]. 北京; 中国医药科技出版社. 2010.