GST蛋白纯化

GST bestarose 4FF说明书 默认分类 2010-01-18 09:32:34 阅读257 评论0 字号：大中小 GST bestarose 4FF是专门用于纯化pGEX系列载体达的GST标签蛋白，其它谷胱甘肽转移酶以及与谷胱甘肽有亲和作用蛋白的分离介质，操作简单，快速。 GST bestarose 4FF 可直接从预处理的细胞裂解物中纯化GST-tagged蛋白，纯化条件温和，可以保证蛋白的生物活性。 GST bestarose 4FF 具有高流动性，易于放大，GST bestarose 4FF有快速方便的预装柱，Ez-Fast bestarose 4FF 1ml和5ml。 介质性能 谷胱甘肽是通过10碳原子的连接臂偶联到4%高度交联的琼脂糖上。最优的偶联作用使介质具有高GST-tagged蛋白及与谷胱甘肽相互作用蛋白的结合能力。 总的蛋白结合能力约为每毫升填料结合10mg标签蛋白，动态结合能力随着外界因素改变，如不同的目标蛋白，流速等等。 如果需要去除GST部分（天然蛋白分子量为26KD），当蛋白吸附在柱上，或在洗脱后用位点专一的蛋白酶消化，选用前种方法，可减少额外分离目的蛋白与GST步骤，消化后，目的蛋白直接用结合液洗脱即可。   表1 GST bestarose 4FF性能 配体                              谷胱甘肽与10碳原子连接臂 配体浓度                          120-320μmol谷胱甘肽/ml填料 蛋白结合能力                      ≈ 10mg重组GST-tagged蛋白/ml填料，GST，Mr26000 动态结合能力                      ≈11mgGST-tagged蛋白/ml填料，Mr43000 平均颗粒大小                       90μm 组成                               4%高度交联的琼脂糖 最大流速*                          450cm/h（15ml/min），XK层析柱，柱高5cm,水溶性缓冲液，室温纯化 建议的流速**                      上样：＜100cm/h（＜3ml/min ，XK层析柱）                                   洗涤与洗脱：100-300cm/h（3-10ml/min，XK层析柱） 化学稳定性                        所有常用的水溶性缓冲液中稳定，如：1M醋酸盐，pH7.4，6M 盐酸胍，室温，1h pH稳定性                         pH3-12 贮存温度                          +4-30℃ 贮存液                            20%乙醇 * 水是室温的。 ** 结合力与流速有关，低流速增加结合量，这在上样和洗脱过程中非常重要。蛋白性质，pH，温度也影响结合量。   试剂配制 缓冲液的配制： 用来配缓冲液的水及化学试剂纯度要求很高，建议试剂配好后，用0.45μm滤膜过滤。 结合液：PBS，pH7.3（140mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na2HPO4，1.8mM KH2PO4，pH7.3） 洗脱液：50mM Tris-HCl，10mM还原性谷胱甘肽，pH8.0） 注意：结合液和洗脱液中可以含有1-10mM DTT。 样品的准备：上样前，样品需离心或用滤膜过滤。 如果样品太稠，用结合液稀释，以防堵塞柱子，如果是batch纯化，则可以不过滤样品。   Batch 纯化 GST bestarose 4FF的准备 1. 确定你所需的介质体积。 注意：介质是贮存在20%乙醇中的，洗净后，配成50%。 2. 轻轻摇匀瓶中的介质。 3. 用移液枪或量筒取适量的介质到一个干净的管子中。 4. 沉淀，500×g，5min。小心倾去上清液。 5. 加每毫升介质加5毫升PBS洗涤，颠倒混合。 6.沉淀，500×g，5min。小心倾去上清液。 7.重复步骤5和6，2-3次。   Batch纯化步骤 1. 将细胞裂解液加入准备好的胶中，旋转仪轻轻转动混合，室温，至少30min, 2. 用移液枪或量筒取适量的介质到一个干净的管子中。 3. 沉淀，500×g，5min。小心倾去上清液（相当于流穿液），保留一些，用SDS-PAGE电泳检测介质结合能力。 4. 每毫升步骤3沉淀加5毫升PBS洗涤。 5. 沉淀，500×g，5min。小心倾去上清液（相当于洗涤液），保留一些，跑电泳。 6. 重复步骤4和5，两次。 7. 每毫升步骤5沉淀加0.5ml 50mM Tris-HCl，10mM 还原型谷胱甘肽，pH8.0，旋转仪于室温轻轻转动混合5-10min。 8. 沉淀，500×g，5min。小心倾去上清液（相当于洗脱液）。 9. 重复步骤7和8，两次。分别检测这三次的洗脱液。 注意： ?           GST融合蛋白与还原型谷胱甘肽的结合比较缓慢，为获得最大结合量，需要保证足够的作用时间。不同的GST融合蛋白结合效率差异显著。 ?           不同的GST融合蛋白取得最佳纯化效果所需还原型谷胱甘肽浓度，洗脱体积和洗脱时间可能有所不同。必要是需对流穿液，洗脱液进行SDS-PAGE以及Western杂交，以确定最佳纯化条件。 ?           GST检测试剂盒可辅助优化洗脱条件，分析纯化过程的每个步骤，该试剂盒主要用生化或免疫分析检测GST-tagged蛋白。 ?           A280处的吸收值可用来估算GST-tagged蛋白浓度，约A280~1对应浓度为0.5mg/ml。 ?           GST-tagged蛋白浓度也可用标准的显色方法测定（如Lowry，BCA，和Bradford法）。如果用Lowry法和BCA法，样品首先要脱盐，或在PBS中透析去除谷胱甘肽，因为谷胱甘肽会干扰蛋白的吸收，而Bradford法不受谷胱甘肽影响。 ?           介质的再次使用，主要取决于样品的性质，必须是同一个样品，防止交叉污染。   层析柱层析 建议使用的层析柱： Tricorn 10/100：柱体积8.5ml，柱高15cm。 XK 16/20：柱体积30ml，柱高15cm。 或者GST Ez-Fast 4FF 1ml和5ml的预装柱也可使用。 装柱 1. 所有的材料都处于纯化时所需的温度。 2. 用pH7.3 PBS冲洗柱底部的垫片，避免垫片下面滞留气泡，在液面低至1-2cm高度时关闭层析柱下端出口。 3. 摇匀瓶中的介质。 4. 估算所需介质的（匀浆的浓度约为60%）。 5. 吸取介质，用玻璃棒紧靠柱子内壁引流，将介质加入到层析柱中，这可以减少气泡的产生。 6. 立即用PBS灌满柱子，放上上层垫片，将柱子连接到泵上。 7. 打开下端出口，设置流速。 8. 至少流过三倍柱体积的PBS，直到界面不变，在界面处做上记号。 注意：纯化时的流速不要超过75%的装柱流速。 9. 关闭泵，并关闭柱子下端出口，去除层析柱上层垫片，小心的用PBS封满柱子，在顶部形成一个凸面。 10. 从一角插入转接头，确保网下没有空气残留。 11. 将转接头缓慢向下移动（转接器上接口是打开的），到记号处停止，并锁住转接头，把把柱子连接到泵上或色谱分析系统上，开始平衡。如果需要可重新移动转接头的位置。   层析柱纯化步骤 1. 5倍体积的结合液平衡柱子。 2. 加入以处理好的样品。 3. 5-10倍柱体积的结合液洗涤柱子，直至在流穿液中检测不到东西。保留一些，用SDS-PAGE电泳检测介质结合能力。 4.5-10倍体积的洗脱液洗脱蛋白。 注意： ?           影响GST-tagged蛋白及与谷胱甘肽作用的蛋白结合的最重要因素是介质的流速，GST融合蛋白与还原型谷胱甘肽的结合比较缓慢，为获得最大结合量，需要保证足够的作用时间。蛋白性质，pH，温度也影响蛋白的结合。 ?           不同的GST融合蛋白取得最佳纯化效果所需还原型谷胱甘肽浓度，洗脱体积和洗脱时间可能有所不同。必要是需对流穿液，洗脱液进行SDS-PAGE以及Western杂交分析，以确定最佳纯化条件。 ?           GST检测试剂盒可辅助优化洗脱条件，分析纯化过程的每个步骤，该试剂盒主要用生化或免疫分析检测GST-tagged蛋白。 ?           A280处的吸收值可用来估算GST-tagged蛋白浓度，约A280~1对应浓度为0.5mg/ml。 ?           GST-tagged蛋白浓度也可用标准的显色方法测定（如Lowry，BCA，和Bradford法）。如果用Lowry法和BCA法，样品首先要脱盐，或PBS中透析去除谷胱甘肽，因为谷胱甘肽会干扰蛋白的吸收，而Bradford法不受谷胱甘肽影响。 ?           介质的再次使用，主要取决于样品的性质，必须是同一个样品，防止交叉污染。     介质的清洁 当沉淀物，变性的及非特异性吸附的蛋白累积时，介质的结合能力会下降。 ?           去除沉淀物及变性蛋白：2倍体积的6M盐酸胍洗涤，然后快速用5倍体积pH7.3，PBS洗涤。 ?           去除疏水性结合的蛋白：用3-4倍体积的70%乙醇或2倍体积的1%Triton X-100洗涤，然后快速用5倍体积pH7.3，PBS洗涤。   贮存 贮存于70%乙醇中，+4-30℃。   GST标签的切除 在大多数情况下，融合部分保留它的功能活性，可用完整的GST融合蛋白检测其活性。如果需要切除GST标签，当蛋白吸附在柱上，或在洗脱后，用位点专一的蛋白酶如PreScission蛋白酶，凝血酶或Xa因子切除。     如果酶切条件需要优化时，建议洗脱后酶切。易于随时取样，通过SDS-PAGE电泳分析产量，纯度及酶切情况。完全酶切的蛋白酶的用量，温度及酶切时间随不同的融合蛋白改变。在中试研究中确定融合蛋白的最适条件，如，加大酶量，酶切时间可以减小。 1. PreScission蛋白酶 PreScission蛋白酶，Mr 46000。 PreScission酶切缓冲液：50mM Tris-HCl，150mM NaCl，1mMEDTA，1mM DTT，pH7.5。   PreScission蛋白酶酶切结合在层析柱上的GST-tagged蛋白 假设：8mg GST-tagged蛋白/ml填料 1. 接着“Batch纯化”步骤1-6或“柱纯化”步骤1-3。 2. 用10倍柱体积的PreScission蛋白酶缓冲液平衡结合带有融合蛋白的柱子。 3. 准备PreScission蛋白酶切体系：每毫升结合融合蛋白的柱体积， 4℃条件下，准备80μl(160个单位) PreScission蛋白酶和920μlPreScission蛋白酶切缓冲液的混合物。 4. 将准备好的酶切体系加到层析柱上，封住层析柱。如果是batch纯化，PreScission蛋白酶切体系与介质混合即可，轻轻摇动或旋转悬浮液。 5. 4℃酶切4h。 6. 之后，用3倍体积的酶切缓冲液洗涤柱子，用不同的管子收集洗脱液，以防收集的蛋白稀释，分析鉴定。如果是batch纯化，离心，500×g，5min，小心的将洗脱液转移到干净的管子里，洗脱液中含有目的蛋白，而GST标签部分及PreScission蛋白酶则继续留在介质上。   PreScission蛋白酶酶切洗脱的GST-tagged蛋白。 假设：8mg GST-tagged蛋白/ml填料 1. 首先用脱盐柱去除还原型谷胱甘肽，或用PreScission蛋白酶酶切缓冲液透析。 2. 洗脱液中，100μg融合蛋白中加入1μl的PreScission蛋白酶。如果洗脱液中的融合蛋白的浓度还没测定，则每毫升介质对应加80μl的PreScission蛋白酶。 3. 4℃酶切4h。 4. 用酶切后的样品平衡柱子，去除GST标签及PreScission蛋白酶。 5. 室温，孵育20-30min。 6. 沉淀，500×g，5min。目的蛋白在上清液中。   2. 凝血酶 凝血酶，Mr37000。 凝血酶酶切缓冲液：PBS，pH7.3。 缓冲液的配制： 1. 将500U凝血酶溶解在冷的500μl PBS，pH7.3(1U/μl)。 2. 轻和的涡旋溶解。 3. 分装80μl一管，保存在－80℃。   凝血酶酶切结合在层析柱上的GST-tagged蛋白 假设：8mg GST-tagged蛋白/ml填料 1. 接着“Batch纯化”步骤1-6或“柱纯化”步骤1-3。 2. 准备凝血酶酶切体系：每毫升的柱体积， 4℃条件下，准备80μl(160个单位)凝血酶和920μl pH7.3PBS的混合物。 3. 将准备好的酶切体系加到层析柱上，封住层析柱。如果的batch纯化，reScission蛋白酶切体系与介质混合即可，轻轻摇动或旋转悬浮液。 4. 室温（+22-25℃）酶切2-16h。 5. 之后，用3倍体积的酶切缓冲液洗涤柱子，用不同的管子收集洗脱液，以防收集的蛋白稀释，分析鉴定。如果是batch纯化，离心，500×g，5min，小心的将洗脱液转移到干净的管子里，洗脱液中含有目的蛋白，而GST标签及凝血酶则继续留在介质上。   凝血酶酶切洗脱的GST-tagged蛋白。 假设：8mg GST-tagged蛋白/ml填料 1. 洗脱液中，1mg融合蛋白中加入10μl的凝血酶。如果洗脱液中的融合蛋白的浓度还没测定，则每毫升介质对应加80μl的凝血酶。 3. 室温（+22-25℃）酶切2-16h。 4. 酶切后，用脱盐柱去除还原型谷胱甘肽，或用凝血酶酶切缓冲液透析。然后再用样品平衡柱子。 5. 室温，孵育20-30min。 6. 沉淀，500×g，5min。目的蛋白在上清液中，而GST标签及凝血酶则继续留在介质上。   3. Xa因子 Xa因子，Mr48000。 注意：Xa因子是由二硫键连接的两个亚基组成。因为还原型谷胱甘肽能破坏二硫键，因此，在酶切反应前，必须将它去除。 Xa因子酶切缓冲液：50mM Tris-HCl，150mM NaCl，1mM CaCl2，pH7.5。 缓冲液配制： 1. 将400U Xa因子溶解在冷水中(1U/μl)。 2. 轻和的涡旋溶解。 3. 分装80μl一管，保存在－80℃。   Xa因子酶切结合在层析柱上的GST-tagged蛋白 假设：8mg GST-tagged蛋白/ml填料 1. 接着“Batch纯化”步骤1-6或“柱纯化”步骤1-3。 2. 用10倍柱体积的Xa因子缓冲液平衡结合带有融合蛋白的柱子。 3. 准备Xa因子酶切体系：每毫升结合融合蛋白的柱体积，准备80μl(80个单位) Xa因子和920μl Xa因子酶切缓冲液的混合物。 4. 将准备好的酶切体系加到层析柱上，封住层析柱。如果的batch纯化，Xa因子切体系与介质混合即可，轻轻摇动或旋转悬浮液。 5. 室温（+22-25℃）酶切2-16h。 6. 之后，用3倍体积的酶切缓冲液洗涤柱子，用不同的管子收集洗脱液，以防收集的蛋白稀释，分析鉴定。如果是batch纯化，离心，500×g，5min，小心的将洗脱液转移到干净的管子里，洗脱液中含有目的蛋白和Xa因子，而GST标签则继续留在介质上。   Xa因子酶切洗脱的GST-tagged蛋白。 假设：8mg GST-tagged蛋白/ml填料 1. 首先用脱盐柱去除还原型谷胱甘肽，或用Xa因子酶切缓冲液透析。 2. 洗脱液中，1mg融合蛋白中加入10μl的Xa因子。如果洗脱液中的融合蛋白的浓度还没测定，则每毫升介质对应加80μl的Xa因子。 3. 室温（+22-25℃）酶切2-16h。 4. 用酶切后的样品平衡柱子，去除GST标签。 5. 室温，孵育20-30min。 6. 沉淀，500×g，5min。目的蛋白和Xa因子在上清液中。   疑难解答 GST-tagged 蛋白不结合到介质上 ?           裂解时，融合蛋白变性：过度的裂解会引起蛋白变性，并阻碍它结合到介质上，建议采用温和的裂解方法，这些条件需经验摸索。 ?           在细胞裂解液及缓冲液中加入DTT： DTT终浓度为1-10mM，可显著增加蛋白结合量。 ?           检测pGEX空载体表达的GST活性：制备转化了pGEX质粒的细胞裂解液，检测GST的结合情况。如果由空质粒表达的GST具有高亲和性，融合蛋白可能改变了GST的构象，导致它的亲和性降低。大量的研究表明温度降为+4℃，且减少洗涤时，有利于增加结合量。 ?           使用前平衡柱子：pH低于6.5，或高于8时，融合蛋白的结合效率很差，上样前，请确保介质已用pH6.5-8.0的缓冲液平衡。 ?           使用结合能力高的介质：如果介质已经用了很多次，则有必要更换新的介质。 ?           上样时，降低流速。   GST-tagged蛋白不能完全从介质上洗脱下来 ?           增加洗脱时间：洗脱时，降低流速。 ?           增加洗脱液体积：尤其在层析柱上切除标签时，需要大量的洗脱液洗脱目的蛋白。 ?           增加洗脱液中谷胱甘肽浓度：大多数情况下用10mM谷胱甘肽足够了。特殊情况下用50mM Tris-HCl，20-40mM 还原型谷胱甘肽，pH8.0作为洗脱液。 ?           增加洗脱液的pH：低pH会降低洗脱效果，在不需要增加谷胱甘肽浓度的情况下，可将pH调为8-9。 ?           增加洗脱液的离子强度：加入0.1-0.2M NaCl。 ?           更换新的介质。 ?           在洗脱液中添加非离子型去污剂：非特异性疏水作用会阻碍融合蛋白的溶解和洗脱，加入非离子型去污剂如0.1%Trion X-100或2%N-octylglucoside可明显改变洗脱的效果。   纯化后出现杂带的原因 ?           与融合蛋白一起纯化到的蛋白，Mr 70000：分子量为 70000的蛋白可能是E.coli 基因 dnaK的编码产物，它参与蛋白的折叠。据报道上样前，样品在50mM Tris-HCl，2mM ATP，10mM MgSO4缓冲液中37℃放置10min，可避免这种现象发生。或用ATP琼脂糖凝胶或离子交换剂将DnaK蛋白去除。 ?           增加蛋白酶抑制剂：蛋白酶可将目的蛋白降解成多个片段，需在裂解液中加入1mM PMSF。注意：在用凝血酶或Xa因子酶切前，必须先将丝氨酸蛋白酶抑制剂除去。而PreScission蛋白酶不受大多数蛋白酶抑制剂影响。 ?           用蛋白酶突变的宿主菌：杂带可能是宿主蛋白酶水解的结果，如果这是主要原因，我们可以采用蛋白酶突变的宿主菌，如lon-或ompT。 ?           缓和裂解方法：可用显微镜或裂解液的半透明现象来观察细胞的裂解情况，裂解前，先加些溶菌酶（0.1倍柱体积的含10mg/ml溶菌酶的Tris-HCl溶液）。避免泡沫生成，它会引起蛋白变性，过度的裂解也会使宿主蛋白和融合蛋白一起洗脱下来。 ?           可以添加的纯化步骤：杂带是由所谓的伴侣分子蛋白产生，该蛋白在E.coli中参与蛋白的正确折叠，这包括DnaK（Mr~70000），DnaJ（Mr~37000），GrpE（Mr~40000），GroEL（Mr~57000）和GroES（Mr~10000）及其它蛋白。许多从这些杂蛋白中纯化融合蛋白的方法已经报道。 ?           交叉吸附E.coli中抗体蛋白：E.coli中可能会存在许多抗GST标签的抗体，它们会与融合蛋白相互吸附。   GST标签不完整切除 ?           PreScission蛋白酶、凝血酶及Xa因子与融合蛋白的比例不正确：检查酶切反应中融合蛋白的量。参照每毫升GST bestarose 4FF介质能吸附10毫克融合蛋白，大多数情况下，介质不能被融合蛋白饱和。 比例：PreScission蛋白酶，至少10U/mg融合蛋白。 凝血酶，至少10U/mg融合蛋白。 Xa 因子，不少于1%（W/W）融合蛋白，一些融合蛋白，需用5% Xa因子，最佳的量需要经验摸索。 在一般情况下，融合蛋白的浓度为1mg/ml时，酶切效果最好。反应液中加入≤0.5%SDS（W/V）可以有效增加Xa因子切除标签的效果。用不同浓度的SDS实验，以得到最适浓度。 ?           增加酶切时间和酶量：融合蛋白不会降解的情况下，可将PreScission蛋白酶、凝血酶及Xa因子的酶切时间延长为20h。酶的用量也可以提高。 ?           核查特异性酶切位点：核对DNA序列，与已知序列比对，核查基因克隆的序列特异性酶切位点是否改变。   确保加入蛋白酶抑制剂： ?           PreScission蛋白酶：酶切前，在50mM Tris-HCl，150mM NaCl，1mM EDTA，1mM DTT，pH7.5的缓冲液中透析或更换缓冲液。 ?           Xa因子：50mM Tris-HCl，150mM NaCl，1mM CaCl2，pH7.5的缓冲液中透析或更换缓冲液。 ?           Xa因子需要激活：功能性的Xa因子需要用Russell’viper venom激活，激活反应条件为Russell’viper venom与Xa因子的比例为1%，在8mM Tris-HCl，70mM NaCl，8mM CaCl2，pH8.0的缓冲液中37℃孵育5min。 ?           Xa因子识别位点后的第一个氨基酸是Arg或Pro：核查融合蛋白的核苷酸序列，确保Xa因子识别后的三个核苷酸编码Arg或Pro。   酶切后的多条带分析： ?           检测条带出现的时间：确定杂带不是出现在酶切前，这些条带可能是蛋白酶水解的结果。 ?           融合蛋白可能含有PreScission蛋白酶、凝血酶及Xa因子识别的序列：核查序列。