肉芽组织血管生成过程中血管内皮生长因子及β3整合素的表达

肉芽组织血管生成过程中血管内皮生长因子及β3整合素的表达 肉芽组织血管生成过程中血管内皮生长因 子及β3整合素的表达 中国普外基础与哥缶床杂志80Of年11月第8卷第6期ChinJBasesCliaGenera[surg,Vol8,No.6,Nov.2001 ? 基础与实验研究?【文章编号11007-9424c2001)06-0378-03 肉芽组织血管生成过程中血管内皮生长因子 及l33整合素的表达 张聚良王岭晋援朝王映梅 【摘要1目的观察血管内皮生长因子(VEGF)及即整合紊在肉芽组织血管生成中表达的动态变化.方法RT- PCR法及免疫组织化学法观察人正常皮下组织,增殖期肉芽组织(伤后7,l2天)和成熟期肉芽组织(伤后30,35天) VEGF及口3整合素mRNA及蛋白的表达.结果VEGF及郎整合素在正常皮下组织表达很低,在增殖期肉芽组织中 表达明显升高,而肉芽组织成熟后其表达叉降低.结论VEGF及郎整合素是血管生成过程中重要的调节因子. 【关键词】血管生成血管内皮生长因子整合素 【中围分类号】R364.3【文献标识码】A Exl’REIoNOFVASCULARENDOTHELIALGROWTI-IFACTORAND INTEGRIN略DURINGTHEANGIOGENETIC PROCESSOFGRANULATIONTISSUEZHANGju—Hang.WANGLing chao.eta1.DepartmentofVascu— ,JNyuan— larSurgery.XijingHospital,TheFourthMilitaryMedicalUniversity.Xi’an710033 [Abstract]OhjectiveToobservethechangeabteexpressionsofvascularendothelialgrowthfactor(VEGF)and integrin?duringtheangiogeneticprocessofgranulationtissueMethodsmRNAandproteinofVEGFandintegrinB3 inhumannorma[subcutaneoustissue,pro[iferativegranulationtessueandtT~turegranu[ationtissuewereobservedbyRT— staining.ResultsTheexpressionsVEGFandintegrin日 3werelowinnorn~.1subcutane— oustissueandweremuchhigherinprotiferativegranutationtissue.Whenthegranulationtissuewasnzature.theexpres— sionwasdecreasedagain.ConclnsionVEGFandintegrin93areimportantregu[atlngfactorsinangiogenesis. [Keywords]AngiogenesisVascularendothe[ia[growthfactorlntegnn 血管生成指在已有血管床基础上长出新的毛细血 管的过程研究表明,许多病理过程,如糖尿病视网膜 病变,类风湿性关节炎,肿瘤的生长及转移等,都与血 管生成密切相关”,但血管生成的确切机理仍不清楚. 生理状态下,血管生成仅存在于胚胎发育,创伤愈合及 女性生殖周期中,与病理性血管生成不同,这些过程中 血管的生长受到严格调控,包括增殖,成熟,退化三个 阶段,反映了血管生成的全过程.血管内皮生长因子 (VEGF)及日3整合素是近年发现的对血管生成有重 要作用的调节因子,它们如何在血管生成中发挥调节 作用尚不清楚.本实验观察肉芽组织血管生成过程中 VEGF及口3整合索的表达,以探讨它们在生理性血管 生成中的作用及其调节机理. 1材料与方法 1.1标本取材 【作者单位】1.第四军医大学西京医院血管内分泌外科(西安 1oo33);2.第四军医大学西京医院病理科 【作者简介】张聚良(1975年一),男,河北省赵县人,医学硕士,助 教,主要研究方向为血管疾病的谚断及治疗. 肉芽组织标本均取自我院门诊换药者,共l0例, 其中6例皮肤撕脱伤,3例锐器伤及1例狗咬伤.患 者年龄2o,35岁,排除糖尿病等影响伤口愈合的因 素.分别于伤后7,l2天及3O,35天取创面组织. 正常皮下组织取自我院手术患者.将每份标本分为两 份,一份立即一2o?冻存备提取RNA用,另一份经 4%多聚甲醛固定后,常规石蜡包埋,4m连续切片. 1.2试剂及仪器 兔抗VEGF多克隆抗体及鼠抗CD61(p3整合素) 单克隆抗体为SantaCruz公司产品,购自北京中山生物 技术公司;SP试剂盒购自Dako公司;SarcosyAMV逆 转录酶,Taq酶,dNTP及RNAsin分别购自原平生物公 司和Promga公司;DNATHERMALCYCLER480,美 国PE公司;GDS凝胶成像系统,美国UVP公司 13RT-PCR 13.15i物设计按文献报道.’”.,VEGF上游引物 序列:5LGCACCCATGGCAGAAGGAGGAG-3,下 游引物序列:5l-GTGCTGACGCTAACTGACC-3; PCR产物为567bp,495bp和363bp.p3整合素上 游引物序列:5GTGCTGACGCTAACTGACC一3, 中国普外基础与临床杂志2001年l1月第8卷第6期 ChinJEasesCtinGeneralSurg,Vol8,No6,Nov2001 下游引物序列:5’-CATGGTAGTGGAGGCAGAGT一 3;PCR产物为285bp. 1.3.2RT—PCR按Chomczynski等”j改良一步法 提取总RNA,常规进行RT反应.各组织RT产物l0 1,进行PCR扩增,循环温度94?1分钟一55?1分 钟一72?2分钟,循环圈数分别采用l5,20,25及30 个循环,根据结果选择合适圈数,以避免PCR平台期, 最终确定为25个循环,2%琼脂糖凝胶观察结果. 1.4免疫组织化学 切片脱蜡至水,lml/L过氧化氢封闭内源性过氧 化物酶,胰酶消化,加入稀释后一抗4?过夜,按SP试 剂盒操作说明进行,以PBS代替一抗作空白对照. 1.5结果判定及统计学处理 RTPCR产物在UVP凝胶成像系统上摄像,并 用相应软件通过对条带大小及深浅的差别进行定量分 500Up 2ooup I呻bD l234 圈1不同组织中VEGFmRNA的表选 1.Marker(1OObp);2增殖期肉芽组甥 2.2VEGF及整合素蛋白的表达 VEGF及p3整合素阳性细胞有巨噬细胞,淋巴细 胞,成纤维母细胞及少数血管内皮细胞,VEGF棕黄色 颗粒主要位于细胞浆内,口3整台素主要表达于细胞膜 上阳性细胞计数结果表明,在正常皮下组织及成熟 期肉芽组织中,VEGF及口3整台素呈低表达,而在增 殖期肉芽组织中表达明显增高(P<O.05),见附表 附裹不同组鳃中VEGF丑耶整台素裹选阳性蛔胞率{%,i?s 与正常皮下组织比较,*P<0.05.**P<001:与成熟期肉芽组 织比较-一P<0.05 3讨论 血管生成的基本过程包括血管内皮细胞(EC)的 激活,细胞外基质的降解,EC的增殖,移行,管腔结构 析;免疫组织化学染色以胞浆和/或胞膜有明确棕黄 色着色为阳性细胞,每张切片于着色明显处计数5个 高倍视野,计算阳性细胞率.结果采用完全随机化设 计均数的检验进行统计学处理. 2结果 2.1VEGF及略整合素mRNA的表达 VEGF有多种不同的mRNA拼接产物,本实验 选用引物可扩增出3种形式电泳结果表明,VEGF 可见3条扩增带,大小同预期设计一致(见图1).口3 整台素PCR产物为285bp,电泳显示300bp附近可 见明显扩增带,与预期一致(见图2) 图像定量结果表明,在增殖期肉芽组织中, VEGF及B3整合素水平高于成熟期肉芽组织(P< 0.05)及正常皮下组织(P<0.01). ?l234 图2不同组织中睦台紊mRNA的表选 3成熟期肉芽组织;4.正常皮下组织 形成及血管外膜的形成,迄今为止确切的机理尚不清 楚,生长因子及牯附分子在其中的作用逐渐成为研究 的热点VEGF是近年发现的功能最强大的血管生成 调节因子,可选择性作用于EC,直接促进EC的增殖, 还可以通过提高已有血管的通透性,使血浆蛋白渗人 基质,利于EC的移行,间接促进血管生成..研究表 明,VEGF与许多病理性血管生成密切相关.多种肿 瘤细胞高表达VEGF,可作为肿瘤预后的一个独立指 标目前已发现至少有2O种上的生长因子作用 于EC,大多是通过诱导VEGF表达而实现的,阻断 VEGF作用即可显着抑制血管的生长因此,VEGF 被认为是血管生成的重要始动因子.nv33是表达于 EC表面的整台素分子,介导EC与细胞外基质的粘 附,促进EC的移行用相应单抗阻断.vp3与细胞外 基质的结台后,可显着抑制血管生成,并可诱导p53基 因表达,促进EC的凋亡..肿瘤坏死因子及y一干扰 素也可通过抑制.vp3活性来抑制恶性黑色素瘤的血 中国普扑基础与临床杂志2001年11月第8卷第6期 ChinJBasesClinGeneralSurg,Vol8,No6,Nov2001 管生成.本实验结果也表明,在肉芽组织增殖期, VEGF和p3整台素mRNA及蛋白均呈高表达,EC生 长旺盛,借助与富含蛋白的细胞外基质的结合,形成大 量新生血管芽;在肉芽组织晚期,血管生成停止,早期 生成的血管也逐渐成熟,退化,VEGF及p3整台素的 表达也随之下降;正常皮下组织没有血管生成的条 件,VEGF及B3整合素几乎不表达.Goede等观察 子宫内膜周期变化中VEGF的表达,也得到类似结 果.因此,生理状态下血管生成受到严格调控.而在 病理情况下,如恶性肿瘤中,癌变的细胞表型发生了变 化,导致VEGF持续存在,使肿瘤的血管生成处于”失 控”状态,从而促进了肿瘤的生长和转移.VEGF及 B3整台素受控表达的机理有待进一步阐明,缺氧和某 些炎症因子可能参与了其中的调节. 本实验结果提示,局部的VEGF及B3整台素水 平增高可促进该部位的血管生成,提示临床可把二者 作为血管生成治疗的”靶分子”.应用VEGF治疗缺 血性疾病已进入临床试验..通过阻断VEGF和 avB3分子的作用抑制肿瘤生长,尚待进一步探索. 参考文献 1FolkmanJ.Ang~ogenesisincancer.va~eulRr,rheumatoidandother disease】l_NatureMed.1995;1(1)27 2TischerE,MitchellR,HartmartT.eta1.Thehurramgeneiorvascar eo【hdgrowthfactor.Multipleprotonformsareer~odedthe,ughal- ternativeexonsphdngJ).JBiulChem.1991{266(18):l1947 3FitzgeraldLA.SleinerB.Rausc,daI. Protein~quenceofendothel~l glycoproteinded,,edfromaeDNAdone;id~tifywithplatehtglyc~pro- teinandsi~lam/tointegrln儿JBiolChem,1987i262(9)3936 4ChomczynskiP,SacchiN.Singl~stepmethodofRNAisolationby acidguanidiniumthiocyanat~phenol-chloroformextractionnAnal Biochem,1987i162(1):156 5DvorakHF,BrownLF,DetmarM,”a1.Vascularpe~eahihey facroL/vascularendothelialgrowthfactor,microva,~cularhyperper meahillty,andartgiogenesis儿AmJPathoI.1995}146(5)1029 5HorakER,LeekR,KlenkN,etalAnglog~sis,ass~sedbyplatelet/ endotheticelladhesionmoleculeantibodi~indicatorolnodemet8is tasisandsurvivaI【nhr~st…rJ.Lancet,1992;340(8828):l120 7Br~ksFC.ClarkRA,Cher~hRequi~mentofvascularintL.gnn alphabeta3foraagiog~eslsJ.Selen~.1@94i264(5158);569 8GoedeV,SchmldtT,KimminaS,,a1.Analysiso1bloodvess~I r?turatlonprocessesduringcyclicovarianangiogenesisJlLahIn vest,199878(11):1385 9lsnerJM,Baumgarmerl,RauhG.etalTrat?t0fthrombo— gtitisohliterans(Buerger’sdisease)byintramusculargenetransfer .f,,B~cularendothelialgrowthfactor:preliminaryclinicalresults J..JVascSurg,1998}28(6)964 (2000—07-n收稿.2000一l】一23修回) (本文编辑刘桂英) ? 病例报告?【文章编号】1007-9424c2001】06—0380—01 克隆病误诊为腹腔结核2例报告 【中图分类号】RS74.62【文献标识码】E 刘宏业刘金成 病例l女,22岁,因腹痛,腹胀,频繁呕吐,停止排便排气 5天人院近4年腹部隐痛,腹泻,逐渐消瘦多次诊断为腹 腔结核行抗结核治疗;曾发生一次不完全性肠梗阻.经保守治 疗好转.查体:慢性消瘦病容,心肺均与其他急腹症相混 淆,造成误诊误浩率病主要症状为腹泻,腹痛,下消化道出血, 体重减轻,发热,结节性红斑等.其误诊原因:?对本病缺乏认 识,临床经验不足;?临床表现不典型,多种多样,轻重不一;? 忽略辅助检查,x线钡透及纤维肠镜检查.多能帮助明确诊断 (2001一O2-ZO牧稿) (本主编辑李缨来)