山莨菪碱、旋覆花素、苦碟子对过度训练大鼠肾细胞凋亡的影响

山莨菪碱、旋覆花素、苦碟子对过度训练大鼠肾细胞凋亡的影响 山莨菪碱、旋覆花素、苦碟子对过度训练大 鼠肾细胞凋亡的影响 中华麻醉学杂志2007年5月第27卷第5期ChinJAnesthesiol,May2007,Vol27,No.5 山莨菪碱,旋覆花素,苦碟子对过度训练大鼠 肾细胞凋亡的影响 吴广礼温进坤韩梅黄旭东容俊芳 【摘要】目的评价山莨菪碱,旋覆花素,苦碟子对过度训练大鼠肾细胞凋亡的影响.方法雄 性Wistar大鼠72只,体重200,220g,随机分为5组:正常对照组(C组,n=8),力竭对照组(E组,n= 16),山莨菪碱组(A组,n=16),旋覆花素组(IB组,n=16),苦碟子组(Is组,n=16).采用游泳至力竭 建立过度训练动物模型.A组于力竭前即刻腹腔注射山莨菪碱10mg/kg,IB组于力竭前24h及力竭 前即刻胃肠灌人旋覆花素25ml/kg,IS组于力竭前即刻腹腔注射苦碟子20ml/kg,力竭后6,24h处死 大鼠取肾脏标本,采用流式细胞术及TUNEL法检测肾细胞凋亡,并计算肾细胞凋亡率.结果与C 组比较,E组,A组,IB组和Is组力竭后6,24h肾细胞凋亡率升高(P<0.05或0.01);与E组比较,A 组,IB组和Is组力竭后6,24h肾细胞凋亡率降低(P<0.05).结论山莨菪碱,旋覆花素及苦碟子预 先给药可减轻过度训练诱发大鼠肾细胞凋亡. 【关键词】山莨菪碱;旋覆花;苦碟子;运动过度;肾脏;细胞凋亡 Effectsofanisoda?line.inulabritannicaandixerissonchifoliahanceOiltheovertraining—inducedrenalcell apoptosisinratsWUGuang-li,WENJin-kun,HANmei,eta1.DepartmentofB0ckmandMol ecular Biology,HebeiMedwalUniversity,Shijiazhuang050017,China 【Abstract】 ObjectiveToevaluatetheeffectsofanisodamine,inulabritannicaandixerissonchifoliahance onrenalcellapoptosisinducedbyovertraininginrats.MethodsSeventy— twoWismrratsweighing200—220gwere usedinthisstudy.Overtrainingwasinducedbyexhaustingswimming.Exhaustionwasdefinedas:(1)theanimal sanktothebottom>10Sduringswimming;(2)uncoordinatedswimmingand(3)theanimallostescape/righting reflexwhenplacedonthetable.Theanimalswererandomlydividedinto5groups:groupCcontrol(n=8), groupEexhaustion(n:16),groupAanisodamine(n=16),groupIBinulabritannica(n=16)andgroupIS ixerissonchifoliahance(n=16).IngroupAandISanisodamine10mg/kgandixerissonchifoliahance20ml/kg weregivenintraperitoneallyimmediatelybeforeexhaustingswimmingrespectively.IngroupIBinulabritannica25 ml/kgwas西 venorally24handimmediatelybeforeswimming.Theanimalswerekilledat6hand24hafter exhaustionseparately.ThekidneieswereobtainedfordeterminationofrenalcellapoptosisbyTUNELandflow cytometry.ResultsThepercentageofrenalapoptoticcellswassignificantlyincreasedingroupE,A,IBandIS ascomparedwithgroupCandwassignificantlyloweringroupA,IBandISthaningroupEat6hand24hafter exhaustion.ConclusionPretreatmentwithanisodamine,inulabritannicaandixerissonchifoliahancecan attenuaterenalcellapoptosisinexhaustedrats. 【Keywords】 Anisodamine;Inulajaponica;Ixerissonchifolia;Hyperkinesis;Kidney;Apoptosis 过度训练可引起急性肾损伤,而临床上对其尚 缺乏有效的防治措施.本课题组的研究表明,肾组 基金项目:军队"十一五"医药卫生科研基金资助项目 (06MA071) 作者单位:050017石家庄市,河北医科大学基础医学院生物化 学和分子生物学研究室(吴广礼,温进坤,韩梅);白求恩国际和平医 院肾脏病科(黄旭东);河北省人民医院(容俊芳) 463 ? 重症医学? 织细胞凋亡既是过度训练诱发急性肾损伤的特征, 也是其发生的原因和药物作用靶点.山莨菪碱具 有解痉,改善微循环的作用,对缺血性急性肾功能衰 竭有防治作用.旋覆花素是中药旋覆花的有效成 分,它可通过抗炎作用降低细胞凋亡.苦碟子具 有清除自由基抗氧化作用,对缺血再灌注损伤有防 治作用.然而,上述三种药物对过度训练致大鼠 肾细胞凋亡的影响有待进一步探讨.本研究拟探讨 中华麻醉学杂志2007年5月第27卷第5期ChinJAnesthesio!,May2007,Vol27,No.5 山莨菪碱,旋覆花素及苦碟子对过度训练大鼠肾组 织细胞凋亡的影响,为防治过度训练对机体损伤提 供参考. 材料与方法 实验动物及分组雄性Wistar大鼠72只,体重 200220g,由河北医科大学实验动物中心提供,动 物生产许可证号为:SCXK(冀)2003.1.003.随机分 为5组:正常对照组(C组,n=8),力竭对照组(E 组,n=16),山莨菪碱组(A组,n=16),旋覆花素组 (IB组,n=16)和苦碟子组(Is组,n=16).C组未 进行力竭运动,A组于力竭运动前即刻腹腔注射山 莨菪碱(批号:0409202,杭州民生药业集团有限公 司)10mg/kg,IB组于力竭运动前24h,即刻1:3腔灌入 旋覆花素(河北医科大学药学院药理研究室提供)25 ml/kg;IS组于力竭运动前即刻腹腔注射苦碟子(批 号:20025449,沈阳双鼎制药有限公司)20ml/kg. 过度训练动物模型的建立参照文献[1]的方 法自制150cm×60cm×80cm玻璃钢游泳池.采用 大鼠游泳至力竭建立过度训练大鼠急性肾损伤模型 (单次力竭不加负重,水深70cm,水温28,32?). 力竭…:1.沉入水底超过10s;2.游泳动作明 显不协调;3.捞出后没有逃避反应,且放在平面上 无法完成翻正反射. 观察指标及方法E组,A组,IB组及IS组于 力竭后6,24h各组随机选取8只大鼠,而c组于力 竭运动前,乙醚麻醉后,腹正中切开,摘取双肾,纵形 剖开,一半置入4?4%多聚甲醛中固定,另一半置 于一80?冻存待用.标本于4%多聚甲醛中固定2 h后,常规梯度浓度酒精脱水,二甲苯透明,常规石 蜡包埋,连续切片6,8张,厚度4m,用涂有多聚赖 氨酸的载玻片贴片,52?烘烤48h,备用.采用 TUNEL法(试剂盒由德国Boehringer公司提供)原位 检测各组大鼠肾细胞凋亡,凋亡细胞的细胞核内 DNA特异3末端被特殊标记,呈棕褐色染色,核呈 圆形或椭圆形,而正常细胞和坏死细胞的细胞核由 苏木素染成蓝紫色;应用CMIAS病理图像仪 (北航图象中心研制)测定凋亡细胞的平均光密度并 计算肾细胞凋亡率.将固定的肾组织放在120目不 锈钢网上,下置一平皿,用眼科剪刀将组织剪碎,用 眼科镊子轻揉组织块并用生理盐水冲洗,直到将组 织揉完为止.将平皿中的混悬液用300目尼龙网过 滤去除细胞团块,收集细胞悬液,以500,800r/min 离心沉淀2min,取0.1mt,加入10%鸡血细胞作为 内参标准,与样品同步染色,加入碘化丙啶(PI)50 ttg/ml(Sigma公司,美国)1ml,在4?冰箱染色30 min,以500目铜网过滤,制成单细胞悬液,用Epics. XL11型流式细胞仪(BeckmanCoulter公司,美国)进 行流式荧光数据分析,用MuticycleAV分析软件对 DNA细胞周期拟合分析得出细胞凋亡率. 应用SPSS12.0软件包进行统计学分析,计量资 料以均数?标准差(?s)表示,组间比较采用单因 素方差分析,P<0.05为差异有统计学意义. 结果 TUNEL法原位检测肾细胞凋亡的比较c组肾 组织未见明显的凋亡细胞,见图1;E组力竭后6h 大鼠肾组织凋亡细胞数增多,24h大鼠肾组织皮质, 髓质交界处及髓质可见大量散在或片状分布的凋亡 细胞,多位于肾小管和集合管,见图2,3;A组,IB组 和IS组大鼠于力竭后6,24h肾组织凋亡细胞数明 显减少,见图4,6. 图1C组光镜下肾组织TUNEL染色结果(×4oo) 图2E组力竭后6h光镜F肾组织TUNEL染色结果 (×4oo) TUNEL法原位检测肾组织细胞凋亡率的比较 与C组比较,E组,A组,IB组和IS组力竭后6, 24h肾细胞凋亡率均升高(P<0.05或0.01);与E 组比较,A组,IB组和Is组力竭后6,24h肾细胞凋 中华麻醉学杂志2007年5月第27卷第5期ChinJAnesthesiol,May2007,vo!. 图3E组力竭后24h光镜下肾组织TUNEL染色结果 (×4oo) 图4A组力竭后24h光镜下肾组织TUNEL染色结果 (×4OO) 图5IB组力竭后24h光镜下肾组织TUNEL染色结果 (×400) 亡率降低(P<0.05),见表1. 流式细胞术检测肾组织细胞凋亡率的比较与 C组比较,E组,A组,IB组和Is组力竭后6,24h肾 组织细胞凋亡率增高(P<0.05或0.01);与E组比 较,A组,IB组和Is组大鼠于力竭后6,24h肾细胞 凋亡率均降低(P<0.05),见表1. 讨论 过度训练可引起肾功能障碍和肾组织结构的损 465 图6IS组力竭后24h光镜下肾组织TUNEL染色结果 (×400) 表1各组各时点肾组织细胞调亡率的比较(n=8,?s) 与C组比较,P<0.05P<0.01与E组比较,P<0.05 伤,肾功能障碍表现为肾小球滤过率的降低,这种 变化于力竭后6h达高峰,力竭后24h恢复到正常 水平;而肾组织结构的损伤则以细胞凋亡为主体,其 变化于力竭后即刻,6,24h呈进行性增高,说明肾细 胞凋亡在力竭后延迟性肾损伤中发挥重要作用…. 因此,本研究以力竭后6,24h作为时点,观察山莨 菪碱,旋覆花素和苦碟子对力竭后大鼠肾组织细胞 凋亡的影响. 为保证检测结果的可靠性,本研究又从定性和 定量两个方面.采用多种方法检测了肾细胞凋亡的 情况.TUNEL法利用凋亡细胞在核酸内切酶的作 用下,DNA断裂产生粘性末端的原理,用外源修饰 化的核苷酸对这些断裂的DNA3末端用原位切口 平移法或原位末端标记法标记,进行定性,再用免疫 学的方法对凋亡细胞进行定量,定位测定,并应用图 像分析仪进行定量分析凋亡情况.流式细胞术是根 据凋亡时细胞核的特征性,用染色体荧光染料对经 固定的凋亡细胞进行染色,利用凋亡细胞DNA可染 性降低的特性,通过流式细胞分析,结合凋亡细胞 DNA倍体分析软件,可得出凋亡细胞发生率.本研 中华麻醉学杂志2007年5月第27卷第5期ChinJAnesthesiol,May2007,Vol27,No.5 究在形态学观察和原位检测肾细胞凋亡的基础上, 采用流式细胞术对力竭后大鼠肾组织细胞凋亡进行 了定量检测,结果一致,证实了检测结果的可靠性. 为探讨山莨菪碱,旋覆花素和苦碟子的药理作 用并寻求过度训练致肾损伤的防治措施,本研究参 照人体剂量,参考文献[2,7,8]及预实验的给药途径 和剂量,观察了上述3种药物对过度训练致大鼠肾 细胞凋亡的影响.本研究结果表明,预先应用山莨 菪碱,旋覆花素及苦碟子后均能明显地减少力竭大 鼠肾细胞凋亡,从而减轻过度训练引起的肾损伤. 山莨菪碱为天然植物,人工合成品属抗乙酰胆 碱药,具有多种药理作用,对运动性肾缺血及运动后 血液再灌注的肾脏有保护作用,其机制可能为:拮抗 多巴胺受体,抑制肾内血管痉挛,扩张肾小球前血 管,增加肾小球血流量;降低缺血性肾组织细胞钙 超载及细胞间三磷酸肌醇水平;下调IL.6的表 达…. 旋覆花为菊科旋覆花属植物,是传统中药,具有 降气,消痰,行水,止呕等功效.旋覆花属植物中主 要的化学成分为萜类化合物,黄酮类化合物及有机 酸类化合物等,具有活血化瘀的作用.有关分子药 理学研究表明,从旋覆花中提取的3种酰化类黄酮 苷,加上已知的类黄酮共8种成分均有很强的抗氧 化活性H.旋覆花的活性成分二氢棉菊素,一方面 可直接抑制NF.xB的活性,另一方面还可阻断I.相 的降解,进而抑制NF.xB的核易位,这些变化使 iNOS和COX.2基因表达受到抑制,而iNOS和COX.2 表达在炎症信号转导通路中具有重要的作用,说明 其具有明显的抗炎作用?.Han等的研究表明, 旋覆花的活性成分Acetylbritannilatone(ABL)不仅可 抑制IX'S/IFN.了介导的NO合成及iNOS的表达,而 且还以浓度依赖的方式降低LPS/IFN.7引起的PGE2 生成和COX.2表达;另外ABL还通过阻断NF.xB与 靶基因的结合,抑制iNOS和COX.2表达,进而抑制 了NO和PGE2合成. 苦碟子(抱茎苦荚菜)全草是菊科2年生草本植 物,为菊科苦荚菜属,分布于我国东北及内蒙古等 地,具有多种药理作用.苦碟子注射液是提取苦碟 子全草有效成分精制而成的中药注射剂,经生药学 及分子药理学实验证明其多种化学成分主要有腺 苷,黄酮类,倍半萜内酯类及三萜皂苷类化合物, 具有活血化瘀及清除自由基抗氧化作用.Lu等 在细胞水平也证实从苦碟子中提取的6种类黄酮成 分均可抑制过氧化物的产生. 综上所述,山莨菪碱,旋覆花素及苦碟子预先给 药可减少过度训练致力竭大鼠肾细胞凋亡,对过度 训练致急性肾损伤起到一定的预防作用. 参考文献 1吴广礼,温进坤,韩梅,等.山莨菪碱对过度训练大鼠急性肾损伤 的保护作用.中国微循环,2006,10:241.244. 2吴广礼,郑秋月,田牛.山莨菪碱,东莨菪碱,樟柳碱对急性肾衰大 鼠肾微血管损伤的保护作用.微循环学杂志,2002,12:6-8. 3JinHZ,LeeD,LeeJH,eta1.NewsesquiterpenedimersfromInula britannicainhibitNF-kappaBactivationandNOandTNF—alpha productioninLPS—stimulatedRAW264,7ceils.PlantaMed,2006,72: 40.45. 4KimSR,ParkMJ,LeeMK,eta1.FlavonidsofInulabritannicaprotect culturedcorticalcellsfromnecroticcelldeathinducedbyglutamate.Free RadicBiolMed,2002,32:596—604. 5ParkEJ,KimY,KimJ.Acylatedflavonolglycosidesfromtheflowerof Inulabritannica.JNatProd2000,63:34—36. 6袁汀,刘蕊,黄晓玲.苦碟子研究进展.实用药物与临床,2004, 7:101.103. 7陈志勇,廖立生,张风.山莨菪碱对毒蕈所致大鼠急性肾损伤的 保护作用.肾脏病与透析肾移植杂志,1995,4:240.244. 8于兆安,于首元,胡文平,等.苦碟子注射液对急性心肌梗死患者 心肌保护作用的临床观察.中华老年心脑血管病杂志,2005,7: 27.29. 9HuangC,ZhangY,ZhangZ.Thesignificanceofuseofanti—intrarenal arteryspasminrenalallogr~ftswithHARlikemanifestation.ZhongllHa WaiKeZaZhi,1997,35:530—532. 10LiuX,ZhangJ.Anexperimentalstudyonthemechanismofanisodamini hydrobromidumintreatingacuteischemicrenalfailure.JTon~iMed Univ,1998,18:187—189. 1lHeemannU,SzaboA,HamarP,eta1.Lipopolysaccharidepretreatment protectsfromrenalischemia/reperfusioninjury:possibleconnecriontoan interleukin一6-dependentpathway.AmJPathol,2000,156:287—293. 12SongYJ,LeeDY,KimSN,eta1.Apoptoticpotentialofsesquiterpene lactoneergolidethroushtheinhibitionofNF—kappaBsignalingpathway.J PharmPhammcol,2005,57:1591—1597. 13HanM,WenJK,ZhengB,eta1.AcetylbritannilatonesuppressesNO andPGE2synthesisinRAW264.7macrophagesthroughtheinhibitionof iNOSandCOX一2geneexpression.LifeSci,2004,75:675—684. 14LuJ,FangX,SunQ,eta1.Effectofsixflavonoidcompoundsfrom Ixerissonchifoliaonstimulus—inducedsuperoxidegenerationandtyrosyl phosphorylationinhumanneutrophils.ClinChimActa,2002,316(1— 2):95.99. (收稿日期:200610.20) (本文编辑:彭云水)