山羊小腔卵泡卵母细胞的体外成熟

山羊小腔卵泡卵母细胞的体外成熟 山羊小腔卵泡卵母细胞的体外成熟 6,67 第21卷第2期 1998年4月 河北农业大学 JournalofAgriculturalUniversityofHebei V01.21No.2 Apr1998 山羊小腔卵泡卵母细胞的体外成熟 李勇 (1河北农业学动物科技学院,保定071001;2西北农业大学动物医学系,杨陵712102) 摘要将小腔卵泡卵母细胞置干台有颗粒细胞并用20mMHepes缓冲的?TCM199{15% GS,"I'CM199+15%GS+long-蜘LFSH+IOrzgmLLH+1mLI7p,TCM199+ l5%GS+IUJJgmLF刚+lO.ugsmLLH+1.ugmLl7口一Ez4ITS(5r~gmLInsulin,5唱mL Transferri~,5rigmLYx~dimn~'lenite中培养26,28h,其成熟率舟别为l935%(631), 2653%(2698),29.45%(43'I46).结果表明:山羊小腔卵泡卵母细胞在TCMI99中可以成 熟,促睦腺激素及生长因子的灞加有助干卵母细胞成熟= 关键词小胜卵泡;卵母细胞;傩外成翘;山羊 中图分类号靖27.3,靖l4.亘一 目前卵母细胞体外成熟的研究,大多局限于采集卵巢表面,直径大于2mm的大腔卵泡 卵母细胞,极大限制了对卵巢卵母细胞的利用.如何合理开发利用卵巢卯泡资源,成为急待 解决的问题.近年来.对小腔卵泡和腔前卵泡卵母细胞体外成熟和体外受精的研究 已受到 越来越多的注意Tsafriri等人(1975年)体外培养猪的1,2mm卵泡卵母细胞,获得15% -- 25%的成熟率lI1.Motlik等(1984年)发现,将直径为0.8,1.6mm,17,2.2mm的卵泡 卵母细胞体外培养48h后,卵母细胞成熟率分别为17.3%和50%E2].Arlotto等(1990年) 认为,牛卵母细胞成熟及其受精卵的发育能力受卵泡大小影响,直径小于2mm卵泡卵母细 胞体外成熟和发育能力极低l3一.综上所述,猪和牛卵泡在其腔体形成的早期阶段,卵母细 ? 胞成熟能力和发育能力均很低.有关羊小腔卵泡卵母细胞的研究较少.Moor等(1997 年)对不同大小的绵羊卵泡卵母细胞成熟及发育能力进行对比,直径2--3ram和3,5mm的 卵泡母细胞成熟率分别为19%和73%l41.Smedt等(1992年)提出,直径大于2mm的山羊 卵泡卵母细胞才具备完成减数分裂的能力l5J.本试验旨在建立山羊小腔卵泡卵母细胞的 采集和培养,以期建立较为合理的小腔卵泡卵母细胞的体外成熟体系. 1材料和方法 1.1卵巢来源与处理 卵巢采自屠宰场.关中奶山羊屠宰剖腹后,立即无菌采集卵巢,除去大型卵泡(直径大 于6mm)和多余脂肪组织后,迅速置于灭菌生理盐水中,尽快运回实验室. ? 奉研究属国家自然科学基仝项日并受农业部生物技术项目的资助 刘素娟女.29岁.讲师,目前从事哺乳动物胚胎工程领域的教学与科研工作 199"/一05—30收藕 第2期刘素娟等:山羊小腔卵泡卵母细胞的体外成熟67 1.2小腔卵泡卵母细胞的采集与成熟培养 用抽吸法抽吸卵巢上直径为2--6mm卵泡卵母细胞后,将卵巢从门部纵切为两半,去除 黄体组织和髓质,平铺于装有10mLPBS液的培养皿中,以1.5Tnrn间距的切割刀纵横切割. 选择卵丘细胞层较为完整且致密的卵母细胞,用含有颗粒细胞并用20mMHepes(I-海生化 试剂店进口分装)缓冲的?删199(sIGMA公司)+15%GS(自制),?TCM199+15%GS +10/~g/mLFSH(中国科学院动物所,940401)+10vg/mLLH(中国科学院动物所,940503) +lvg/mL17(SERVA公司),?TCM199+15%GS+10/Lg/mLFSH+10vg/mLLH+ 1/Lg/mL17p—+ITS(德国)成熟培养液洗涤2--3次后,在5%O,38.5?,饱和湿度的 培养条件下培养,观察统计其成熟情况. 1.3统计学处理 采用卡方检验对试验数据进行统计学处理. 2结果 2.1保存温度对卵母细胞成熟率的影响 卵巢采集后分别在25,29"C,35-3812灭菌生理盐水中保存.运回实验室后,在相应 温度下回收小腔卵泡卵母细胞,并在成熟液?中培养,卵母细胞成熟结果见表1 衰I保存噩度对卵母细胞成蕉率的影响 Tab.IIrdluenceo/Trans~6onT~nperature?G?tCbceIVM 注:a:b.P>0.05 由表1可见,两组温度对卵母细胞成熟率的影响无显着差异(P>O.05). 2.2血清类型和激素对卵母细胞成熟率的影响 小腔卵泡卵母细胞复合体,分别于培养液?,?,?及TCM199+15%NCS+10vg/mL FSH+10vg/mLLH+lvg/mL1邗一中培养,结果见表2. 衰2血清类型和澈素对小腔卵泡卵母细胞体外成蕉的影响 Tab.2EffectofSeramadH.tonGoatMatu~tlonInVitro 注a.b.a:c_b:c.b:d.P均>O.05. 添加激素(2,3组)与不添加激素(1组)相比,成熟率无显着差异(P>O.05),2组和3组 的结果好于1组.由2组和4组结果可以看出,添加GS和NCS两组间成熟率差异不显着 (P>O.05). 68河北农业大学第21卷 2.3小脏卵泡卵母细胞培养时间对成熟率的影响 小腔卵泡卵母细胞培养24-26h,26--28h,28--30h的成熟情况见表6.三组间差异不 显着(P>0.05),成熟率以培养26-28h最高(24.87%). 裹3培养时间对卵母细胞成熟率的影响 Tab.3EffectionotCulturePeriodonGoatOacyte1VM 3讨论 哺乳动物卵母细胞成熟要经过生长期和细胞质,细胞核为受精做准备的时期.已经证 实,啮齿类动物卵母细胞在卵泡腔形成之前即在体外完成生长,并获得继续成熟的能 力L6,7J.猪,牛绵羊等动物1--2mm卵泡卵母细胞体外成熟率不高H0J.本试验对山羊l -- 2mm卵泡卵母细胞进行体外培养,获26.61%的成熟率,此结果高于Srnede等(1992年) 的同类研究结果(17%)J. 大量研究已经证实,促性腺激素和雕激素对卵母细胞成熟具有促进作用.本试验在 卵 母细胞成熟体系中,添加FSH,LH,17t3一E2,与不添加激素组比,提高了7.18%;FSH,LH 和178一Fa有助于山羊小腔卵泡卵母细胞体外成熟.胰岛素样生长因子(IGFs)对卵母细胞 成熟具有促进作用L8,9J.本试验在小腔卵泡卵母细胞成熟培养时,除添加激素外,还添加了 ITS复合物,结果与单纯添加激素相比,卵母细胞成熟率间无显着差异,这与Herder等 (1992年)的报导不一致J,推测可能是胰岛素与IGF,之间的差异造成的.IGF_一I对卵母 细胞体外成熟的影响在猪,牛已有研究_8,但在山羊上未见报导,值得进一步探讨. 本试验发现,添加山羊血清可提高卵母细胞体外成熟率.山羊血清采自发情开始后的 第1,2天的山羊,其内含有一定量的内源性激素,属同种动物血清,这是添加山羊血清的优 点. 除了上述因素影响卵母细胞成熟外,推测还有若干其它因素影响了卵母细胞成熟率,如 卵巢运送时间及保存条件等,山羊卵泡卵母细胞对温度的刺激似乎比牛更敏感.本试验还 证实,山羊小腔卵泡卵母细胞的体外培养时问以26--28h为佳,延长培养时间,成熟率并无 明显增加. 参考文献 1T~Ml'iriA,CkannagCP.Influenceoffollicularmaturationandcultureconditionsontheme kzlsofpig ??invitroJRFeat,1975,43:149,l52 2MotlikJ,CrceetN,FulkaJ.Mefioticcorapet~mceinvitroofpigoocytesisolatedfromearlya ntralfolliclesJ RepmdFeat.1984,72:323,328 3.aakamTM,Leibfried— l~aedgeML,FirstNL.Nzedlstrib~tlonandmeioticcompetenceofbovinen ry?吲?fromtwolocariomintheovol'y.~endogy,1990,33(1):188 第2期刘素娟等:山羊小腔卵泡卵母细胞的体外成熟 4Mccr,Tmumon.Hormomlandfollicularhctorsafftingmaturationofsheepoocymsinvltmandthdrsub— sequentdevelopmentalcapacityJReproaFeat,1977,49;101--109 5~'nedtVD,CrozetNM,Ahmed-AliMa1.Invitromaturationandfertilizationofgt~ttoocytesTheri— ogenology,1992,37:1049,lo60 6日 JJ,SehtoederAC.CapacityofmouseooeytesIXe~tralfolliclestoundePgoembryogeneslsandde— velopmenttoliveyoungaftergrowthmattLrationandfertilizationinvitro.BidReprod,1989,41:268~276 7~sarlAJ,Daniel,ArmstrongDTeta1.GrowthanddevelopmentofratoocytesinvltmGameteResearch, l989.24:109,121r 8HarlOtKM,BrackettBG.Enhancedbovloecocytequalityafterinvitromaturation(IVM)withInsulin— llkegrowthfactca'-I(IGF-I)andgonadotro0insBidReprod,1992,46(supp1):67 9Herrle~A,Luoas-HahnA,NiemarmH.Effectsofinadin-likefactca'-Ioninvltmproductionof bovineembryos.Theriogenokgy.1992.37:1213,1224 10HsuCJ,HammondJM.&mdotI1sand?didstimulateinsulin—likegrowthfactca'-I l~roduetionbyProcinegranulosacellinvitro.Endocrinology,1987,120:198207 11HazdegNL,HillDJ.RB,WaltonJSRelationshipofmo~hot.yandfollicularfluidenvi— rtmmealtofbovinecocytestOtheirdeveloI~entalPotentialinVitro.Tberiogemokgyt1995,4 3:509--522 (编辑:澹台炳琰) InVitroMaturationofGoatSmallAntralFollicularOocytes LiuSuiuanZlnangLi (18ehodofAn~alHusbanclaryandVeterinaryMedidne,HebeiAmi?Univ— BatMing071001) (2D申t.ofVeterinaryMedicine,NorthwesternAm1.Uuiv.,Yangling712100) Al~metSmallantralfollicularo0cyteswereculturedin20mMHepesbuffeted,?删199 +15%Gs;?删l99+15%GS+10~g/mLFSH+10~g/mLLH+l~g/mL1713一E2,@ ,工?Ml99+15%GS+10~g/mLFSH+lO~g/mLLH+1~g/mL1713一+ITS(5~g/mLtn— sulin,5~g/mLTransferrin,5ng/mLSodimnSelenite)for26,28kHIIs.1ematurationrates weRl9.35%(6/31),26.53%(26/98),29.45%(43/146)respectively.rnresultsshoweel goat?.IaUantralfollicularoocytescould1Tlatureinthemeelimnof1? M199.Theo(~ytematu— rationcouldbedevelopedtoaddgonadotmpinandgrowthfactorsintothematuredmedium. KeywordsSinaiIantralfollicle;(~cyte;Invitromaturation;Goat